全 文 :易在受损内皮表面上相互黏附聚集 ,释放 TXA 2、ADP 等 , 从而
进一步加剧血小板聚集。本实验发现 TST 60 mg/ kg 能显著降
低大鼠血浆中 GMP-140 水平 ,提示 TST 可能通过抑制血小板
活化 ,从而延缓血栓的形成。
血栓烷 A2(TXA 2)、PGI 2 均为花生四烯酸(AA)的代谢产
物。当血小板激活时 , 磷脂酶 A2 被激活 , AA 通过环氧化酶 、
TXA2 合成酶代谢为 TXA2 。 TXA2 是一种强有力的血小板聚集
剂[ 3] ,有较强的促血凝作用 , PGI2 与 TXA2 作用正好相反。
Metha[ 4]认为体内 TXA 2/ PGI2 失衡是引起冠状动脉收缩或血小
板聚集 ,导致心绞痛和心肌梗死的原因之一。由于 TXA2/ PGI2
生物半衰期短 ,迅速代谢为 TXB2 、6-Keto-PGF 1α, 所以 , 本实
验中测量 TXB2、6-Keto -PGF1α水平可以反映大鼠血液内
TXA2/ PGI2含量的变化。本实验显示 TST 60 mg/ kg 、30 mg/kg
皆能显著降低大鼠血浆中 TXB2水平;TST 60 mg/ kg 能显著提
高 大鼠 血 浆 中 6 - Keto - PGF1α , 表 明 TST 具 有 调 节
TXA2/ PGI2失衡 、抑制血小板聚集的作用。
纤维系统负责清除循环血液中的纤维蛋白 , 包括一个无活
性的酶原即纤溶酶原 ,此酶原被纤溶酶原激活物(PA)激活成纤
溶酶 , 纤溶酶降解纤维蛋白及细胞外基质蛋白。纤溶系统的抑
制可在两个水平上进行:一是在纤溶酶水平 ,主要是 2-抗纤溶
酶;另一个是在纤溶酶原激活物水平 ,即受纤溶酶原激活物抑制
剂(PAI)的调节 。其中起主要作用的为纤溶酶原激活物抑制
剂-1(PAI-1)。本实验中 , TST 60 mg/ kg 能显著提高大鼠血
浆中 t-PA 水平 , TST 60 mg/kg、30 mg/ kg 皆能显著降低大鼠
血浆中 t-PAI水平 , 这表明 TST 对纤溶系统的调节也是其抑
制血栓形成的机制之一。
参考文献:
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作者简介:殷惠军(1971—),男 ,医学博士后 ,副教授 ,硕士导师 ,本刊编
委 ,现工作于中国中医研究院西苑医院(邮编:100091);周大勇 ,工作于
中国科学院大连化学物理研究所;蒋跃绒 、史大卓 ,工作于中国中医研究
院西苑医院;罗兰 ,工作于佳木斯大学医学院。
(收稿日期:2004-09-15)
(本文编辑 王雅洁)
白花丹参叶制剂对局灶性脑梗死
HSP70及细胞凋亡的影响
王贤军 ,夏 青 ,蔡洪信 ,杨 琳 ,夏作理
摘要:目的 观察热休克蛋白 70(HSP70)、神经细胞凋亡在大鼠局灶性脑梗死后不同时程的表达 , 探讨二者的关系及白花丹参叶制
剂对其的影响。方法 采用光化学法诱导大鼠局灶性脑梗死模型 ,HSP70 免疫组织化学染色 ,并用 TdT-介导 duTP-生物缺口末
端标记(T UNEL)方法检测凋亡细胞。结果 免疫组化显示白花丹参叶制剂预处理组与单纯局灶性脑梗死组各时间点相比阳性反
应均有明显的增多(P<0.05)。 TUNEL结果显示 , 白花丹参叶制剂预处理组各时间点凋亡细胞均有统计学意义。 结论 白花丹参
对脑梗死具有保护作用。
关键词:HSP70;细胞凋亡;白花丹参叶制剂;脑梗死 , 局灶性
中图分类号:R282.71 R743.3 文献标识码:B 文章编号:1672-1349(2005)02-0140-02
热休克蛋白 70(HSP70)是 HSP中最保守和最主要的一类 ,
是目前发现的主要伴侣蛋白之一 ,对细胞损伤具有保护作用 ,是
缺血耐受现象的标志[ 1 , 2] 。有报道 HSP70 表达与神经元凋亡有
联系 ,HSP70 合成增加能减轻细胞凋亡 , 阻止细胞开启自杀途
