全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员圆袁圆远渊源冤院园远源愿 耀 园远缘缘允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员圆冤园源鄄园远源愿鄄园愿
铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系构建及优化
赵瑞强摇 高燕会摇 章晓玲摇 斯金平
渊浙江农林大学 辕亚热带森林培育国家重点实验室培育基地袁天然药物研究开发中心袁浙江 临安摇 猿员员猿园园冤
摘摇 要院采用正交设计和单因素试验相结合的方法袁对铁皮石斛的 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反应中 缘 个因素渊阅晕粤 模
板尧酝早圆 垣 尧凿晕栽孕泽尧栽葬择 酶和引物冤进行优化试验遥 建立了适合铁皮石斛既稳定且多态性高的 杂悦燥栽鄄孕悦砸
的最佳反应体院圆园滋造 孕悦砸 反应体系中含有 员 伊 月怎枣枣藻则尧猿园灶早 阅晕粤 模板尧圆郾 缘皂皂燥造窑蕴 原员酝早圆 垣 尧园郾 员缘皂皂燥造窑
蕴 原员 凿晕栽孕泽尧员郾 缘哉 栽葬择 阅晕粤 聚合酶和 园郾 源滋皂燥造窑蕴 原员引物遥 对铁皮石斛的 杂悦燥栽鄄孕悦砸 最佳反应体系的退
火温度进行梯度试验袁发现本试验引物 杂远 的退火温度为 缘源郾 缘益袁且最适退火温度因引物而异遥 这一优
化的 杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系在 猿圆 份铁皮石斛材料的验证中表现出良好的稳定性和重复性遥 该优化的
杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系为进一步进行铁皮石斛种质鉴定尧遗传图谱构建尧基因定位和遗传多样性的分析奠
定了技术基础遥
关键词院铁皮石斛曰杂悦燥栽曰正交设计曰单因素试验曰 体系优化
耘杂栽粤月蕴陨杂匀酝耘晕栽 粤晕阅 韵孕栽陨酝陨在粤栽陨韵晕 韵云 杂悦燥栽鄄孕悦砸 砸耘粤悦栽陨韵晕
杂再杂栽耘酝 云韵砸 阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻
在匀粤韵 砸怎蚤鄄择蚤葬灶早摇 郧粤韵 再葬灶鄄澡怎蚤摇 在匀粤晕郧 载蚤葬燥鄄造蚤灶早摇 摇 杂陨 允蚤灶鄄责蚤灶早
渊粤 晕怎则贼怎则蚤灶早 杂贼葬贼蚤燥灶 枣燥则 贼澡藻 杂贼葬贼藻 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 杂怎遭贼则燥责蚤糟葬造 杂蚤造增蚤糟怎造贼怎则藻袁 砸藻泽藻葬则糟澡 葬灶凿 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 悦藻灶贼藻则 枣燥则 晕葬贼怎则葬造 酝藻凿蚤糟蚤灶藻袁
在澡藻躁蚤葬灶早 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 葬灶凿 云燥则藻泽贼则赠 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 蕴蚤灶爷葬灶袁 在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员员猿园园冤
粤遭泽贼则葬糟贼院韵则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶 葬灶凿 泽蚤灶早造藻 枣葬糟贼燥则 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼 凿藻泽蚤早灶 憎藻则藻 葬责责造蚤藻凿 枣燥则 燥责贼蚤皂蚤扎蚤灶早 枣蚤增藻 枣葬糟贼燥则泽渊 阅晕粤 贼藻皂责造葬贼藻袁
酝早圆 垣 袁 凿晕栽孕泽袁 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻 葬灶凿 责则蚤皂藻则冤 蚤灶 贼澡藻 杂悦燥栽鄄孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 燥灶 阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻援 栽澡藻
则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 葬 泽葬贼蚤泽枣葬糟贼燥则赠 杂悦燥栽 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 枣燥则 阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻 憎蚤贼澡 凿藻泽蚤则葬遭造藻 则藻责藻葬贼葬遭蚤造蚤贼赠 葬灶凿
责燥造赠皂燥则责澡蚤糟 遭葬灶凿泽 憎葬泽 藻泽贼葬遭造蚤泽澡藻凿援 陨灶 葬 贼燥贼葬造 增燥造怎皂藻 燥枣 圆园滋造 杂悦燥栽鄄孕悦砸 泽赠泽贼藻皂袁 蚤贼 糟燥灶贼葬蚤灶藻凿 员 伊 月怎枣枣藻则袁 猿园灶早 阅晕粤
