全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 45(1):7-13(2015)
收稿日期:2013-11-17;修回日期:2014-09-25
基金项目:国家自然科学基金项目(31260424) ;公益性行业(农业)科研专项(201103018) ;“十二五”国家科技支撑计划项目
(2012BAD19B06-07)
通讯作者:陈绵才，研究员，主要从事植物病理学研究;E-mail:miancaichen@ 163． com
第一作者:练冬梅，女，福建永安人，在读硕士生，主要从事植物病原线虫研究;E-mail:woshildm1987@ 163． com，Tel:18876178352。
doi:10． 13926 / j． cnki． apps． 2015． 01． 002
象耳豆根结线虫 Hsp70 基因的克隆与原核表达
练冬梅1，2，王会芳2，赵志祥2，陈绵才2*
(1海南省农科院农业环境与植物保护研究所 /海南省植物病虫害防控重点实验室，海口 571100;
2 海南大学环境与植物保护学院，海口 571101)
摘要:采用 ＲT-PCＲ、cDNA 末端快速扩增法(ＲACE) ，克隆了象耳豆根结线虫 Hsp70 基因的全长 cDNA(MeHsp70)序列。
MeHsp70 cDNA 全长 2 203 bp，含有 1 959 bp 的开放阅读框，编码 653个氨基酸，相对分子量为 71． 09 kDa，具有 3 段 Hsp70 家
族的签名序列，GenBank 登录号 KF739434。同源性分析表明，氨基酸序列与其他真核生物的 Hsp70 序列具有很高的相似性。
该 Hsp70与其他物种中的 Hsp70进行系统进化分析，结果显示，Hsp70的系统发育树不能体现物种间的亲缘关系，推测其反映的
是不同物种间 Hsp70 生物学功能的相似性程度。构建了一个原核表达载体 pEASY-E1-MeHsp70，当 IPTG 终浓度为
0． 4 ～ 1． 0 mmol /L时，能诱导表达融合蛋白。MeHsp70基因的克隆和表达，将为象耳豆根结线虫的生态适应性机理研究提供依据。
关键词:象耳豆根结线虫;Hsp70;克隆;表达
Cloning and prokaryotic expression of Hsp70 from Meloidogyne enterolobii LIAN
Dong-mei1，2，WANG Hui-fang2，ZHAO Zhi-xiang2，CHEN Mian-cai2 (1 Institute of Environment ＆ Plant Protec-
tion，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests ，Haikou
571100，China;2Environment and Plant Protection College，Hainan University，Haikou 571101，China)
Abstract:The full length cDNA (MeHsp70)of Hsp70 from Meloidogyne enterolobii was cloned by using
ＲT-PCＲ，rapid amplification of cDNA ends (ＲACE)． The full-length cDNA of MeHsp70 was 2 203 bp
containing an open reading frame (OＲF)of 1 959 bp encoding a polypeptide of 653 amino acids with a predic-
ted molecular mass of 71． 09 kDa，which carried three important and intact Hsp70 signature sequences，which
was registered in GenBank with accession No． KF739434． The result of sequence similarity-analysis revealed
that the translated molecules showed high homology to other eukarya． The Hsp70s phylogenetic analysis showed
that the phylogenetic tree could not reflect the genetic relationship of the organisms，maybe similarity of biologi-
cal functions was revealed． The complete OＲF encoding MeHsp70 was inserted into pEASY-E1 and an expres-
