全 文 ：核 农 学 报　 ２０１４，２８（６）：０９７０ ～ ０９７７
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１３⁃０８⁃１９　 接受日期：２０１４⁃０３⁃１２
基金项目：国家自然科学基金 （ ３１０７０４８０ ），教育部博士点基金项目 （ ２０１１１４０３１１０００４ ），山西农业大学中青年拔尖创新人才支持计划
（ＢＪＲＣ２０１２０１）
作者简介：贾栋，男，主要从事植物与昆虫分子生态学研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｏｄｏｎｇ＠ ｆｏｘｍａｉｌ． ｃｏｍ
通讯作者：马瑞燕，女，教授，主要从事生物安全与生物防治研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｍａｒｕｉｙａｎ２００４＠ １６３． ｃｏｍ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１４）０６⁃０９７０⁃０８
莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 基因克隆及高温表达分析
贾　 栋１ 　 刘艳红２ 　 韩　 政２ 　 赵龙龙１ 　 吕向阳１ 　 马瑞燕１
（ １ 山西农业大学农学院， 山西 太谷　 ０３０８０１；２ 山西农业大学生命科学院， 山西 太谷　 ０３０８０１）
摘　 要：为揭示热激蛋白（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｈｓｐｓ）基因和莲草直胸跳甲 Ａｇａｓｉｃｌｅｓ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ温度胁迫适
应性的关系，克隆了莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 基因序列，采用实时荧光定量 ＰＣＲ 的方法检测了 ２５ ～ ４２􀆰 ５℃
莲草直胸跳甲成虫体内 Ｈｓｐ７０ 的表达情况。 结果表明：所克隆序列含有 Ｈｓｐ７０ 家族的典型基序和位点，
并与其它昆虫 Ｈｓｐ７０ 的序列相似性很高，其中与马铃薯甲虫的相似性达到 ９４％ ，表明所克隆序列为
Ｈｓｐ７０ 靶基因，并对序列进行了系统进化分析；莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 的诱导起始温度为 ３２􀆰 ５℃ （Ｔｏｎ），诱
导最高温度为 ３７􀆰 ５℃（Ｔｍａｘ）；Ｈｓｐ７０ 的 Ｔｍａｘ能代表莲草直胸跳甲的耐受极限温度，是揭示物种耐受性的
很好指标。 本研究结果表明 Ｈｓｐ７０ 在莲草直胸跳甲的高温适应性中可能起重要作用。
关键词：莲草直胸跳甲；Ｈｓｐ７０；高温胁迫；实时定量 ＰＣＲ
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１４􀆰 ０６． ０９７０
　 　 喜旱莲子草（Ａｌｔｅｒｎａｎｔｈｅｒａ ｐｈｉｌｏｘｅｒｏｉｄｅｓ）是一种原
产于南美洲的多年生水陆两栖草本植物［１］，目前已经
在热带、亚热带和暖温带地区广泛归化（包括美国、澳
大利亚、新西兰、东南亚各国、印度和中国等很多国家
和地区） ［２］。 由于它能适应不同生境，迅速蔓延且难
以控制，对入侵地的生物多样性、生态系统和社会经济
均造成严重威胁，因而成为全球性的恶性杂草［２ － ４］，被
我国列为首批 １６ 种重要入侵物种之一［５］。
莲草直胸跳甲（Ａｇａｓｉｃｌｅｓ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ），属鞘翅目叶
甲科，原产于南美洲阿根廷，是喜旱莲子草的专食性天
敌［６ － ７］。 莲草直胸跳甲以幼虫和成虫取食喜旱莲子草
的叶片和嫩茎，老熟幼虫钻蛀茎秆后化蛹，阻止节间生
长并分泌有毒物质抑制植株的生长，从而摧毁植株。
由于其良好的防治效果，先后被美国、澳大利亚、新西
兰等国家引进。 我国于 １９８６ 年从美国佛罗里达引种
进行生物防治，已经在重庆、长沙、广西、福建等地建立
种群，并取得良好的防治效果［８］。 莲草直胸跳甲的温
度适应性较差，种群消长具有明显的季节规律，夏季高
温季节是喜旱莲子草的生长高峰期，但高温却对莲草
直胸跳甲的种群有明显抑制作用［４，９］。 短时高温暴露
对莲草直胸跳甲存活和生殖等特性等具有显著影
响［１０ － １１］。 以长沙地区为例，进入 ７ 月份以后气温逐渐
升高，高温期平均在 ３４℃以上，最高温可达 ３８ ～ ４０℃，
持续高温要延续至 ８ 月下旬，这一时期对莲草直胸跳
甲的发育极为不利，大量成虫死亡，种群数量锐减，喜
旱莲子草重新得到恢复。 ８ 月下旬，气温一般在 ２５ ～
３６℃之间，莲草直胸跳甲开始繁殖。 ９ 月至 １０ 月气温
在 １７ ～ ２６℃之间，莲草直胸跳甲进入繁殖盛期，种群
数量剧增［１２ － １３］。 因此，莲草直胸跳甲季节性种群动态
