全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊怨冤院员缘远苑 耀 员缘苑缘允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员猿鄄员园鄄猿员摇 接受日期院圆园员源鄄园源鄄圆苑
基金项目院转基因生物新品种培育科技重大专项渊圆园员源圆载园愿园园源 原 园园源月冤袁河北省科技支撑计划渊员员圆圆园员园苑阅冤袁河北省自然基金渊悦圆园员源源园苑园缘员冤
作者简介院李桂兰袁女袁教授袁主要从事植物分子生物学与基因工程研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 造早造远猿 岳 员圆远援 糟燥皂
通讯作者院乔亚科袁男袁教授袁主要从事大豆育种及遗传资源研究遥 耘鄄皂葬蚤造院择蚤葬燥赠葬噪藻岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园怨鄄员缘远苑鄄园怨
共培养条件对农杆菌转化大豆子叶节的影响
李桂兰员 摇 刘晨光员 摇 乔摇 潇圆 摇 杨晓倩员 摇 王摇 迪员 摇 乔亚科员
渊员 河北科技师范学院生命科技学院袁河北 昌黎摇 园远远远园园曰 圆 河北科技师范学院物理系袁河北 秦皇岛摇 园远远园园源冤
摘摇 要院为提高大豆的遗传转化效率袁利用根癌农杆菌对大豆成熟种子的子叶节进行遗传转化袁从影响农
杆菌和大豆子叶节外植体双方的因素出发袁重点研究共培养阶段培养基的 责匀值尧光照条件和共培养时
间三个因素对转化的影响袁以寻找适宜农杆菌和外植体的平衡点遥 分析单因素试验和正交试验的研究
结果表明袁在共培养阶段袁培养基 责匀值适宜范围为 远郾 园 耀 远郾 远袁 责匀 值以 远郾 远 为佳曰提供 员园 耀 员远澡窑凿 原员光
照均提高了转化效率袁与完全黑暗差异显著曰延长共培养时间显著提高转化效率袁以 苑 耀 员园凿为宜遥 本研
究范围内以冀豆 员圆尧豫豆 圆圆 和秦黄小粒 员圆 三个基因型大豆获得了较高转化效率袁 供试的 远 个大豆品
种均获得了转基因植株袁 孕悦砸 和 杂燥怎贼澡藻则灶 分析表明植酸酶基因 责澡赠粤 基因已经整合到大豆基因组中遥
该结果对提高大豆的遗传转化效率有重要参考价值遥
关键词院农杆菌曰大豆子叶节曰共培养基 责匀值曰共培养时间曰共培养光照
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园怨援 员缘远苑
摇 摇 自从 匀蚤灶糟澡藻藻等咱员暂以大豆子叶节为外植体应用农
杆菌介导法获得大豆转基因植株袁在以器官再生途径
为基础的大豆转化体系中袁子叶节至今是最常用的外
植体咱圆暂 遥 众多研究者利用子叶节获得了转基因植株袁
并在 匀蚤灶糟澡藻藻等的方法基础上对影响转化效率的因素
进行了大量研究遥 研究者们相继在大豆基因型尧农杆
菌菌株和 栽蚤 质粒尧外植体类型尧共培养基中酚类化合
物和抗氧化剂种类及转化时合适的筛选剂等各种技术
性环节进行了探索袁每个试验研究的转化效率都有所
提高咱猿 原 远暂 袁但是农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化效
率至今仍没有取得很大突破遥 在农杆菌介导大豆子叶
节遗传转化操作过程中袁浸染和共培养这 圆 个步骤是
农杆菌粘附在外植体表面和外源基因进入植物细胞及
整合到植物基因组的过程袁因此对转化率起决定作用遥
这 圆 个步骤要求合适的浸染时间尧浸染液浓度尧共培养
的时间尧温度和合适的共培养基成分等咱圆暂 遥 子叶节系
统目前通常采用的侵染时间一般在 员园 耀 猿园皂蚤灶袁侵染
农杆菌液浓度在 韵阅远园园 越 园郾 猿 耀 员郾 园曰共培养基的 责匀 值
为 缘郾 源袁共培养温度为 圆圆 耀 圆源益袁完全黑暗袁共培养时
间为 猿凿袁转化效率低袁而且不稳定咱苑 原 愿暂 遥 子叶节细胞
的转化效率低袁再生转化细胞和再生芽的无效选择袁重
复性很差袁植株再生困难等仍然是该系统的瓶颈咱怨暂 遥
本研究在大豆苗的培养尧农杆菌浸染尧共培养时间
及筛选模式方面进行了大豆子叶节转化系统初步优
化咱员园暂 遥 共培养阶段是农杆菌完成转化的关键阶段袁影
响因素较多遥 本文选择共培养阶段的光照尧培养基 责匀
值尧共培养时间 猿 个因素从农杆菌和外植体双方出发
对转化效率的影响进一步的研究袁 以期对提高农杆菌
转化大豆子叶的效率有所突破遥
员摇 材料方法
员郾 员摇 材料
大豆品种院秦黄小粒 员园 和秦黄小粒 员圆渊河北科技
师范学院冤袁冀豆 苑尧冀豆 员圆尧冀黄 员猿 和冀豆 员苑渊河北
省农林科学院粮油作物所冤袁豫豆 圆圆渊河南省农业科学
院冤遥
工程菌院农杆菌 耘匀粤员园缘袁其带有植物表达载体
责孕悦鄄运杂粤为河北科技师范学院植物细胞工程实验室
构建咱员员暂 袁该质粒带有拟南芥黑芥子酶基因 责赠噪员园 启动
苑远缘员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
子袁胡萝卜外展蛋白信号肽编码序列袁无花果曲霉植酸
酶基因 责澡赠粤渊郧藻灶月葬灶噪 注册号为院粤云缘猿苑猿源源冤 咱员圆暂 袁选择
标记基因 晕孕栽陨陨遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 外植体制备摇 大豆种子用氯气消毒袁接种于萌
发培养基上袁源 耀 缘 凿 后袁以子叶变绿种皮没有破开为
宜袁去除种皮袁保留 圆 耀 猿 皂皂 的下胚轴袁沿 圆 片子叶中
间纵切袁将 圆 片子叶分开袁切去顶芽和初生芽袁再用刀
尖在子叶节处轻轻划 缘 耀 远 刀袁获得子叶节外植体遥
员郾 圆郾 圆摇 菌液的准备摇 挑取单菌落接种到 蕴月 液体培
养基中袁圆苑益培养至 韵阅远园园为 园郾 远 耀 园郾 愿袁转入新鲜的
蕴月培养基中渊含 圆园 滋皂燥造窑蕴 原员的乙酰丁香酮冤袁培养至
韵阅远园园达到 园郾 猿 耀 园郾 缘 时袁缘 园园园 则窑皂蚤灶 原员袁源益离心 员园皂蚤灶袁菌体重悬于和大豆不定芽诱导培养基营养成分相
同的液体培养基中袁调到 韵阅远园园为 园郾 猿 耀 园郾 缘袁加入乙酰