sion vector pEASY-E1-MeHsp70 was constructed． The MeHsp70 protein was induced to express by 0． 4-1． 0
mmol /L IPTG． This study provided theoretical basis supporting research on mechanisms of the ecological adapt-
ability of M． enterolobii．
Key words:Meloidogyne enterolobii;Hsp70;cloning;expression
中图分类号:S432． 45 文献标识码:A 文章编号:0412-0914(2015)01-0007-07
象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)最
早于 1983 年由杨宝君等在海南儋州的象耳豆树上
发现并鉴定和命名［1］。M． enterolobii 在全球农作
物中已经成为一种经济上重要的寄生线虫［2，3］。
植物病理学报 45 卷
该线虫在美洲、非洲、欧洲等均有分布，为世界上公
认的危害最大的根结线虫之一。近年来，M． enter-
olobii 的迅速传播也引起了学者的广泛关注，在国
内外，M． enterolobii 也陆续被报道。据调查，在海
南岛主要栽培作物葫芦科蔬菜、茄果类蔬菜、南药
作物和热带果树均已发现有 M． enterolobii 广泛寄
生［4］，同时 M． enterolobii 还可寄生携带 Mi 抗性
基因的番茄和辣椒［5］。通过海南岛茄果类蔬菜根
结线虫种类鉴定，发现 M． enterolobii 种群已进一
步扩散，正在显示出取代南方根结线虫，而成为我
国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。
热激蛋白(Heat shock proteins，Hsps)于 1962
年由遗传学家 Ｒitossa 在研究果蝇唾液腺时被发
现，继而成为众多学者研究植物抗逆性机制的热
点。热激蛋白家族中以 Hsp70 的含量最丰富、结
构和功能最为保守，且充当分子伴侣，高温、干旱、
低温以及重金属离子等各胁迫因子均可诱导其合
成增加［6］，因而成为 Hsps家族中最受关注的对象。
目前，国内外已从旋尾目、杆形目和垫刃目等线虫
中克隆了多个 Hsp70 基因［7］。克隆到 Hsp70 基因
的全长序列，有助于揭示该基因的功能，并通过异
源表达分析蛋白的性质和功能。本研究获得了
M． enterolobii Hsp70 基因的完整编码区序列，同
时将该蛋白原核融合表达到大肠杆菌中，为进一步
揭示 M． enterolobii环境适应机制奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
M． enterolobii原始种群来源于海南省农业科
学院植物保护研究所植物线虫保存圃，在室内用改
进的贝尔曼漏斗法分离得到。
1． 2 方法
1． 2． 1 第一链 cDNA 的合成 采用 Trizol 法提取
M． enterolobii 总 ＲNA，其 ＲNA 沉淀用 20 μL 无
ＲNase水溶解。取 5 μL 总 ＲNA 为模板，以 oligo-
dt为引物，用反转录酶(TaKaＲa PrimeScriptTM II
1st Strand cDNA Synthesis Kit)进行反转录，合成
cDNA第一链。
1． 2． 2 M． enterolobii Hsp70 基因片段的克隆
Hsp70 的氨基酸序列含有多个签名序列及高度保
守区域，合成简并引物 70F 和 70Ｒ(表 1) ，用于扩
增M． enterolobii Hsp70 部分序列。以第一链 cD-
NA 为模板进行扩增，反应参数为:94℃ 预变性
3min;然后 94℃变性 30 s，45℃退火 30 s，72℃延伸
50 s，共 35 个循环;最后 72℃延伸 10 min。PCＲ产
物以1． 2%琼脂糖凝胶电泳检测和分离，用 DNA
回收试剂盒回收后连接到 pEASY-T1 克隆载体中，
转化 Trans1-T1 感受态细胞，挑取阳性单菌落放大
培养，PCＲ 鉴定阳性转化子，挑选阳性克隆送上海
生工生物技术有限公司进行序列测定。
1． 2． 3 ＲACE扩增 根据已分离得到的目的片段
分别设计 5和 3ＲACE 特异性引物 5GSP、5NGSP
和 3GSP(表 1) ，用于 ＲACE反应获得 M． enterolo-
bii Hsp70 基因的全长 cDNA 序列。
以 M． enterolobii总 ＲNA 为模板，利用 ＲLM-
ＲACE GeneＲacerTM Kit(Invitrogen)合成带 3接
头和 5接头的 cDNA 第一链。以带 3接头的
cDNA第一链为模板，3GSP和GeneＲacerTM3Primer