变化的原因可能与温度，特别是极端高温有关［１４］。
许多基因及其编码产物被证明与温度耐受性相
关。 例如：Ｍｅｔｈｕｓａｌａｈ（Ｍｔｈ） ［１５］、Ｔｕｒａｎｄｏｔ（Ｔｏｔ） ［１６］、 ｆｓｔ
和 ｔｒｅｈ［１７］基因与耐热性相关；而 Ｄｃａ［１８］、ｆｒｏｓｔ［１９］和 ｈｒｓ⁃
ｏｍｅｇａ［２０］与抗寒性关系密切。 研究表明，热激蛋白
（ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｓｐｓ）作为一种重要的应激蛋白，
在生物的抗逆性反应中起着十分重要的作用，可能是
与温度胁迫最为密切的基因之一［２１ － ２２］。 Ｈｓｐｓ 根据其
分子量的大小和氨基酸的同源性，普遍公认分为 ４ 个
家族，即 Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ６０ 和 ｓｍａｌｌ Ｈｓｐｓ（ ｓＨｓｐｓ）。
在所有家族中，Ｈｓｐ７０ 最保守研究也较为广泛。 已有
０７９
　 ６ 期 莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 基因克隆及高温表达分析
研究表明，Ｈｓｐ７０ 基因的诱导表达与生物耐热与抗寒
能力的增强密切相关［２３］，Ｈｓｐ７０ 的过量表达降低甚至
阻止了细胞的生长和分化，降低了昆虫的生殖能力。
在果蝇中发现，高温诱导下 Ｈｓｐ７０ 的表达与卵的孵化
率密切关联［２４］，果蝇成虫在高温处理后其产卵量明显
降低［２５］。 国内外关于莲草直胸跳甲与温度的相关研
究主要集中在温度对其存活及繁殖特性等方面，关于
Ｈｓｐｓ和温度相关方面的研究一直无人报道。 据此，本
研究克隆了 Ｈｓｐ７０ 基因序列，构建实时荧光定量 ＰＣＲ
体系，检测高温对莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 表达的影响，为
了解莲草直胸跳甲对温度的适应性以及气候变暖对喜
旱莲子草的生物防治都具有重要意义。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 供试昆虫培养
以实验室长期饲养的莲草直胸跳甲为试验材料。
饲养在人工气候箱（ＰＲＸ － ４５０Ｃ，宁波赛福），条件为
２６ ± １℃，１４ｈ光照 ／ １０ｈ黑暗，相对湿度 ８５％ 。
１􀆰 ２　 试验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 温度处理　 采集刚羽化的成虫（雌雄比 １∶ １），
在恒温培养箱（ＳＩ － ２３ＭＣ，杭州博日，温度波动度 ±
０􀆰 ２℃）中分别进行高温处理 （ ２５ ～ ４２􀆰 ５℃，间隔
２􀆰 ５℃）１ ｈ，然后在 ２５℃恢复 １ ｈ，液氮速冻后， － ８０℃
保存备用。 以常温 ２５℃为对照，每个处理 ３ 次重复，
每次 ２０ 头虫。
１􀆰 ２􀆰 ２　 总 ＲＮＡ提取　 将冻存的莲草直胸跳甲样品放
入液氮中研磨，将彻底研磨后的样品放入 １􀆰 ５ ｍＬ离心
管中，参照 Ｔｒｉｚｏｌ （ Ｉｎｖｉｒｔｒｏｇｅｎ） 的操作方法提取总
ＲＮＡ，需改进的地方是在加入 １ ｍＬ Ｔｒｉｚｏｌ 同时再加入
２％的 β巯基乙醇 ５０ μＬ。 用 １􀆰 ２％甲醛变性琼脂糖凝
胶电泳检测总 ＲＮＡ 的完整性，核酸蛋白检测仪
（Ｂｉｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ ｐｌｕｓ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）测定其浓度和纯度，然
后 － ８０℃保存备用。
１􀆰 ２􀆰 ３　 目的片段的 ＰＣＲ 扩增 　 以提取的 ＲＮＡ 为模
板，用 ＴＩＡＮＧＥＮ Ｑｕａｎｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴ合成 ｃＤＮＡ第一链，再
以第一链为模板扩增莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 片段。 ＰＣＲ
反应体系为：１０ × ＰＣＲ 缓冲液 １􀆰 ５ μＬ、ｄＮＴＰｓ（２􀆰 ５
ｍｍｏｌ·Ｌ － １ ） １􀆰 ２ μＬ、引物（１０ μｍｏｌ·Ｌ － １ ）各 １􀆰 ２ μＬ、
ｃＤＮＡ模板 １ μＬ、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ聚合酶（５ Ｕ·μＬ － １）０􀆰 １５
μＬ，加 ｄｄＨ２Ｏ 至 １５ μＬ。 反应程序为：９４℃预变性 ５
ｍｉｎ；９４℃变性 ３０ ｓ，５８℃退火 ４０ ｓ，７２℃延伸 ４０ ｓ；一定
循环数后 ７２℃总延伸 １０ ｍｉｎ； － ２０℃保存。 将扩增产
物进行电泳检测。 目的片段引物参考马铃薯甲虫、美
洲斑潜蝇等 ９ 种昆虫的 Ｈｓｐ７０ 序列设计简并引物，由
日本 Ｔａｋａｒａ公司合成（Ｈｓｐ７０ － Ｆ：５′ － ＧＧＣＡ（Ａ ／ Ｇ）ＧＣ