丁香酮至终浓度 员园园 滋皂燥造窑蕴 原员遥
表 员摇 正交试验因素与水平
栽葬遭造藻 员摇 韵则贼澡燥早燥灶葬造 贼藻泽贼 凿藻泽蚤早灶
水平
蕴藻增藻造
因素 云葬糟贼燥则泽
品种渊粤冤
灾葬则蚤藻贼赠
共培养光照渊月冤
悦燥鄄糟怎造贼怎则藻 蚤造造怎皂蚤灶葬贼蚤燥灶 凿怎则葬贼蚤燥灶 辕 渊澡窑凿 原员 冤
共培养天数渊悦冤
悦燥鄄糟怎造贼怎则藻 凿怎则葬贼蚤燥灶 辕 凿
员 秦黄小粒 员圆 耶匝蚤灶澡怎葬灶早曾蚤葬燥造蚤 员圆爷 园 猿
圆 冀豆 员圆 耶允蚤凿燥怎 员圆爷 员园 苑
猿 豫豆 圆圆 耶再怎凿燥怎 圆圆爷 员远 员园
员郾 圆郾 猿 摇 共培养 摇 以共培养基 责匀 值 缘郾 源尧在黑暗和
圆源益条件下培养 猿凿 为基本的共培养条件遥 本研究在
共培养阶段分别设计 猿 个单因素试验院渊员冤共培养基
责匀值试验院设置 源 种共培养基 责匀 值处理院责匀 值分别
为 缘郾 源尧远郾 园尧远郾 远尧苑郾 圆曰渊圆冤共培养时间试验院设置 源 个
处理院共培养时间分别为 猿尧苑尧员园尧员源凿曰渊猿冤共培养阶段
光照试验院以 圆源 小时为周期设置 源 个不同长度光照时
间处理院 园尧 员园尧 员远尧 圆源澡窑凿 原员袁光照强度为 猿 园园园 耀
源 园园园蕴载遥每个试验重复 猿 次袁每个处理接种子叶节外
植体 员园园 个遥
员郾 圆郾 源摇 植株再生摇 对共培养后的外植体脱菌后袁接种
于含有卡那霉素筛选剂渊员园园皂早窑蕴 原员 冤和抑菌剂渊圆缘园
皂早窑蕴 原员头孢霉素和 圆缘园皂早窑蕴 原员羧苄青霉素冤的不定芽
诱导培养基上袁于 圆源 耀 圆远益尧员远 澡 光照 辕 愿 澡 黑暗条件
下培养袁员缘 凿继代 员 次遥 当芽生长到 员 糟皂 时袁转入伸
长培养基袁待抗性芽伸长 猿 耀 源糟皂袁从子叶上切下袁转入
不含筛选剂仅含抑菌剂的生根培养基中袁根系长出 源
耀 远糟皂袁再生苗生长健壮后袁移栽到营养土中遥
员郾 圆郾 缘摇 孕悦砸检测摇 取卡那霉素抗性再生植株的叶片袁
杂阅杂方法提取大豆基因组 阅晕粤袁扩增无花果曲霉植酸
酶基因 责澡赠粤遥 上游引物院缘忆 原粤栽郧栽悦栽粤郧粤悦栽郧郧悦粤郧栽悦
悦悦悦郧悦悦栽悦郧粤郧粤 原猿忆袁下游引物院缘忆 原悦栽粤郧郧栽粤悦悦悦栽粤
粤郧悦粤粤粤粤悦粤悦栽悦悦郧悦悦悦粤粤栽悦 原 猿忆遥 其扩增产物长度
为 苑缘园遭责遥 孕悦砸 反应体系渊缘园 滋蕴冤院大豆基因组 阅晕粤
员园园 灶早袁凿晕栽孕 圆园园 滋皂燥造窑蕴 原员袁上游尧下游引物终浓度 员
滋皂燥造窑蕴 原员袁栽葬择 阅晕粤聚合酶 圆 哉遥 反应参数院怨源益预变
性 缘 皂蚤灶曰进入循环袁怨源益变性 员皂蚤灶袁缘缘益退火 员 皂蚤灶袁
苑圆益延伸 员郾 缘 皂蚤灶袁猿园 个循环曰苑圆益最后延伸 员园 皂蚤灶遥
扩增产物于 园郾 愿豫琼脂糖凝胶电泳袁凝胶成像系统照
相遥
员郾 圆郾 远摇 杂燥怎贼澡藻则灶 斑点杂交 摇 杂交按照 砸燥糟澡藻 试剂盒
野阅蚤早 匀蚤早澡 孕则蚤皂藻 阅晕粤 蕴葬遭藻造蚤灶早 葬灶凿 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 杂贼葬则贼藻则
运蚤贼造冶说明书提供方法进行遥 以无花果曲霉植酸酶基
因 责澡赠粤全长序列为模板袁随机引物法合成 阅蚤早 标记的
责澡赠粤探针袁待测大豆基因组 阅晕粤员园园益水浴 员园 皂蚤灶 变
性袁吸取 缘滋早点膜袁紫外照射固定袁杂交袁洗膜袁显色遥
员郾 猿摇 正交试验设计
根据单因素试验结果袁选择品种尧共培养光照条件
和共培养天数 猿 个因素设计正交试验袁共 怨 个处理渊表
员冤袁每个处理接种外植体 圆园园 片袁重复 圆 次遥 共培养基
责匀 值为 远郾 远袁共培养温度 圆源益遥
员郾 源摇 数据处理
以 杂燥怎贼澡藻则灶斑点杂交阳性结果统计转化率袁数据
应用 阅孕杂增苑郾 园缘 版统计软件进行统计分析遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 转 责澡赠粤基因大豆的获得
本研究应用了 苑 个大豆基因型袁得到了 远怨员 个独
立的卡那霉素抗性植株袁根据 责澡赠粤设计引物进行 孕悦砸
扩增袁 其中 圆园苑 株扩增出了 苑缘园遭责 大小的片段袁非转
基因的同种基因型大豆未扩增出条带渊图 员冤遥
对 孕悦砸 检测呈阳性的转化植株做 杂燥怎贼澡藻则灶 斑点
杂交袁结果显示有 员源远 个阳性杂交信号渊图 圆冤袁表明外
愿远缘员
摇 怨 期 共培养条件对农杆菌转化大豆子叶节的影响
注院 员 原 怨院卡那霉素抗性植株曰员园院阴性对照植株曰员员院阳性对照质粒曰员圆院阅晕粤 员园园园 造葬凿凿藻则 皂葬则噪藻则遥
晕燥贼藻院员 原 怨院 噪葬灶葬皂赠糟蚤灶 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 责造葬灶贼泽曰 员园院 晕藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 责造葬灶贼泽曰
员员院 孕燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 责造葬泽皂蚤凿曰 员圆院 阅晕粤 员园园园 造葬凿凿藻则 皂葬则噪藻则援
图 员摇 部分卡那霉素抗性植株植酸酶基因的 孕悦砸扩增结果
云蚤早援 员摇 孕悦砸 则藻泽怎造贼 燥枣 责葬则贼 燥枣 噪葬灶葬皂赠糟蚤灶 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 责造葬灶贼泽
源基因 责澡赠粤已整合到大豆基因组中遥
注院左上角的点为质粒阳性对照杂交信号曰右下角的点为非转化植
株的杂交信号曰其余的点为转化植株的杂交信号遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 泽责燥贼 蚤灶 贼澡藻 怎责 造藻枣贼 糟燥则灶藻则 蚤泽 贼澡藻 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 燥枣 责造葬泽皂蚤凿曰 贼澡藻