Table 1 Oligo nucleotide-primers-designed in this study
Primer name Primer sequence(5→3)
Amplification of partial
Hsp70 sequence
70F TKGTCACWGTSCCMGCTTAC
70Ｒ GGYTGＲTTＲTCMGAATAGGT
5ＲACE
5GSP CAAAATCTTCGCCTCCAAGGTGAGTGTC
5NGSP TCCAGCATCCTTTGTGGCTTGACG
3ＲACE 3GSP GTGCTCTCCGTCGTCTTCGTACTGCTT
GeneＲacerTM Kit
GeneＲacerTM5Primer CGACTGGAGCACGAGGACACTGA
GeneＲaceTM 5Nested Primer GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA
GeneＲacerTM3Primer GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG
pEASY-E1-MeHsp70
construction
MeF GATGTCTAAAGCTAACGCTG
MeＲ ATCAACTTCTTCAATGGTTG
8
1 期 练冬梅，等:象耳豆根结线虫 Hsp70 基因的克隆与原核表达
为引物，进行 3端的 cDNA 扩增;以带 5接头 cD-
NA 第一链为模板，5GSP 和 GeneＲacerTM 5Primer
进行 5端的 cDNA 扩增，将扩增产物稀释 100 倍以
后，以 5NGSP和 GeneＲaceTM 5Nested Primer 进行
巢式 PCＲ扩增。然后电泳检测，纯化 3和 5ＲACE
PCＲ 产物后再进行连接、转化和测序。测序结果
与核心序列利用 DNAMAN 6． 0 进行拼接，得到
Hsp70 基因的全长 cDNA 序列。
1． 2． 4 序列比对和生物信息学分析 序列同源性
比对和相似性搜索用在线生物学软件 http:/ /
www ． ncbi． nlm． nih． gov /blast进行，多序列比对
采用生物软件 DNAMAN 6． 0，开放阅读框(OＲF)
预测和氨基酸序列分析采用 BioXM 2． 6 生物软
件，Hsp70 进化树采用 MEGA4，以邻位相连法
(Neighbor-Joining，NJ)构建。
1． 2． 5 表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达 以
第一链 cDNA为模板，用引物 MeF和 MeＲ(表 1)扩
增 Hsp70 基因的开放阅读框区域。PCＲ 产物连入
pEASY-E1，连接产物 42℃热激转化到感受态细胞
Transl-T1 中涂板培养(含氨苄青霉素 100μg /
mL) ，挑取单克隆培养，以菌液为模板进行 PCＲ 鉴
定，将阳性克隆送公司测序，并进行序列分析。将
构建好的表达载体 pEASY-E1-Hsp70 转化到感受
态细胞 BL21(DE3)中，涂板培养。挑取转化子接
种于含氨苄青霉素的培养液中振荡培养至菌液 OD
值约为 0． 4 ～ 0． 5 时，加入 IPTG 使终浓度为0． 4、0．
8、1． 0 mmol /L时，37℃振荡培养 3 h 后离心收集菌
体，向收集的菌体中加入 100 μL 1 ×蛋白上样缓冲
液，100℃加热 5 min，将样品取出冷却至室温，离心
后取 8 μL 上清于 8%分离胶和 5%浓缩胶中进行
SDS-PAGE电泳分析。最后将所获得的电泳图片利
用 Quantity One 4． 6． 6软件预测其分子量的大小。
2 结果与分析
2． 1 Meloidogyme enterolobii Hsp70 基因全
长 cDNA 序列的克隆
采用同源克隆的策略，以M． enterolobii cDNA
为模板，用设计的简并引物进行 PCＲ 扩增，结果
获得880 bp 的片段(图 1)。与 GenBank 上已注册
的其他线虫 Hsp70 部分序列进行对比，结果表明，
M． enterolobii Hsp70 部分序列与大豆孢囊线虫
(Heterodera glycines)、马铃薯腐烂茎线虫(Ditylen-
chus destructor )、松 材 线 虫 (Bursaphelenchus
xylophilus)、拟松材线虫(B． mucronatus)Hsp70 部
分序列的同源性分别为 77． 27%、78． 07%、78． 98%、
79． 55%，说明具有较高的同源性。进而通过 ＲACE-
PCＲ技术分别获得 1 385 bp 的3端序列(图 2)和
544 bp的 5端序列(图 3)。最后利用 DNAMAN 6． 0
Fig． 1 ＲT-PCＲ of Meloidogyne enterolobii Hsp70