（Ｃ ／ Ｔ ／ Ａ）ＡＣ （Ｇ ／ Ａ ／ Ｃ）ＡＡ（Ｇ ／ Ａ）ＧＡＴＧＣ －３′，Ｈｓｐ７０ －
Ｒ：５′ － ＧＴＴＧＴＣ（ Ｔ ／ Ｃ） ＴＴ（ Ｃ ／ Ｔ ／ Ｇ） ＧＴＣＡＴ（Ｇ ／ Ａ ／ Ｃ）
ＧＣＴＣ －３′）。
１􀆰 ２􀆰 ４　 ＰＣＲ产物的克隆、鉴定及测序 　 ＰＣＲ 产物经
凝胶回收试剂盒回收纯化后，连接至 ｐＭＤ１８ － Ｔ载体，
然后转化到大肠杆菌感受态细胞 ＤＨ５α 中，涂于含有
Ａｍｐ ／ Ｘ⁃ｇａｌ ／ ＩＰＴＧ的 ＬＢ 培养基上，３７℃避光恒温培养
过夜进行蓝白斑筛选。 挑取阳性克隆接种扩大培养，
ＰＣＲ菌液鉴定阳性克隆后送至 Ｔａｋａｒａ公司测序。
１􀆰 ２􀆰 ５　 高温诱导 Ｈｓｐ７０ 的定量检测 　 将上述提取的
总 ＲＮＡ分别反转录获得 ｃＤＮＡ，以 β － ａｃｔｉｎ 为内参基
因，采用实时荧光定量 ＰＣＲ 方法，检测莲草直胸跳甲
高温诱导下 Ｈｓｐ７０ 的表达水平。 ＰＣＲ 引物见表 １，反
应仪器为 Ｍｘ ３０００Ｐ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），反应
程序为：９５℃预变性 ３０ ｓ；９５℃变性 ３０ ｓ，５５℃退火 ３０
ｓ，７２℃延伸 ３０ ｓ，４０ 个循环；９５℃变性 １ ｍｉｎ，５５℃退火
３０ ｓ，９５℃变性 １ ｍｉｎ，１ 个循环，为检测熔解曲线。 将
莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 的质粒 ＤＮＡ 等比例（１０ － １）稀释
成不同的浓度，制作标准曲线。
１􀆰 ２􀆰 ６　 数据统计分析 　 不同处理间差异显著性用
ＳＰＳＳ１３􀆰 ０ 软件中的 ｏｎｅ⁃ｗａｙ ＡＮＯＶＡ中的 Ｄｕｎｃａｎ多重
比较进行统计分析。 ＡＮＯＶＡ分析中，相对表达量的数
据经对数转换做因变量，温度做自变量。 Ｈｓｐ７０ 诱导
表达量首次显著高于 ２５℃处理所对应的温度记为
Ｔｏｎ，表达量最高时所对应的温度记为 Ｔｍａｘ。 所有的数
据均来自 ３ 次生物重复，用 ｍｅａｎ ± Ｓ． Ｅ．表示。 原始
数据用 ｌｇ（Ｘ ＋ １）转换后进行差异显著性分析［２６］，Ｐ ＜
０􀆰 ０５ 作为差异显著性标准。
表 １　 实时荧光定量 ＰＣＲ引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅｓ
引物（５′ － ３′）
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
扩增片段长度
Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ／ ｂｐ
β － ａｃｔｉｎ － Ｆ ＴＴＣＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＡＣＣＴＧＧ １３８
β － ａｃｔｉｎ － Ｒ ＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＴＧ
Ｈｓｐ７０ － Ｆ ＧＣＣＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＣＡＴＣＴ １５０
Ｈｓｐ７０ － Ｒ ＡＧＣＴＣＴＴＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＴＣＣＴＴ
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核　 农　 学　 报 ２８ 卷
２　 结果与分析
２􀆰 １　 莲草直胸跳甲总 ＲＮＡ的提取
用核酸蛋白检测仪测定总 ＲＮＡ 纯度， ＯＤ２６０ ／
ＯＤ２８０ 的比值为 １􀆰 ８ ～ ２􀆰 ０，表明总 ＲＮＡ 纯度较高。
用 １􀆰 ２％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ 的完
整性，２８Ｓ ｒＲＮＡ 条带的亮度约为 １８Ｓ ｒＲＮＡ 条带的 ２
倍，表明总 ＲＮＡ 的完整性良好，可用于后续试验。
２􀆰 ２　 Ｈｓｐ７０ 序列分析
通过简并引物 ＰＣＲ 扩增，在 １０００ ｂｐ 处得到特异
注：下划线标出 ４ 个高度保守的氨基酸特征域和基序。
Ｎｏｔｅ： Ｔｈｅ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｔｈａｔ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ ａｌｌ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｓｐ７０ ｆａｍｉｌｙ．
图 １　 莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 序列及其对应的氨基酸序列