泽责燥贼 蚤灶 贼澡藻 遭燥贼贼燥皂 则蚤早澡贼 糟燥则灶藻则 蚤泽 贼澡藻 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造 燥枣 怎灶鄄贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
责造葬灶贼泽曰 贼澡藻 则藻泽贼 泽责燥贼泽 蚤泽 贼澡藻 澡赠遭则蚤凿蚤扎葬贼蚤燥灶 泽蚤早灶葬造 燥枣 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 责造葬灶贼泽援
图 圆摇 部分 孕悦砸阳性植株 泽燥怎贼澡藻则灶斑点杂交结果
云蚤早援 圆摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 责燥贼 澡赠遭则蚤凿蚤扎葬贼蚤燥灶
燥枣 责葬则贼 孕悦砸 责燥泽蚤贼蚤增藻 责造葬灶贼泽
在本研究中不同品种大豆转化率有明显差别遥 豫
豆 圆圆 的转化率最高袁从高到低依次是豫豆 圆圆尧冀豆
员圆尧秦黄小粒 员圆尧秦黄小粒 员园尧冀豆 苑尧冀豆 员苑 和冀黄
员猿遥 其中豫豆 圆圆尧冀豆 员圆 和秦黄小粒 员圆 之间差异不
显著袁此 猿 个品种与秦黄小粒 员园尧冀豆 苑尧冀豆 员苑 差异
显著渊 责 约 园郾 园缘冤袁与冀黄 员猿 差异极显著渊 责 约 园郾 园员冤遥
在本研究范围内确定豫豆 圆圆尧冀豆 员圆 和秦黄小粒 员圆
对农杆菌较为敏感袁获得的转化率较高渊表 圆冤遥
圆郾 圆摇 共培养阶段不同因素对转化效率的影响
共培养阶段是农杆菌完成转化的关键阶段袁本研
在已有研究的基础之上选择共培养光照尧共培养天数尧
共培养基 责匀 猿 个因素进行了研究咱员园暂 遥
圆郾 圆郾 员摇 共培养基 责匀 值对转化率的影响 摇 以秦黄小
粒 员圆 为材料袁 设计 缘郾 源尧远郾 园尧远郾 远 和 苑郾 圆 四种 责匀值的
共培养基遥 结果表明袁共培养基的 责匀 值为 缘郾 源 时袁转
化率最低袁为 员郾 缘怨豫 袁责匀 值为 远郾 远 时袁转化率最高袁达
到 缘郾 缘怨豫 遥 差异显著分析表明院责匀 值在 远郾 园 耀 苑郾 圆 之
间袁转化率均比 责匀值 缘郾 源 时显著提高渊责 约 园郾 园员冤袁责匀
值 远郾 远 与 责匀值 苑郾 圆 差异极显著袁而与 责匀值 远郾 园 未达
到极显著遥 当共培养基的 责匀 值为 远郾 园 耀 苑郾 圆 范围内袁
均提高了抗性芽出芽率及转化率遥 以 责匀 值 远郾 远 最佳
渊表 猿冤遥
摇 摇 责匀值对农杆菌生长有影响袁随着 责匀 的升高袁子
叶及子叶节节周围农杆菌增多袁责匀对子叶生长亦有影
响袁责匀值 缘郾 源 和 远郾 远 子叶为鲜绿色袁当 责匀值达到 苑郾 圆
时袁子叶则发黄袁生长受到抑制渊图 猿冤遥
圆郾 圆郾 圆摇 共培养光照条件对转化率的影响摇 以冀豆 员圆
为材料袁进行了共培养光照长度的试验袁结果显示共培
养阶段光照影响大豆子叶节的转化效率渊图 源冤遥 员圆澡窑
凿 原员光照渊缘郾 园远豫 冤 和 员远澡窑凿 原员光照渊缘郾 猿远豫 冤显著高于
园澡窑凿 原员光照渊员郾 缘远豫 冤和 圆源澡窑凿 原员光照渊园郾 源愿豫 冤 渊 责 约
园郾 园员冤曰而 员圆 澡窑凿 原员光照 和 员远澡窑凿 原员光照差异不显著渊责
跃 园郾 园缘冤袁园 澡窑凿 原员光照和 圆源澡窑凿 原员光照差异不显著渊 责
跃 园郾 园缘冤遥 员圆澡窑凿 原员光照和 员远澡窑凿 原员光照条件下大豆子
叶袁在共培养阶段变绿袁表现出更强的生命力袁获得最
高的转化率曰而 园 澡窑凿 原员光照的子叶节与共培养前无明
显变化袁为黄绿色袁只有经过转入诱导培养渊光照条件
下冤圆 耀 猿凿后的才能变成绿色曰在 圆源澡窑凿 原员光照下子叶
节变得深绿色袁子叶周围农杆菌较少遥 由本研究结果
说明 员圆 耀 员远 澡窑凿 原员光照条件是大豆子叶节共培养的适
宜光照条件袁可显著提高大豆子叶节的转化率遥
圆郾 圆郾 猿摇 共培养时间对转化率的影响 摇 以冀豆 员苑尧冀
豆 员圆尧豫豆 圆圆尧秦黄小粒 员园尧秦黄小粒 员圆尧和冀豆 苑 为
试验材料研究了共培养天数对子叶节转化率的影响遥
怨远缘员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
摇 摇 摇 摇 摇 摇 表 圆摇 不同品种大豆转化效率的比较
栽葬遭造藻 圆摇 栽澡藻 糟燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 泽燥赠遭藻葬灶 增葬则蚤藻贼蚤藻泽
材料
酝葬贼藻则蚤葬造
外植体数
耘曾责造葬灶贼泽
卡那抗性植株
运葬灶葬皂赠糟蚤灶 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
责造葬灶贼泽
孕悦砸阳性数
孕悦砸 责燥泽蚤贼蚤增藻 责造葬灶贼泽
杂燥怎贼澡藻则灶阳性数
杂燥怎贼澡藻则灶 凿燥贼贼蚤灶早
责燥泽蚤贼蚤增藻 责造葬灶贼泽
转化率
栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶
则葬贼藻 辕 豫
豫豆 圆圆 耶再怎凿燥怎圆圆爷 源苑苑 员员猿 猿怨 圆怨 远郾 园员 依 园郾 源员 葬粤鄢
冀豆 员圆 耶允蚤凿燥怎 员圆爷 源远园 员园愿 源员 圆苑 缘郾 怨缘 依 园郾 源园 葬粤
秦黄小粒 员圆
耶匝蚤灶澡怎葬灶早曾蚤葬燥造蚤 员圆爷 缘员猿 员圆愿 猿愿 猿园 缘郾 愿缘 依 园郾 远源 葬粤
冀豆 苑耶 允蚤凿燥怎 苑爷 猿怨圆 苑源 圆苑 员愿 源郾 远远 依 员郾 苑愿 葬遭粤
秦黄小粒 员园
耶匝蚤灶澡怎葬灶早曾蚤葬燥造蚤 员园爷 猿怨圆 怨员 圆圆 员愿 源郾 远缘 依 员郾 猿愿 葬遭粤
冀豆 员苑 耶允蚤凿燥怎 员苑爷 源园圆 愿猿 圆苑 员远 猿郾 愿怨 依 园郾 源苑 遭粤月
冀黄 员猿 耶允蚤澡怎葬灶早员猿爷 猿远园 怨源 员源 愿 圆郾 员苑 依 园郾 圆圆 糟月
摇 摇 注院鄢院转化率的差异显著性分析 遥 不同大小写字母分别表示差异在 园郾 园员 和 园郾 园缘 水平显著遥 下同遥