M:DNA marker2000;Lane 1 and 2:Partical sequence of Hsp70．
Fig． 2 3ＲACE of Meloidogyne enterolobii Hsp70
M:DNA marker2000;Lane 1 and 2:The fragment of 3ＲACE．
Fig． 3 5ＲACE of Meloidogyne enterolobii Hsp70
M:DNA marker2000;Lane 1:The fragment of 5ＲACE．
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植物病理学报 45 卷
软件将相互重叠的 3 段序列进行拼接，得到
2 203 bp的全长 cDNA 序列，并命名为 MeHsp70
(GenBank登录号为:KF739434 )。
2． 2 序列分析
经 BioXM 2． 6 生物软件分析，MeHsp70 全长
cDNA 为 2 203 bp，5末端有 49 bp 的非翻译区，3
末端有 195 bp 非翻译区并含有一个短的 polyA 尾
巴，开放阅读框(OＲF)长度为 1 959 bp，编码 653
个氨基酸，预测编码蛋白质的分子量为 71． 09
kDa，等电点为 5． 29。MeHsp70 氨基酸序列中含有
真核生物 Hsp70 家族蛋白的三个标签序列(9 ～ 16
位的 IDLGTTYS，198 ～ 211 位的 IFDLGGGTFDV-
SIL，335 ～348位的 IVLVGGSTＲIPKVQ)和胞质型 Hsp70
所特有的末端高度保守序列EEVD［8，9］(图4)。与
Fig． 4 Nucleotide and deduced amino acid sequence of Meloidogyne enterolobii Hsp70 cDNA
Lowercase represents 5 and 3 untranslation region;Capital represents translation region，above:nucleotide sequence，
below:amino acid sequence;The initiation codon are overlined;Asterisks mark termination codon;
Signature sequences are indicated bybold;The EEVD motif are framed．
01
1 期 练冬梅，等:象耳豆根结线虫 Hsp70 基因的克隆与原核表达
GenBank中注册的全序列植物寄生线虫 Hsp70 以
及其他代表性真核生物的 Hsp70 基因所推导的氨
基酸序列进行对比，结果表明，MeHsp70 与大豆孢
囊线虫(H． glycines)、马铃薯腐烂茎线虫(D． de-
structor)、松材线虫(B． xylophilus)、拟松材线虫
(B． mucronatus)、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis
elegans)、果蝇(Drosophila melanogaster)和酵母
(Saccharomyce scerevisiae)的 同 源 性 分 别 为
92． 07%、90． 06%、88． 21%、88． 51%、86． 37%、77．
95%和 75． 04%。
2． 3 进化分析
将本研究所获得的 MeHsp70 氨基酸全长序列
与 GenBank 中注册的大豆孢囊线虫(H． gly-
cines)、马铃薯腐烂茎线虫(D． destructor)、马来丝
虫(Brugia malayi)、班氏吴策丝虫(Wuchereria
bancrofti)、和指状腹腔丝虫(Setaria digitata)等真
核生物的 Hsp70，弗氏志贺菌(Shigella flexneri)、鼠
疫杆菌(Yersinia pestis)、大肠杆菌(Escherichia co-
li)等原核生物，采用 MEGA4，以邻位相连法
(Neighbor-Joining，NJ)构建进化树，多序列比对等
参数的设置采用默认设置值(图 5)。结果表明，来
自真核生物的 Hsp70 聚为一支，来自原核生物的
Hsp70 形成另一支;在真核生物中，动物寄生线虫
Hsp70 聚为一支，而同属于植物寄生线虫的松材线
虫(B． xylophilus)、拟松材线虫(B． mucronatus)未
与马铃薯腐烂茎线虫(D． destructor)、M． enterolo-
bii、大豆孢囊线虫(H． glycines)形成一支。
2． 4 目的融合蛋白的表达
重组表达载体质粒的 PCＲ 产物约为 2 kB(图
6) ，进一步通过测序证实 MeHsp70 基因已定向插
入 pEASY-E1 的多克隆位点，且读码框正确无误。
将构建好的重组质粒转化 BL21(DE3)工程菌，进