Ｆｉｇ． １　 Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ａ． ｈｙｇｏｐｈｉｌａ Ｈｓｐ７０ ａｎｄ ｉｔｓ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
性条带，初步判断获得了莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 靶基因。
重组质粒测序结果显示，目的片段长 １０１８ ｂｐ。 测序所
得的核酸序列通过 ＤＮＡＭＡＮ 查找可能的开放阅读框
（ＯＲＦ），并翻译成相应的氨基酸序列，得到一段长 ３３９
个氨基酸的多肽段。 该多肽段包含真核生物 Ｈｓｐ７０
家族 ３ 个 典 型 的 基 序 （ ｍｏｔｉｆ ）： （ ＩＤＬＧＴＴＹＳ、
ＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ、ＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰ）中的 ２ 个，此外，该
多肽段还存在以下 ２ 个功能位点：ＡＴＰ ／ ＧＴＰ 结合位点
（ ＡＥＡＹＬＧＫ ／ ＴＴ ）、 Ｂｉｐａｒｔｉｖｅ 核定位信号 （ ＫＲＫＹＫ ／
ＲＫＤＬＴＴ ＮＫＲＡＬＲＲＬ）。 测序结果及推导出的氨基酸
序列如图 １ 所示。 对克隆的基因序列用 ＮＣＢＩ 的
ＢＬＡＳＴｎ和 ＢＬＡＳＴｐ进行相似性搜索，将比对结果 Ｅ值
低于 １ｅ － ５ 的 ＥＳＴ 视为同源序列。 结果表明：该序列
与其近缘昆虫的 Ｈｓｐ７０ 家族核苷酸序列之间相似性很
高，其 中 与 已 经 报 道 马 铃 薯 甲 虫 Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ
ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ的相似性最高达到 ７９％ ，由该序列推导出
的氨基酸序列经 ＢＬＡＳＴｐ 相似性搜索，结果显示莲草
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　 ６ 期 莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 基因克隆及高温表达分析
注：Ａｇａｓｉｃｌｅｓ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ： 莲草直胸跳甲；Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ： 马铃薯甲虫（ＡＡＧ４２８３８􀆰 １）；
Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ： 赤拟谷盗（ＮＰ＿００１１６４１９９􀆰 １）；
Ｄａｎａｕｓ ｐｌｅｘｉｐｐｕｓ： 君主斑蝶（ＥＨＪ７３８９１􀆰 １）；Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ： 斜纹夜蛾（ＡＤＶ０３１６０􀆰 １）。
图 ２　 莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 与其他昆虫氨基酸序列的同源性比较
Ｆｉｇ． ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｉｎ Ａ． ｈｙｇｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｉｎｓｅｃｔｓ
直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 氨基酸序列与其它昆虫有着极高的相
似性（８７％ ～ ９４％ ），与马铃薯甲虫的相似性达到
９４％ ，与赤拟谷盗 Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ 和斜纹夜蛾
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ等昆虫均有 ９０％ 以上的相似性（图
２）。 因此，可确定克隆的序列为莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０
目的基因。 利用 ＭＥＧＡ ４􀆰 ０ 软件将 ３０ 种来源不同的
Ｈｓｐ７０ 序列相似性较高的昆虫进行氨基酸序列比
对［２７］，采用 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ⁃Ｊｏｉｎｉｎｇ 法，重复 １０００ 次，构建
Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ验证的系统进化树（图 ３）。 结果表明，昆虫
纲的 ５ 个目的物种都能各自分开聚类，该聚类结果与
昆虫学上的传统分类一致，表明 Ｈｓｐ７０ 作为一个保守