径 ,而 HSP70 抑制剂能促使细胞凋亡[ 3] , 药物干预能影响
HSP70 在缺血性脑损伤中的表达[ 4] 。 丹参的水溶制剂主要成
分为酚酸类化合物 ,对丹酚酸的研究以往主要集中在其抗氧化 、
清除氧自由基 、抑制脂质过氧化物产生等方面。 其中丹酚酸 B
的抗氧化活性被证明是维生素 E 的百倍甚至千倍[ 5] 。但对白
花丹参 ,尤其是白花丹参叶水溶制剂的分子作用机制的研究 ,国
内外尚未见报道。
1 资料与方法
1.1 实验动物与分组 健康Wistar大鼠 80 只 , 雌雄各半 ,体重
210 g±10 g , 随机分为正常对照组(A 组 , n =5)、假手术组(B
组 , n =5)、单纯局灶性脑梗死组(C 组 , n =45)、白花丹参叶制
剂预处理组(D组 , n =45)。 C 组 、D 组根据光照后时间分 3 h 、6
h 、12 h 、24 h、48 h 、3 d 、4 d 、5 d、6 d共 9 组 ,每组 5 只。白花丹参
叶制剂预处理组于模型制作前连续 6 d 灌服白花丹参叶制剂 ,
每次 3 mL(20 g/ kg),每天 1次。
1.2 实验设备及试剂 ①冷光源:由徐州恒发有限公司研制 ,
型号为 LG—150。金属卤化灯(150 W , 24 V)为发光光源 , 滤去
全部紫外线与红外线 ,投射出单一绿色光束 , 波长为(560±30)
nm ,光导纤维输出口至照射区距离为 1.5 mm , 光束投射中心直
径为 3 mm ,光照强度为 5.6×105cd/ m2 , 照射中心最高温度为
27 ℃。 ②玫瑰红(Rose Bengal , RB)和伊文思兰(Evens Blue , EB)
从美国 Sigma公司购买。 ③HSP70 单克隆抗体 、SABC 及 DAB
试剂盒从美国 Santa Cruz 公司购买。 ④原位细胞凋亡检测试剂
盒由 Sino-American Biotechnology Co 购买。 ⑤image-proplus
·140· CHIN ESE JOURNAL OF INTEGRA TIVE M EDICINE ON CARDIO-/CEREBROVASCU LAR DISEASE Feb ruary 2005 Vo1.3 No.2
软件系统分析。
1.3 局灶性脑梗死模型的制备 根据 Waston 等[ 6]的方法进行
改进 ,室温 25 ℃条件下 , 水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔麻醉 , 立体
定位仪固定大鼠头部 ,常规消毒后 , 沿头正中切口分离至暴露完
整的颅骨。以矢状缝右侧 3 mm 、冠状缝后 3 mm 为中心 , 用牙
科平钻开直径约 6 mm 的骨窗 , 去除颅骨表层骨板 ,保留下层骨
板及硬脑膜。经股静脉缓慢注入 5%玫瑰红(50 mg/kg), 5 min
后用冷光源照射骨窗 10 min。分时间点断头取脑 , 处死前 1 h
注射 1%伊文思兰 1 mL。按要求处死时间麻醉大鼠 ,经心脏行
主动脉插管 , 先用 4 ℃生理盐水 200 mL 灌注至右心耳流出液
清澈 ,再用 4%多聚甲醛 200 mL内固定 20 min后取脑。
1.4 观测指标 切片观察脑组织经 6 h 4%多聚甲醛后固定 ,
10%、20%、30%蔗糖梯度脱水 , 制作 8 μm 的冷冻切片进行
HSP70 的免疫组化 、TUNEL 染色。阳性反应的细胞定量采用
image-proplus软件系统 , 每个时间点随机选取 5 张切片 , 选取
25 个 400 倍视野计数。
1.5 统计学处理 数据用均数±标准差(x ±s)表示 , 组内比
较采用单因素方差分析 ,组间比较采用 t 检验。应用SPSS 10.0
软件进行处理。
2 结 果
2.1 一般情况 大鼠灌药 3 d 后 ,较对照组出现明显的嗜睡现
象 ,活动减少。模型制作过程中大鼠生命体征稳定 , 各试验组无