贼藻皂责造葬贼藻袁 圆郾 缘皂皂燥造窑蕴 原员酝早圆 垣 袁 园郾 员缘皂皂燥造窑蕴 原员 凿晕栽孕泽袁 员郾 缘哉 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻 葬灶凿 园郾 源滋皂燥造窑蕴 原员 责则蚤皂藻则援 栽澡藻
燥责贼蚤皂葬造 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 燥枣 藻增藻则赠 责则蚤皂藻则 枣燥则 杂悦燥栽鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 憎葬泽 责则燥责燥泽藻凿 遭赠 早则葬凿蚤藻灶贼 孕悦砸袁 葬灶凿 蚤贼 憎葬泽 枣燥怎灶凿
贼澡葬贼 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 责则蚤皂藻则泽 澡葬凿 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻援 粤泽 枣葬则 葬泽 责则蚤皂藻则 杂远 憎葬泽 糟燥灶糟藻则灶藻凿袁 贼澡藻 燥责贼蚤皂葬造 葬灶灶藻葬造蚤灶早
贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 憎葬泽 缘源郾 缘益 援 栽澡藻 燥责贼蚤皂葬造 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 憎葬泽 枣怎则贼澡藻则 增藻则蚤枣蚤藻凿 蚤灶 猿圆 阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻 增葬则蚤藻贼蚤藻泽 憎蚤贼澡 早燥燥凿
泽贼葬遭蚤造蚤贼赠 葬灶凿 则藻责藻葬贼葬遭蚤造蚤贼赠援 栽澡蚤泽 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 杂悦燥栽鄄孕悦砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 泽赠泽贼藻皂 憎燥怎造凿 责则燥增蚤凿藻 贼澡藻 遭葬泽蚤泽 枣燥则 早藻则皂责造葬泽皂 藻增葬造怎葬贼蚤燥灶 燥枣
阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻袁 贼澡藻 藻泽贼葬遭造蚤泽澡皂藻灶贼 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟 皂葬责泽袁 早藻灶藻 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 葬灶凿 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 早藻灶藻贼蚤糟 凿蚤增藻则泽蚤贼赠援
运藻赠 憎燥则凿泽院 阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻 运蚤皂怎则葬 藻贼 酝蚤早燥曰 杂悦燥栽曰 燥则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶曰 泽蚤灶早造藻 枣葬糟贼燥则 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼曰 泽赠泽贼藻皂
燥责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶
收稿日期院圆园员员鄄员园鄄员圆摇 接受日期院圆园员圆鄄园员鄄员猿
基金项目院浙江省重大科技专项渊圆园园怨悦员圆园缘怨冤
作者简介院赵瑞强渊员怨愿猿 鄄冤袁男袁河北遵化人袁硕士研究生袁研究方向为药用植物基因工程与遗传改良遥 耘鄄皂葬蚤造院扎则择园源员岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院高燕会渊员怨苑源 鄄冤袁女袁山西霍州人袁博士袁副教授袁主要从事植物基因工程与遗传改良教学和研究工作遥 耘鄄皂葬蚤造院早葬燥赠葬灶澡怎蚤源园愿岳 员圆远援 糟燥皂
摇 摇 铁皮石斛渊阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻 运蚤皂怎则葬 藻贼 酝蚤早燥冤 是我国传统名贵中药材袁具有益胃生津尧滋阴清热等功
愿源远
摇 源 期 铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系构建及优化
效遥 因其独特功效被古人列为中华九大仙草之首袁民
间则称之为救命仙草遥 现代药理研究证明袁铁皮石斛
具有增强免疫力尧消除肿瘤尧抑制癌症等作用袁特别是
对人体肺癌细胞的抑制率高达 苑源郾 苑豫 耀 怨苑郾 圆豫 咱员袁圆暂 遥
近年来袁由于生态破坏和过度开采袁野生铁皮石斛已濒
临灭绝遥 随着市场需求加大袁人工种植铁皮石斛规模
也不断扩大遥 铁皮石斛保健品和药品的大规模开发也
导致了铁皮石斛混淆品的泛滥遥 因此袁亟须建立有效
的铁皮石斛种质鉴别的可靠手段咱 猿暂 遥 近年来袁分子标
记发展迅速袁已应用于石斛属植物的品种鉴定和真伪