性较强的功能基因，可以作为系统进化分析的标志基
因。
２􀆰 ３　 高温胁迫对 Ｈｓｐ７０ 基因表达的影响
将莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 的质粒 ＤＮＡ 等比例
（１０ － １）稀释成不同的浓度做标准曲线，其相关系数 Ｒ２
＝ ０􀆰 ９９８，表明此标准曲线可以用于莲草直胸跳甲
Ｈｓｐ７０ 表达的相对定量检测。 采用定量 ＰＣＲ的方法检
测 Ｈｓｐ７０ 在 ２５ ～ ４２􀆰 ５℃范围内的相对表达水平，结果
表明（图 ４），Ｈｓｐ７０ 基因诱导表达在 ２５ ～ ３０℃范围内
与对照组相比没有显著差异，３２􀆰 ５ ～ ４２􀆰 ５℃范围内与
对照组相比有显著差异（Ｐ ＜ ０􀆰 ０５）。 诱导表达量与对
３７９
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
图 ３　 用ＭＥＧＡ构建 ３０ 种昆虫 Ｈｓｐ７０ 的系统进化树
Ｆｉｇ． ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｉｎ ３０ ｉｎｓｅｃｔｓ ｗｉｔｈ ＭＥＧＡ
照相比，３７􀆰 ５℃时达到最大，当温度超过 ４０℃时，诱导
表达量反而受到抑制明显下降，可能这一温度已经超
过了莲草直胸跳甲的耐受极限。 高温胁迫下莲草直胸
跳甲 Ｈｓｐ７０ 的 Ｔｏｎ和 Ｔｍａｘ分别为 ３２􀆰 ５℃和 ３７􀆰 ５℃。
３　 讨论
本研究首次成功克隆了莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 基因
片段，由此序列推导出的氨基酸序列中包含了 Ｈｓｐ７０
家族 ２ 个典型的基序：ＤＬＧＴＴＹＳ ／ ＩＦＤＬＧＧＧＴＦＤＶＳＩＬ和
ＶＬＶＧＧＳＴＲＩＰ［２８］。 此外还存在 ＡＴＰ ／ ＧＴＰ 结合位点
ＡＥＡＹＬＧＫ ／ ＴＴ， Ｂｉｐａｒｔｉｖｅ 核定位信号位点 ＫＲＫＹＫ ／
ＲＫＤＬＴＴＮＫＲＡＬＲＲＬ［２９］。 莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 序列同
源比对可知，与其它已知昆虫 Ｈｓｐ７０ 氨基酸序列相似
性很高，其中与鞘翅目马铃薯甲虫的相似性达到
９４％ 。 表明所克隆序列为 Ｈｓｐ７０ 靶基因片段。 热激蛋
白基因在进化上高度保守，Ｈｓｐ６０、Ｈｓｐ９０ 已经成功应
用于分子进化的研究［３０ － ３１］，本研究聚类分析表明，
Ｈｓｐ７０ 可以把各目昆虫单独聚类，反应目以下昆虫之
间的亲缘关系，说明 Ｈｓｐ７０ 可以作为系统进化分析的
标志基因。
温度是影响昆虫分布和丰度的重要因子，自然界
中昆虫难免受到温度变化的胁迫。 昆虫对温度胁迫耐
受性的高低直接影响其种群的分布和发展。 大量研究
表明，诱导型热激蛋白的表达积累决定着真核生物细
胞温度胁迫的耐受性［３２ － ３３］。 热激条件下，生物体正常
蛋白的合成受到抑制，热激蛋白开始合成，合成的热激
蛋白可保护机体蛋白免遭损伤或修复已损伤的蛋白
质，从而对生物体起到保护作用［３４］。 本研究通过实时
荧光定量 ＰＣＲ发现，３２􀆰 ５℃处理 １ ｈ后，莲草直胸跳甲
４７９
　 ６ 期 莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 基因克隆及高温表达分析
注：图中柱高数据为平均数 ±标准误；不同小写字母表示差异
显著（Ｐ ＜ ０􀆰 ０５）。
Ｎｏｔｅ： Ｄａｔａｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｇｕｒｅ ａｒｅ ｍｅａｎ ± ＳＥ，ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｏｗｅｒｃａｓｅ
ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅａｎｓ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ （ Ｐ ＜
０􀆰 ０５） ．
图 ４　 莲草直胸跳甲 Ｈｓｐ７０ 的高温诱导表达
Ｆｉｇ． ４　 Ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｉｎ Ａｇａｓｉｃｌｅｓ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ
Ｈｓｐ７０ 基因开始诱导表达（Ｔｏｎ），当 ３７􀆰 ５℃处理 １ ｈ后，
Ｈｓｐ７０ 基因的相对表达量达到最大（Ｔｍａｘ）。 当温度超
过 ４０℃时，诱导表达量反而受到抑制明显下降，可能
这一温度已经超过了莲草直胸跳甲的耐受极限，也进
一步地说明，Ｈｓｐ７０ 对生物体的保护有一定范围，如果
应激超过一定强度，变性蛋白产生过多超过 Ｈｓｐ７０ 保
护和耐受范围，将影响细胞的功能，引起细胞凋亡。
热激蛋白的高表达一方面提高了昆虫的耐热能