晕燥贼藻院 鄢院粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 燥枣 栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 则葬贼藻援 栽澡藻 糟葬责蚤贼葬造 葬灶凿 泽皂葬造造 造藻贼贼藻则泽 皂藻葬灶 泽蚤早蚤灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 葬贼 园郾 园缘 葬灶凿 园郾 园员 造藻增藻造泽袁
则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 泽葬皂藻 葬泽 枣燥造造燥憎蚤灶早援
表 猿摇 共培养 责匀值对大豆子叶节转化率的影响
栽葬遭造藻 猿摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 责匀 燥枣 糟燥鄄糟怎造贼怎则藻 皂藻凿蚤怎皂 燥灶 则葬贼藻 燥枣 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 泽燥赠遭藻葬灶 糟燥贼赠造藻凿燥灶 灶燥凿藻
责匀值
责匀 增葬造怎藻
外植体
耘曾责造葬灶贼泽
抗性芽率
砸葬贼藻 燥枣 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 遭怎凿泽 辕 豫
孕悦砸阳性率
孕悦砸 责燥泽蚤贼蚤增藻 则葬贼藻 辕 豫
杂燥怎贼澡藻则灶斑点阳性率
杂燥怎贼澡藻则灶 凿燥贼贼蚤灶早 责燥泽蚤贼蚤增藻 则葬贼藻 辕 豫
缘郾 源 猿员源 员员 员郾 缘怨 员郾 缘怨 依 园郾 源怨 糟悦鄢
远郾 园 猿园园 圆怨 远郾 远苑 源郾 远苑 依 园郾 圆愿 遭粤月
远郾 远 圆愿园 猿愿 愿郾 园圆 缘郾 缘怨 依 园郾 苑员 葬粤
苑郾 圆 圆缘怨 圆怨 源郾 远猿 源郾 圆缘 依 园郾 源怨 遭月
摇 摇 注院鄢院杂燥怎贼澡藻则灶斑点杂交阳性率的差异显著性分析遥
晕燥贼藻院 鄢院粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 燥枣 泽燥怎贼澡藻则灶 凿燥贼贼蚤灶早 责燥泽蚤贼蚤增藻 则葬贼藻援
图 猿摇 共培养基 责匀对农杆菌及子叶节的影响
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 糟燥鄄糟怎造贼怎则藻 皂藻凿蚤怎皂 责匀 增葬造怎藻 燥灶 贼澡藻 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 葬灶凿 糟燥贼赠造藻凿燥灶葬则赠 灶燥凿藻 燥枣 泽燥赠遭藻葬灶
结果显示袁随着共培养时间的延长转化率上升袁在 苑 耀
员园凿转化率最高袁员源凿均有所下降遥 不同品种最佳共培
养天数不同袁冀豆 员苑尧冀豆 员圆尧豫豆 圆圆尧和冀豆 苑 在共
培养 员园凿 得到的转化率最高袁平均转化率分别为
园苑缘员
摇 怨 期 共培养条件对农杆菌转化大豆子叶节的影响
图 源摇 不同共培养光照条件对大豆子
叶节转化率的影响
云蚤早援 源摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 造蚤早澡贼蚤灶早 贼蚤皂藻 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶 凿怎则蚤灶早
糟燥鄄糟怎造贼怎则藻 燥灶 责则燥责燥则贼蚤燥灶 燥枣 泽澡燥燥贼泽 燥枣 糟燥贼赠造藻凿燥灶 灶燥凿藻
缘郾 愿苑豫 尧愿郾 怨苑豫 尧愿郾 愿苑豫和 远郾 猿员豫 曰其中冀豆 员圆 最高单
次转化率达到 圆缘郾 缘猿豫 遥 而秦黄小粒 员园 和秦黄小粒
员圆 则在共培养 苑凿 得到的转化率最高袁分别达到
远郾 远猿豫和 远郾 怨圆豫 渊图 缘冤遥 综合 远 个品种的转化率对 源
个光照时间处理分析袁员园凿 和 苑凿 之间差异显著渊 责 约
园郾 园缘冤袁并且均与 猿凿和 员源 凿差异达到极显著水平渊责 约
园郾 园员冤袁猿凿和 员源凿之间差异显著渊责 约园郾 园缘冤遥
表 源摇 正交试验结果
栽葬遭造藻 源摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 燥枣 韵则贼澡燥早燥灶葬造 贼藻泽贼
处理
栽则藻葬贼皂藻灶贼
因素 员 云葬糟贼燥则员 因素 圆 云葬糟贼燥则圆 因素 猿 云葬糟贼燥则猿 结果 砸藻泽怎造贼泽
品种
灾葬则蚤藻贼赠
共培养光照
悦燥鄄糟怎造贼怎则藻 蚤造造怎皂蚤灶葬贼蚤燥灶
凿怎则葬贼蚤燥灶 辕 澡窑凿 原员
共培养天数
悦燥鄄糟怎造贼怎则藻
凿怎则葬贼蚤燥灶 辕 凿
抗性芽率
砸葬贼藻 燥枣 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
遭怎凿泽 辕 豫
杂燥怎贼澡藻则灶斑点杂交阳性率
砸葬贼藻 燥枣 泽燥怎贼澡藻则灶 凿燥贼贼蚤灶早
责燥泽蚤贼蚤增藻 辕 豫
员 秦黄小粒 员圆 耶匝蚤灶澡怎葬灶早曾蚤葬燥造蚤 员圆爷 园 猿 猿圆郾 怨苑 圆郾 圆源 依 园郾 圆怨 藻耘
圆 秦黄小粒 员圆 耶匝蚤灶澡怎葬灶早曾蚤葬燥造蚤 员圆爷 员园 苑 愿园郾 员怨 缘郾 源远 依 园郾 圆源 遭糟月悦
猿 秦黄小粒 员圆 耶匝蚤灶澡怎葬灶早曾蚤葬燥造蚤 员圆爷 员远 员园 怨源郾 远缘 远郾 源远 依 园郾 缘远 遭月
源 冀豆 员圆 耶允蚤凿燥怎 员圆爷 园 苑 缘远郾 源苑 猿郾 愿源 依 园郾 远怨 凿悦阅耘
缘 冀豆 员圆 耶允蚤凿燥怎 员圆爷 员园 员园 员圆园郾 猿源 愿郾 员怨 依 园郾 源源 葬粤
远 冀豆 员圆 耶允蚤凿燥怎 员圆爷 员远 猿 远源郾 源苑 源郾 猿怨 依 园郾 园远 糟凿悦阅
苑 豫豆 圆圆 耶再怎凿燥怎圆圆爷 园 员园 源怨郾 苑怨 猿郾 猿怨 依 园郾 怨员 凿阅耘
愿 豫豆 圆圆 耶再怎凿燥怎圆圆爷 员园 猿 远缘郾 园苑 源郾 源猿 依 园郾 圆缘 糟凿悦阅
怨 豫豆 圆圆 耶再怎凿燥怎圆圆爷 员远 苑 愿圆郾 缘圆 缘郾 远圆 依 园郾 圆员 遭月