明显的差异。心率(261±42)/min , 呼吸(68±24)/ min , 无缺氧
征象 , 肛温(36.8 ~ 37.2)℃, 照射局部颅骨表面温度(38.0 ~
38.8)℃。 D组麻醉时间较 C 组延长。麻醉清醒后 , 精神萎靡 ,
活动及摄食减少 ,但均无明显肢体瘫痪。
2.2 血脑屏障及梗死灶观察 大脑皮质光照区在光照后各时
间点均可见明显的红染区 ,其周围可见蓝染区 , 提示光照后血脑
屏障破坏。梗死灶冠状切面呈“碗形” ,尖端指向侧脑室 , 深达皮
质全层 , 同一时间点梗死灶大小一致。梗死灶随时间的延长逐
渐增大 , 而蓝染区呈明显的双峰样改变。白花丹参叶制剂预处
理组上述改变均较单纯局灶性脑梗死组明显减轻。
2.3 HSP70 免疫组化 免疫反应阳性细胞 HSP70 位于细胞浆
内 ,被染成棕黄色 , 具有一定的细胞形态。 免疫组化显示:A 组
和B 组动物各时间点均无 HSP70 免疫反应;C 组 12 h 即有
HSP70 的表达 , 以后逐渐升高 , 48 h 时表达至高峰 , 但阳性反应
仅局限于半暗带;D组与 C 组各时间点相比 ,阳性反应均有明显
的增多。
2.4 TUNEL 染色 A 组和 B 组未发现凋亡细胞;C 组 6 h 在
半暗区凋亡细胞出现 ,以后逐渐升高 , 3 d 达高峰 ,坏死中心无凋
亡细胞出现;D组凋亡细胞亦仅局限于半暗带区 ,与 C 组相应时
间点相比均有显著性下降。
3 讨 论
通过用光化学法诱导血栓形成的原理模拟了人类脑血栓形
成的过程 ,可瞬间产生大量的氧自由基 , 造成严重的血管内皮损
伤 ,短时间光照区内血管发生完全血栓性堵塞 , 形成局灶性脑梗
死[ 6] 。
观察发现 ,白花丹参组大鼠模型制作前有明显的嗜睡现象 ,
麻醉后清醒时间较对照组亦明显延长 ,提示白花丹参叶水溶剂
可能具有一定的安定作用 , 这将为镇定安神促进睡眠的中药研
发提供机会。
HSP是各种有机体在遭受应激刺激后诱导产生的一组应
激蛋白 ,HSP70 是 HSP中最保守和最主要的一类 , 正常大鼠脑
内不存在 , 但可被脑缺血 、脑缺氧等各种损伤迅速诱导。HSP70
的过度表达能保护神经元免于热应激和缺血应激[ 1] , HSP70 对
神经元的保护作用已经在离体实验中证实[ 7] 。有研究表明[ 8] ,
HSP70 合成增加能减轻细胞凋亡 , 阻止细胞开启自杀途径 , 而
HSP70 抑制剂能促使细胞凋亡。本研究结果显示:HSP70 和细
胞凋亡仅局限于皮质半暗带 , 细胞凋亡的高峰发生于脑梗死后
3 d , 而 HSP70 的表达高峰在梗死后 48 h , 早于细胞凋亡 , 故可
推测 HSP70 表达是损伤应激的标志 , 在损伤相对轻的神经元中
表达更显著 , 其表达可能更有益于蛋白合成的部分恢复。
丹参的水溶制剂主要成分为酚酸类化合物 , 对丹酚酸的研
究以往主要集中在其抗氧化 、清除氧自由基 、抑制脂质过氧化物
产生等方面 , 本研究结果表明:白花丹参叶制剂预处理后局灶性
脑梗死的梗死灶明显减小 , 血脑屏障破坏减轻 , 神经元缺血变性
减轻 , HSP70表达增加 , 凋亡细胞减少。预防性应用白花丹参
叶制剂可减轻局灶性脑梗死的脑损害 , 此效应的产生可能与其
增加了 HSP70 的表达 、减轻细胞凋亡有关。
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作者简介:王贤军(1975—),男 , 毕业于山东省临沂医学专科高等学校 ,
在读硕士研究生 ,现工作于山东省泰山医学院脑微循环研究所(邮编:
271000);夏青 ,工作于北京大学药学院;蔡洪信 ,工作于山东省泰山医学
院脑微循环研究所;杨琳 ,工作于山东省泰山医学院附属医院;夏作理 ,
工作于山东省泰山医学院。
(收稿日期:2004-08-02)
(本文编辑 王雅洁)
·141·中西医结合心脑血管病杂志 2005年 2月第 3卷第 2期