行工程菌诱导表达 MeHsp70。经 SDS-PAGE 分析
(图 7) ，与空载体相比，IPTG 终浓度为 0． 4、0． 8、
1． 0 mmol /L时，能显著诱导重组质粒表达出约 71
kDa左右的融合蛋白，其分子量经 Quantity One
4． 6． 6软件预测，结果为 71． 00 kDa，说明 MeHsp70
融合蛋白表达成功。
Fig． 5 Phylogenetic tree of Hsp70 from different species
The speciesnames and the GenBank Accession numbers of different Hsp70s:Heterodera glycines(AAN78300) ，Ditylenchus
destructor(AEP19214) ，Bursaphelenchus xylophilus(ABG74349) ，B． mucronatus(ACU00685) ，B． malayi(XP_001900197) ，
Wuchereria bancrofti(AAF32254) ，S． digitata(AAD13154) ，Caenorphabditis elegans(AAA28078) ，Yersinia pestis(NP_671003) ，
Shigella flexneri(NP_705973) ，C． koseri(YP_001454892) ，E． coli(YP_001456799) ，C． briggsae(XP_002632429) ，
D． medinensis(ADI54942) ，C． curvatus(CAA72797)． The values of branches represent evolutionary distance．
11
植物病理学报 45 卷
Fig． 6 Identification of pEASY-E1-MeHsp70
transformant by PCＲ
M:DNA marker2000;Lane 1-3:Transformant．
Fig． 7 Detecting the pEASY-E1-MeHsp70
expression in prokaryotic cell by
SDS-PAGE
M:Protein marker;0: pEASY-E1 induced for 3 h with
1． 0 mmol /L IPTG;1，2 and 3:pEASY-E1-MeHsp70 induced
for 3 h with 0． 4，0． 8 and 1． 0 mmol /L IPTG，respectively．
3 讨论
Hsp70 是所有原核生物和真核生物在发育过
程中为了适应不同环境而合成起关键作用的蛋白
质家族。试验首次克隆了 M． enterolobii 的 Hsp70
基因，其在氨基酸水平上与其他线虫的同源性均在
80%以上，具有较高的同源性，这证实了 Hsp70 基
因在不同的生物中具有很强的保守性。研究发现，
在 C． elegans 中，当温度从 25℃ 升到 33℃ 后，
Hsp70 能够迅速增加 2 倍多［10］。在 B． malayi 的
三龄幼虫中，当温度从 28℃升到 42℃后，45 min内
Hsp70 增加了 2 倍多，与 37℃高温诱导上调程度一
样，而且随着高温处理时间的延长继续增加［11］。
因此，MeHsp70 的克隆将为我们进一步研究 M．
enterolobii 适应温度逆境的机制开辟了一条途径。
该研究还将克隆得到的 MeHsp70 基因转化到表达
载体中，发现浓度为 0． 4 ～ 1． 0 mmol /L 的 IPTG 均
能显著诱导目的蛋白的融合表达，重组蛋白的表达
将更有利于有关 MeHsp70 基因及其产生蛋白的相
关性质和功能研究。同时，MeHsp70 基因的克隆
也有利于线虫与寄主植物的互作机制的研究。
以不同物种间的 Hsp70s 为研究对象，分析了
Hsp70 系统进化关系。结果显示，以 Hsp70 为对象
构建的物种系统进化树不能很好的反映物种间的
亲缘关系:虽然 Hsp70 能够将真核生物、原核生
物、动物寄生线虫具为一支，但同属于植物寄生线
虫的 B． xylophilus、B． mucronatus 未与 D． destruc-
tor、M． enterolobii、H． glycines 形成一支，而是另
成一支(图 4) ，这与以核糖体 ITS 序列建立的植物
寄生线虫系统进化分析结果不符［12］。由于 Hsp70
是多基因家族，且具有生物学功能的多样性，可以
推测以 Hsp70 构建系统进化树的分析结果并非反
映了物种间的亲缘关系，而是 Hsp70 功能相似性
的分析。
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责任编辑:曾晓葳
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