圆郾 圆郾 源摇 大豆转化影响因素的正交试验摇 根据单因素
的试验结果袁选择品种尧共培养光照时间尧共培养天数
猿 个因素袁进行了正交试验遥 对试验结果统计分析表
明袁 冀豆 员圆尧共培养光照 员园澡窑凿 原员尧共培养 员园凿 组合
渊处理 缘冤转化率最高袁达到 愿郾 员怨豫 曰秦黄小粒 员圆尧共培
养光照 员远澡窑凿 原员尧共培养 员园凿 组合渊处理 猿冤次之达到
远郾 源远豫 曰豫豆 圆圆尧共培养光照 员远澡窑凿 原员袁共培养 苑凿 组合
渊处理 怨冤居第 猿 位袁达到 缘郾 远圆豫 渊表 源冤遥
图 缘摇 共培养时间对转化率的影响
云蚤早援 缘摇 耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 糟燥鄄糟怎造贼怎则藻 凿葬赠泽 燥灶 贼澡藻 则葬贼藻 燥枣
贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 泽燥赠遭藻葬灶 糟燥贼赠造藻凿燥灶 灶燥凿藻
猿 个因素中袁品种之间差异不显著渊 责 跃 园郾 园员冤曰共
培养阶段光照 员园澡窑凿 原员和 员远澡窑凿 原员处理之间差异不显
著渊责 跃 园郾 园员冤袁但均与完全黑暗处理差异显著渊 责 约
园郾 园员冤袁猿 个品种全黑暗的转化率最低曰共培养天数 猿
个处理之间均达到极显著差异渊 责 约 园郾 园员冤袁以共培养
员园凿最高袁猿凿最低渊表 缘袁表 远冤遥
在每天 员园澡 和 员远澡 光照条件下袁培养 苑凿 或 员园凿袁
大豆子叶体积增大尧变绿袁表现出更强的生命力曰在
园澡窑凿 原员光照条件下袁随着共培养时间的延长袁子叶体积
增大袁员园凿 跃 苑凿 跃 猿凿遥 但是颜色均比光照条件下的要
浅袁呈黄绿色遥 共培养 猿凿袁无论是每天 园澡尧还是 员园澡尧
员远澡光照袁子叶大小与共培养前无明显变化遥 在完全黑
暗和黑暗 辕光照交替条件下子叶节周围农杆菌生长正
常袁而在完全光照下农杆菌较少遥 随着共培养时间增
长袁大豆子叶体积增大袁提供光照 员园澡窑凿 原员和 员远澡窑凿 原员
员苑缘员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
摇 摇 摇 摇 摇 摇 表 缘摇 正交设计方差分析表
栽葬遭造藻 缘摇 灾葬则蚤葬灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 韵则贼澡燥早燥灶葬造 贼藻泽贼
变异来源
灾葬则蚤葬贼蚤燥灶 泽燥怎则糟藻
平方和
杂择怎葬则藻 泽怎皂
自由度
阅韵云
均方
酝藻葬灶 泽择怎葬则藻
云值
云 增葬造怎藻
责 原值
责 增葬造怎藻
处理号 栽则藻葬贼皂藻灶贼 晕燥援 缘圆郾 苑圆远源 愿 远郾 缘怨园愿 圆怨郾 园园猿员 园郾 园园园员
品种 灾葬则蚤藻贼赠 圆郾 猿圆缘愿 圆 员郾 员远圆怨 缘郾 员员苑缘 园郾 园猿圆愿
共培养光照
悦燥鄄糟怎造贼怎则藻 蚤造造怎皂蚤灶葬贼蚤燥灶 凿怎则葬贼蚤燥灶 辕 渊澡窑凿 原员 冤
圆怨郾 远苑苑圆 圆 员源郾 愿猿愿远 远缘郾 圆怨愿 园郾 园园园员
共培养天数 悦燥鄄糟怎造贼怎则藻 凿怎则葬贼蚤燥灶 辕 凿 员远郾 远圆员园 圆 愿郾 猿员园缘 猿远郾 缘苑园愿 园郾 园园园员
误差 耘则则燥则 圆郾 园源缘圆 园郾 圆圆苑圆
表 远摇 正交试验中 猿 个因素的差异显著性
栽葬遭造藻 远摇 栽澡藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 燥枣 贼澡则藻藻 枣葬糟贼燥则泽 蚤灶 贼澡藻 燥则贼澡燥早燥灶葬造 贼藻泽贼
品种
灾葬则蚤藻贼赠
杂燥怎贼澡藻则灶
斑点杂交阳
性率均值
粤增藻则葬早藻 燥枣 泽燥怎贼澡藻则灶
凿燥贼贼蚤灶早 责燥泽蚤贼蚤增藻 则葬贼藻 辕 豫
共培养光照
悦燥鄄糟怎造贼怎则藻
蚤造造怎皂蚤灶葬贼蚤燥灶
凿怎则葬贼蚤燥灶渊澡窑凿 原员 冤
杂燥怎贼澡藻则灶斑点杂交阳
性率均值
粤增藻则葬早藻 燥枣 泽燥怎贼澡藻则灶
凿燥贼贼蚤灶早 灾责燥泽蚤贼蚤增藻 则葬贼藻 辕 豫
共培养天数
悦燥鄄糟怎造贼怎则藻
阅怎则葬贼蚤燥灶 辕 凿
杂燥怎贼澡藻则灶斑点杂交阳
性率均值
粤增藻则葬早藻 燥枣 燥怎贼澡藻则灶 凿燥贼贼蚤灶早
责燥泽蚤贼蚤增藻 则葬贼藻 辕 豫
冀豆 员圆 耶允蚤凿燥怎 员圆爷 缘郾 源愿葬粤 员园 远郾 园猿葬粤 员园 远郾 园员葬粤
秦黄小粒 员圆
耶匝蚤灶澡怎葬灶早曾蚤葬燥造蚤员圆爷 源郾 苑圆遭粤 员远 缘郾 苑圆葬粤 苑 缘郾 圆园遭粤
豫豆 圆圆 耶再怎凿燥怎圆圆爷 源郾 苑员遭粤 园 猿郾 员远遭月 猿 猿郾 远怨糟月
尧大豆子叶呈鲜绿色袁表现出更强的生命力袁完全黑暗
条件下子叶发黄遥
猿摇 讨论
大豆转基因方法中以农杆菌介导转化大豆子叶节
法应用得最为广泛和成熟袁但是至今仍没有解决转化
率低的问题遥 农杆菌介导的植物转化系统中农杆菌和
植物受体是 圆 个必须的要件袁基因供体和受体之间实
现转化的过程是处在同一个环境系统中袁对二者都有
影响袁因此当条件对二者均合适时才有利于转化的完
成遥 在人为转化过程中袁共培养阶段是农杆菌和植物
受体共生的时期袁是遗传转化完成的最关键的时期遥
影响转化效率的因素很多袁多数研究是从农杆菌或外
植体的一个方面来研究提高转化效率的影响因素袁例
如农杆菌菌株尧酚类诱导物的使用尧侵染时间和方法尧
共培养条件等对转化率的影响咱圆 原 源暂 遥 在前期研究的基
础上袁本研究从农杆菌和大豆子叶节外植体双方考虑袁
重点研究共培养阶段共培养的时间尧光照条件和共培
养基的 责匀 值 猿 个因素袁寻找适宜农杆菌和外植体的
平衡点遥
农杆菌在共培养阶段完成对大豆的遗传转化遥 共
培养的过程是附着在伤口的农杆菌不断繁殖尧栽鄄阅晕粤
的转入与植物基因组整合的过程袁完成该过程至少需
要 员远澡袁因为野细胞的调节期冶大致为 员远澡遥 理论上共
培养的时间越长袁农杆菌就会繁殖越多袁完成转化的几
率越大袁但是时间过长袁农杆菌会过度繁殖袁使外植体
遭受毒害而死亡咱员猿暂 遥 此前大多数文献报道应用的共
培养时间为 圆 耀 猿凿咱员源 原 员苑暂 遥 应珊等咱员愿暂结果稍有不同袁