力，使昆虫免于温度胁迫带来的直接伤害；另一方面热
激蛋白的高诱导表达也消耗能量，影响其它蛋白的合
成，进而可能会影响昆虫正常的生长发育，从而对许多
生理过程如生殖等带来负面影响［２２，３５］。 本研究荧光
定量数据结果显示 Ｔｍａｘ为 ３７􀆰 ５℃，赵鑫等［１０］研究结果
表明：短时高温对莲草直胸跳甲存活和生殖等特性具
有显著影响，３７ ～ ４５℃时雌雄虫寿命降低，随着温度升
高，产卵前期延长，产卵量降低，并且还影响到后代的
生存能力［１１］。 因此本文的研究结果支持上述观点，同
时说明热激蛋白诱导表达的温度阈值 Ｔｍａｘ可能是影响
昆虫在自然界分布的关键因素，是揭示物种胁迫耐受
性的很好指标。
４　 结论
本研究初步明确了热激蛋白基因 Ｈｓｐ７０ 表达与连
草直胸跳甲高温耐受性的关系，推测 Ｈｓｐ７０ 对增强莲
草直胸跳甲的高温适应性具有重要作用；确定了
Ｈｓｐ７０ 表达的温度阈值，其中 Ｔｍａｘ能代表莲草直胸跳甲
的耐受极限温度，是揭示物种耐受性的很好指标，对解
释莲草直胸跳甲季节性种群动态变化的原因和预测昆
虫的地理分布具有重要意义。 关于 Ｈｓｐ７０ 对莲草直胸
跳甲温度适应性和生长发育适合度影响的分子机制，
还需要通过 ＲＮＡｉ等其他分子手段进一步进行功能验
证。
参考文献：
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５７９
核　 农　 学　 报 ２８ 卷
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Ｗ， Ｋａｎｇ Ｌ． ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｅ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
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Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００７，１６（２）：２０７ － ２１９
［３３］　 Ｓｈｅｎ Ｙ， Ｇｕ Ｊ， Ｈｕａｎｇ Ｌ Ｈ， Ｚｈｅｎｇ Ｓ Ｃ， Ｌｉｕ Ｌ， Ｘｕ Ｗ Ｈ， Ｆｅｎｇ Ｑ
Ｌ， Ｋａｎｇ Ｌｅ． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｘ ｓｍａｌｌ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ
ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｃｕｔｗｏｒｍ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ ［ Ｊ ］ ．
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１１，５７（７） ９０８ － ９１４
［３４］　 Ｐａｒｓｅｌｌ Ｄ Ａ， Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ Ｓ． Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ［Ｍ］． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９９４：４５７ － ４９４
［３５］　 Ｆｅｒｄｅｒ Ｍ Ｅ， Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｇ Ｅ． Ｈｅａｔ⁃ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ， ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅ： ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ａｎｄ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ
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６７９
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
２０１４，２８（６）：０９７０ ～ ０９７７
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇｅｎｅ Ｈｓｐ７０ ｉｎ Ａｇａｓｉｃｌｅｓ Ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ
ａｎｄ ｉｔｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｈｉｇｈ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
ＪＩＡ Ｄｏｎｇ１ 　 ＬＩＵ Ｙａｎ⁃ｈｏｎｇ２ 　 ＨＡＮ Ｚｈｅｎｇ２ 　 ＺＨＡＯ Ｌｏｎｇ⁃ｌｏｎｇ１ 　 ＬＶ Ｘｉａｎｇ⁃ｙａｎｇ１ 　 ＭＡ Ｒｕｉ⁃ｙａｎ１
（ １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔａｉｇｕ， Ｓｈａｎｘｉ　 ０３０８０１；
２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓｈａｎｘｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｔａｉｇｕ， Ｓｈａｎｘｉ　 ０３０８０１）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｒｍａｌ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇａｓｉｃｌｅｓ ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ， ｗｅ
ｃｌｏｎｅｄ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｆｒｏｍ Ａ． ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｆｒｏｍ ２５ｏＣ ｔｏ ４２􀆰 ５ｏＣ ｂｙ ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｙｐｉｃａｌ Ｈｓｐ７０ ｍｏｔｉｆ ａｎｄ ｓｉｔｅ ａｎｄ ｓｉｍｉｌａｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ Ｈｓｐ７０ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｉｎｓｅｃｔｓ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｆｒｏｍ Ａ． ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ ａｎｄ Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ
ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ ｒｅａｃｈｅｄ ９４％ ， ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗａｓ Ｈｓｐ７０ ｇｅｎｅ． Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｈｓｐ７０ ｉｎ Ａ．
ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ Ｈｓｐ７０ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ３２􀆰 ５ｏ Ｃ （ Ｔｏｎ ） ａｎｄ ｒｅａｃｈｅｄ ｍａｘｉｍａｌ ３７􀆰 ５ｏ Ｃ （ Ｔｍａｘ ）． Ｔｈｅ Ｔｍａｘ ｃｏｕｌｄ
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ Ａ． ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ ａｎｄ ｗａｓ ａ ｇｏｏｄ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｒｅｖｅａｌｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ． Ｔｈｅｓｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｕｇｇｅｓｔ ｔｈａｔ， Ｈｓｐ７０ ｍａｙ ｐｌａｙ ａ ｒｏｌｅ ｉｎ Ａ． ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ ａｄａｐｔｉｏｎ ｔｏ ｈｉｇｈ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ａｇａｓｉｃｌｅｓ Ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ； Ｈｓｐ７０； Ｈｉｇｈ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｓｔｒｅｓｓ； Ｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
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