认为 猿 耀 缘凿最好遥 本研究综合单因素及正交试验结果
显示最佳共培养时间为 员园凿遥 大豆子叶节分生细胞深
埋于组织深处袁因此共培养时间延长袁会大大增加农杆
菌浸染分生细胞的几率袁从而提高了转化率遥 大豆子
叶节外植体本身质地比较坚硬袁耐受农杆菌能力强袁并
且整个外植体外表光滑袁表面的农杆菌很容易在脱菌
时冲洗干净袁因此本研究中共培养时间延长农杆菌繁
殖过增多袁没有影响大豆子叶节外植体的健康生长袁也
没给诱导培养阶段的抑菌带来困难袁不定芽诱导阶段
抑制农杆菌对获得转基因植株很重要遥 李文霞等咱远暂
认为直接筛选法是在细胞水平上选择袁缺少恢复培养
的阶段而不能承受选择压力袁采取延迟筛选法袁且延迟
苑凿筛选效果最好曰党慰等咱圆猿暂利用胚芽尖转化也得到 缘
耀 苑凿的恢复培养效果最佳的结果遥 在本研究中袁共培
养时间延长至 员园凿袁亦起到延迟筛选的作用袁因此提高
圆苑缘员
摇 怨 期 共培养条件对农杆菌转化大豆子叶节的影响
了转化率遥 本研究结果表明袁不同基因型最佳共培养
时间存在差异袁供试的 远 个基因型的大豆除了秦黄小
粒 员园 和秦黄小粒 员圆 在共培养 苑凿时的转化率最高曰其
余 源 种基因型大豆都是共培养 员园凿 最高袁其中冀豆 员圆
最高单次转化率达到 圆缘郾 缘猿豫 遥 造成这种差异的原因
有待进一步研究遥
光照条件是共培养的重要因素袁农杆菌生存在土
壤中袁黑暗是它的自然生存环境状态遥 共培养时黑暗
条件有利于农杆菌的生长袁而光照则有利于大豆子叶
节分生细胞分裂及外植体健康生长咱圆园暂 遥 因此同时满
足农杆菌和大豆子叶节分化的需要对转化很重要遥 关
于共培养光照条件的研究报道很少袁之前的报道认为
共培养在黑暗条件下比在光照条件下效果更好袁目前
通用 的 方 法 是 在 完 全 黑 暗 条 件 下 进 行 共 培
养咱远 原 苑袁员缘 原 员远袁员愿 原 员怨袁圆猿暂 遥 本研究结果表明在共培养阶段提
供适当时间的光照显著提高大豆子叶节的转化效率遥
子叶节外植体带有一片完整的子叶袁子叶的状况直接
影着子叶节分生细胞的生理状态遥 在 员园 耀 员远澡窑凿 原员光
照条件下共培养后的子叶呈鲜绿色袁表现出更强的生
命力曰全黑暗条件下子叶与共培养前无明显变化袁为黄
绿色曰在全光照下子叶节则变为深绿色袁子叶周围农杆
菌较少遥 因此共培养阶段光照 辕黑暗交替袁同时满足了
农杆菌和外植体生长的需要袁也符合农杆菌在自然转
化系统中的光周期变化遥 本试验得出的结论是
员园 耀 员远澡窑凿 原员光照条件下共培养比全黑暗获得了更高
的转化率袁尤其在共培养时间延长的情况下袁提供光照
对外植体健康生长更为重要遥
责匀 决定着决定着生物大分子的结构和活性的许
多方面咱圆员暂 遥 在植物组织培养中袁环境 责匀值对胞质 责匀
值尧质膜透性尧植物激素作用尧生理代谢及培养物的生
长和分化都有影响咱圆圆暂 袁农杆菌和外植体大豆子叶节均
与培养基直接接触袁责匀对双方有直接的影响遥 农杆菌
的生长及 栽鄄阅晕粤向植物细胞转移的活性均受环境 责匀
影响袁农杆菌生长的适宜 责匀值为 远 耀 怨咱员猿暂 袁最适 责匀值
为 苑郾 园咱圆员暂 袁责匀值 约 缘郾 苑 菌不易生长袁责匀 值对 灾蚤则 区域
基因的诱导有着明显的影响咱圆猿暂 遥 而外植体离体培养
最适 责匀值为 缘郾 园 耀 远郾 园袁当 责匀值 跃苑郾 园 或 责匀值 约源郾 缘
时生长和发育停滞咱圆员暂 袁与农杆菌的适宜范围不一致遥
本研究突破之前报道的 责匀 值范围咱圆猿 原 圆怨暂 袁寻找农杆菌
和外植体对 责匀需求的平衡点遥 目前通用的共培养基
责匀值为 缘郾 源遥 武小霞等咱圆猿暂研究结果显示袁大豆遗传转
化共培养基的 责匀值 缘郾 圆 耀 缘郾 远 范围内为宜袁不定芽诱
导率最高曰赵晓雯等咱圆缘暂认为 责匀 值是影响遗传转化效
率的最主要因素袁最适宜 责匀 值 缘郾 圆曰 酝燥灶凿葬造 等咱圆愿暂认
为 责匀值 缘郾 远 的共培养基对茶树的转化有促进作用袁
酝藻怎则藻则等咱圆怨暂认为 责匀缘郾 缘 是大豆遗传转化的最佳水
平袁党慰等咱圆猿暂报道 缘郾 源 显著提高大豆胚尖的转化率遥
本研究得出结论农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化共
培养基 责匀适宜范围为 远郾 园 耀 远郾 远袁以 责匀 值 远郾 远 最佳袁
共培养的大豆子叶节和农杆菌生长俱佳袁获得抗性芽
率尧孕悦砸阳性率和 杂燥怎贼澡藻则灶 斑点杂交阳性率均最高遥
大豆基因型是影响大豆遗传转化效率的重要因
素遥 不同研究者的试验中所选用转化大豆品种不同袁
在各自的试验范围内获得适宜转化的大豆品种袁本研
究中冀豆 员圆尧豫豆 圆圆 和秦黄小粒 员圆 对农杆菌较为敏
感袁获得的转化率较高遥
源摇 结论
本研究在前期的研究基础上袁进一步研究了影响
农杆菌介导大豆遗传转化的因素袁建立了一套高效的
大豆遗传转化体系遥 本研究在共培养的时间尧光照条
件和共培养基的 责匀值 猿 个因素突破了前人的研究结
论袁确定了该系统最佳的共培养的条件袁萌发后 源 耀 缘凿
的无菌苗袁制备子叶节浸染 猿园 耀 远园皂蚤灶袁在 责匀值为 远郾 远
的共培养基上袁于 圆源益袁员园 耀 员远澡窑凿 原员光照条件下袁共
培养 员园凿袁获得转化率最高遥 本研究范围内以冀豆 员圆尧
豫豆 圆圆 和秦黄小粒 员圆 三个基因型大豆获得了较高转
化效率遥 供试的 远 个大豆品种均获得了转基因植株袁
杂燥怎贼澡藻则灶 分析 责澡赠粤基因已经整合到大豆基因组中遥
参考文献院
咱 员 暂摇 匀蚤灶糟澡藻藻 酝 粤 宰袁 悦燥灶灶燥则鄄宰葬则凿 阅 灾袁 晕藻憎藻造造 悦 粤袁 酝糟阅燥灶灶藻造造 砸 耘袁
杂葬贼燥 杂 允袁 郧葬泽泽藻则 悦 杂袁 云蚤泽糟澡澡燥枣枣 阅 粤袁 砸藻 阅 月袁 云则葬造藻赠 砸 栽袁 匀燥则泽糟澡
砸 月援 孕则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 泽燥赠遭藻葬灶 责造葬灶贼泽 怎泽蚤灶早 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄
皂藻凿蚤葬贼藻凿 阅晕粤 贼则葬灶泽枣藻则咱允暂 援 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 员怨愿愿袁 远院 怨员缘 原 怨圆圆
咱 圆 暂摇 于洋袁侯文胜袁韩天富援 农杆菌介导大豆遗传转化技术的研究进
展咱允暂 援大豆科学袁圆园员园袁圆怨渊源冤院远怨远 原 苑园员
咱 猿 暂摇 杨向东袁隋丽袁李启云袁杨静袁邢国杰袁郭东全袁懂英山援 大豆遗传
转化技术研究进展咱允暂 援大豆科学袁圆园员圆袁猿员渊圆冤院猿园圆 原 猿员缘
咱 源 暂摇 姬月梅袁张银霞袁宋晓华援 农杆菌介导大豆遗传转化的研究进展
咱允暂 援农业科学研究袁 圆园园怨袁猿园渊员冤院 源苑 原 缘园
咱 缘 暂摇 粤则皂泽贼则燥灶早 悦袁阅燥灶早 允袁 云藻灶早 载 砸袁 云则赠 允袁运藻蚤贼澡造赠 郧袁 酝葬则贼蚤灶藻造造 月袁
砸燥遭藻则贼泽 郧袁杂皂蚤贼澡 蕴袁栽葬灶 蕴袁阅怎灶糟葬灶 阅援 蕴蚤责燥蚤糟 葬糟蚤凿鄄葬灶 怎灶蚤择怎藻 责造葬灶贼
贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻灶澡葬灶糟藻则 咱 允暂 援 陨灶 灾蚤贼则燥 悦藻造造怎造葬则 驭 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼葬造
月蚤燥造燥早赠 孕造葬灶贼援 圆园园怨袁 源缘 渊远冤院远猿园 原 远猿愿
咱 远 暂摇 李文霞袁宁海龙袁吕文河袁李文滨援 农杆菌介导大豆子叶节转化
系统的优化咱允暂 援中国农业科学袁 圆园园愿袁源员渊源冤院怨苑员 原 怨苑苑
咱 苑 暂摇 姬月梅袁陈受宜袁李英慧袁张丽娟袁宋晓华袁常汝镇袁邱丽娟援 农杆
菌介导大豆子叶节遗传转化体系的优化研究咱 允暂 援 大豆科学援
圆园园愿袁圆苑渊员冤院圆苑 原 猿圆
猿苑缘员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
咱 愿 暂 摇 宰藻蚤 在 酝袁 匀怎葬灶早 允 匝援 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 糟燥鄄糟怎造贼蚤增葬贼蚤燥灶 葬灶凿 泽藻造藻糟贼蚤燥灶
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泽燥赠遭藻葬灶 增葬则蚤藻贼蚤藻泽 咱允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 砸藻责燥则贼泽袁 圆园园愿袁 圆苑 渊猿冤袁 源愿怨 原
源怨愿
咱 怨 暂 摇 韵造澡燥枣贼 孕 酝袁 蕴蚤灶 运袁 郧葬造遭则葬蚤贼澡 允袁 晕蚤藻造泽藻灶 晕 悦袁 杂燥皂藻则泽 阅 粤援 栽澡藻
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贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 泽燥赠遭藻葬灶 糟燥贼赠造藻凿燥灶葬则赠鄄灶燥凿藻 糟藻造造泽援 孕造葬灶贼 悦藻造造
砸藻责燥则贼泽援 圆园园员袁 圆园渊愿冤院 苑猿员 原 苑猿苑
咱员园暂摇 李桂兰袁乔亚科袁杨少辉袁靳朝霞袁李明刚援 农杆菌介导大豆子叶
节遗传转化的研究咱允暂 援作物学报援 圆园园缘袁猿员渊圆冤院员苑园 原 员苑远
咱员员暂摇 李桂兰袁乔亚科袁李明刚袁崔姗姗袁乔潇袁乔坤艳援 植酸酶根特异
表达载体的构建及大豆转化咱 允暂 援 核农学报袁 圆园员员袁圆缘渊缘冤院 愿愿愿
原 愿怨猿
咱员圆暂摇 蕴蚤 郧 蕴袁 在澡怎 允 匀袁 杂怎灶 允袁 宰怎 在 宰袁 悦澡藻灶 允袁 再葬灶 允袁 宰葬灶早 蕴 云袁
悦澡藻灶 郧袁 允蚤葬灶早 匀 在袁 蕴蚤 酝 郧援 悦造燥灶蚤灶早 燥枣 贼澡藻 责澡赠贼葬泽藻 早藻灶藻 责澡赠粤 枣则燥皂
粤泽责藻则早蚤造造怎泽 枣蚤糟怎怎皂 猿郾 源猿圆圆 葬灶凿 蚤贼泽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶 赠藻葬泽贼 咱 允暂 援 云怎灶早葬造
阅蚤增藻则泽蚤贼赠援 圆园园猿袁 员猿院愿缘 原 怨猿
咱员猿暂摇 王关林袁 方宏钧援 植物基因工程 咱酝暂援 北京院科学出版社袁
圆园园怨院 猿怨猿
咱员源暂摇 酝藻怎则藻则 悦 粤袁 阅蚤灶噪蚤灶泽 砸 阅袁 悦燥造造蚤灶泽 郧 月援 云葬糟贼燥则泽 葬枣枣藻糟贼蚤灶早 泽燥赠遭藻葬灶
糟燥贼赠造藻凿燥灶葬则赠 灶燥凿藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 咱 允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 砸藻责燥则贼泽袁 员怨怨愿袁
员愿院 员愿园 原 员愿远
咱员缘暂 摇 杜升伟袁刘业丽袁姚丙晨袁白 晨袁苗兴芬袁刘春燕袁陈庆山袁胡国
华援 大豆转化体系的优化 阅燥枣源 基因转入大豆的研究咱 允暂 援 大豆
科学援 圆园员园袁 圆怨渊猿冤院猿怨愿 原 源园猿
咱员远暂摇 杨喆袁唐晓飞袁张颖袁董兴月袁王凤义袁刘丽君援 农杆菌介导不同
基因型大豆种子叶节遗传转化条件的研究 咱 允暂 援 大豆科学援
圆园员圆袁 猿园渊圆冤院员愿愿 原 员怨圆
咱员苑暂摇 段莹莹袁赵琳袁陈李淼袁李文滨援 农杆菌介导的大豆子叶节和下
胚轴转化方法的比较及优化咱 允暂 援 大豆科学袁圆园员园袁圆怨渊源冤院 缘怨园
原 缘怨猿
咱员愿暂摇 应珊袁何晓薇袁 王秀荣袁 寿惠霞援 影响农杆菌介导的大豆转化效
率的因素研究咱允暂 援 分子植物育种援 圆园园愿袁 远渊员冤院 猿圆 原 源园
咱员怨暂摇 马丽萍袁胡正袁张保缺袁张辉援 一种快速尧高效的大豆农杆菌转化
技术咱允暂 援中国农业科学袁 圆园园愿袁源员渊猿冤院远远员 原 远远愿
咱圆园暂摇 王昌陵袁赵军袁李英慧袁范云六袁张丽娟袁刘章雄袁关荣霞袁吕淑霞袁
常汝镇袁邱丽娟援转录因子 粤月孕怨 转化豆渊郧造赠糟蚤灶藻 皂葬曾 蕴援 冤及遗传
转化条件优化咱允暂 援中国农业科学袁圆园园愿袁源员渊苑冤院 员怨园愿 原 员怨员远
咱圆员暂摇 悦澡葬憎造葬 匀援 杂援 陨灶贼则燥凿怎糟贼蚤燥灶 贼燥 责造葬灶贼 遭蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠 咱 酝暂援 耘灶枣蚤藻造凿袁
晕匀袁 哉杂粤院 杂糟蚤藻灶糟藻 孕怎遭造蚤泽澡藻则泽袁 陨灶糟援 袁 圆园园圆院员愿
咱圆圆暂摇 曹新祥袁韩小云援植物组培中的 责匀 值咱 允暂 援 杭州师范学院学报院
自然科学版袁 圆园园猿袁 圆渊员冤院远园 原 远猿
咱圆猿暂摇 党尉袁卫志明援 根癌农杆菌介导的高效大豆遗传转化体系的建
立咱允暂 援 分子细胞生物学报袁 圆园园苑袁源园渊猿冤院 员愿缘 原 员怨缘
咱圆源暂摇 武小霞袁 李静袁 王志坤袁刘珊珊袁李海燕袁马永袁李文滨援 乙酰丁
香酮浓度和共培养 责匀对大豆再生频率的影响咱允暂 援 东北农业大
学学报袁 圆园员园袁 源员渊缘冤院 员 原 源
咱圆缘暂摇 赵晓雯袁吴芳芳袁狄少康袁柏锡袁纪巍袁李勇袁才华袁朱延明援 农杆
菌介导的大豆子叶节遗传转化技术流程及操作要点咱 允暂 援 大豆
科学袁 圆园员员郾 猿园渊猿冤院 猿远圆 原 猿远愿
咱圆远暂摇 乔利仙袁于新玲袁隋炯明袁范乾程袁孙世孟袁王晶珊援 农杆菌介导
的花生遗传转化体系的优化咱允暂 援 核农学报袁圆园员圆袁圆远渊怨冤 院员圆源源
原 员圆源愿
咱圆苑暂摇 马连杰袁 刘海峰袁 王志强袁 代丽丽袁 丁新华袁 储昭辉援 利用 悦则藻 辕
造燥曾 特异位点重组系统获得无选择标记转 粤贼酝再月员圆 基因的马铃
薯咱允暂 援 核农学报袁圆园员员袁圆缘渊远冤 院员员员苑 原 员员圆圆
咱圆愿暂摇 酝燥灶凿葬造 栽 运袁 澡葬贼贼葬糟澡葬则赠葬 粤 月袁 粤澡怎躁葬 孕 杂袁 悦澡葬灶凿 孕 运援 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟
贼藻葬 咱 悦葬皂藻造造蚤葬 泽蚤灶藻灶泽蚤泽 渊 蕴援 冤 韵 运怎灶贼扎藻 糟 增援 运葬灶早则葬躁葬贼 暂 责造葬灶贼泽
燥遭贼葬蚤灶藻凿 遭赠 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄 皂藻凿蚤葬贼藻凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 泽燥皂葬贼蚤糟
藻皂遭则赠燥泽咱允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 砸藻责燥则贼泽袁 圆园园员袁 圆园渊愿冤院 苑员圆 原 苑圆园
咱圆怨暂摇 酝藻怎则藻则 悦 粤袁 阅蚤灶噪蚤灶泽 砸 阅袁 悦燥造造蚤灶泽 郧 月援 云葬糟贼燥则泽 葬枣枣藻糟贼蚤灶早 泽燥赠遭藻葬灶
糟燥贼赠造藻凿燥灶葬则赠 灶燥凿藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 咱允暂 援 孕造葬灶贼 悦藻造造 砸藻责燥则贼泽袁 员怨怨愿袁 员愿
渊猿 辕 源冤院 员愿园 原 员愿远
源苑缘员
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员源袁圆愿渊怨冤院员缘远苑 耀 员缘苑缘
悦燥灶凿蚤贼蚤燥灶泽 燥枣 悦燥鄄悦怎造贼怎则藻 粤枣枣藻糟贼蚤灶早 燥灶 贼澡藻 耘枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄
酝藻凿蚤葬贼藻凿 栽则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 悦燥贼赠造藻凿燥灶葬则赠 晕燥凿藻 燥枣 杂燥赠遭藻葬灶
蕴陨 郧怎蚤鄄造葬灶员 摇 蕴陨哉 悦澡藻灶鄄早怎葬灶早员 摇 匝陨粤韵 载蚤葬燥圆 摇 再陨粤晕郧 载蚤葬燥鄄择蚤葬灶员 摇 宰粤晕郧 阅蚤员 摇 匝陨粤韵 再葬鄄噪藻员
渊员 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠 悦燥造造藻早藻袁 匀藻遭藻蚤 晕燥则皂葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻 驭 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 悦澡葬灶早造蚤袁 匀藻遭藻蚤摇 园远远远园园曰
圆 阅藻责葬则贼皂藻灶贼 燥枣 责澡赠泽蚤糟泽袁 匀藻遭藻蚤 晕燥则皂葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠 燥枣 杂糟蚤藻灶糟藻 驭 栽藻糟澡灶燥造燥早赠袁 匝蚤灶澡怎葬灶早凿葬燥袁 匀藻遭藻蚤摇 园远远园园源冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽澡藻 枣葬糟贼燥则泽 葬枣枣藻糟贼蚤灶早 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 蚤灶 贼澡藻 糟燥鄄糟怎造贼怎则藻 泽贼葬早藻 憎藻则藻 泽贼怎凿蚤藻凿 贼燥 蚤皂责则燥增藻 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄
皂藻凿蚤葬贼藻凿 贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶 燥枣 糟燥贼赠造藻凿燥灶葬则赠 灶燥凿藻 燥枣 泽燥赠遭藻葬灶援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 皂藻凿蚤怎皂 责匀袁 蚤造造怎皂蚤灶葬贼蚤燥灶 葬灶凿
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贼蚤皂藻 凿怎则葬贼蚤燥灶曰 陨造造怎皂蚤灶葬贼蚤燥灶 凿怎则葬贼蚤燥灶
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