鉴别袁如张铭等咱源暂利用 砸粤孕阅标记技术对石斛属的 圆远
个种和金石斛属的 员 个种进行了基因组 阅晕粤 多态性
分析曰白音等咱缘暂利用 粤云蕴孕标记技术对我国 猿愿 种石斛
进行研究袁把铁皮石斛与其他 猿苑 种石斛属植物区别
开曰再怎藻等咱远暂从研究的 源圆 个商业石斛杂交品种中开发
了 员源 个 杂杂砸多态性标记袁并将其用于石斛品种的鉴
定遥 但由于 砸粤孕阅标记的不稳定性尧粤云蕴孕标记的昂贵
和费时尧以及 杂杂砸 标记难开发等袁因此需要开发更好
的分子标记应用于铁皮石斛的遗传多样性和亲缘关
系尧分子标记辅助育种尧真伪鉴别及遗传改良遥
目标起始密码子多态性 渊 泽贼葬则贼 糟燥凿燥灶 贼葬则早藻贼藻凿
责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂袁 杂悦燥栽冤标记是 悦燥造造葬则凿 和 酝葬糟噪蚤造造咱苑暂从水
稻上提出的一种基于单引物扩增反应渊 泽蚤灶早造藻 责则蚤皂藻则
葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 则藻葬糟贼蚤燥灶袁 杂孕粤砸冤的新型分子标记袁是一种
新的目的基因分子标记袁其根据植物基因中的 粤栽郧翻
译起始位点侧翼序列的保守性袁设计单引物并对基因
组进行扩增袁产生偏向候选功能基因区显性多态性标
记袁且操作简单尧多态性丰富袁已成功应用于甘蔗咱愿暂 尧
柑橘咱怨暂 尧龙眼咱员园暂等园艺植物的辅助育种遥 为此袁本研
究以铁皮石斛为试材袁建立适宜的 杂悦燥栽 标记技术体
系袁并将该体系应用于铁皮石斛的品种鉴定尧真伪鉴别
和种质资源的遗传多样性评价袁以期为铁皮石斛的遗
传多样性和亲缘关系尧分子标记辅助育种尧真伪鉴别及
遗传改良提供新的理论和技术支持遥
员摇 材料和方法
员郾 员摇 材料
试验用铁皮石斛收集于浙江尧云南尧湖南尧安徽尧江
西等 缘 省 圆园 多个县渊 市冤 袁包括野生种质尧农家品种
共 员源园 余份袁经斯金平教授鉴定为铁皮石斛袁全部育种
资源均保存于浙江农林大学遗传学科种质资源圃袁取
铁皮石斛幼嫩叶片保存于 原 苑园益冰箱备用遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 铁皮石斛基因组 阅晕粤提取与检测摇 铁皮石斛
基因组 阅晕粤提取方法参照郑泉等咱员圆暂 悦栽粤月方法袁稍有
改进袁所提 阅晕粤用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白仪 哉 原
园园愿韵阅测定其质量和浓度袁于 原圆园益冰箱保存备用遥
员郾 圆郾 圆 摇 杂悦燥栽鄄孕悦砸 扩增 摇 杂悦燥栽 引物 杂远 渊 悦粤粤悦粤鄄
粤栽郧郧悦栽粤悦悦粤悦郧悦冤渊参照 悦燥造造葬则凿 和 酝葬糟噪蚤造造咱苑暂的方法
设计冤袁由南京金斯瑞生物科技有限公司合成袁孕悦砸 扩
增采用 圆园滋造 体系袁反应程序为院怨源益 预变性 缘皂蚤灶曰
怨源益变性 猿缘泽袁缘员益退火 猿缘泽袁苑圆益复性 员郾 缘皂蚤灶袁猿缘 个循
环曰最后 苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 产物经 员郾 园豫琼脂糖凝胶
电泳后咱员猿暂于 郧藻灶藻 郧藻灶蚤怎泽 月蚤燥 陨皂葬早蚤灶早 杂赠泽贼藻皂 渊月蚤燥砸葬凿冤
凝胶成像系统观察拍照遥
员郾 圆郾 猿摇 正交试验设计摇 以铁皮石斛 阅晕粤 为模板袁采
用正交试验设计方法对影响 孕悦砸反应的 缘 因素渊阅晕粤
模板尧酝早圆 垣 尧凿晕栽孕泽尧引物尧栽葬择 阅晕粤 聚合酶冤设置 源 个
不同水平渊表 员冤袁采用 蕴员远渊源缘冤正交试验优化铁皮石斛杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系袁每处理 猿 次重复渊表 圆冤遥
表 员摇 正交试验中 缘 因素 源 梯度水平试验设计
栽葬遭造藻 员摇 阅藻泽蚤早灶 燥枣 枣燥怎则 造藻增藻造泽 憎蚤贼澡 枣蚤增藻 枣葬糟贼燥则泽 蚤灶 燥则贼澡燥早燥灶葬造 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼
水平
造藻增藻造
模板 阅晕粤
贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤渊灶早冤
酝早圆 垣
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
凿晕栽孕泽
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
栽葬择 阅晕粤聚合酶
栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻渊缘哉窑滋造 原员 冤
引物
责则蚤皂藻则泽渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
员 圆园 员郾 园 园郾 员 园郾 缘 园郾 猿
圆 猿园 员郾 缘 园郾 员缘 员郾 园 园郾 源
猿 源园 圆郾 园 园郾 圆 员郾 缘 园郾 缘
源 缘园 圆郾 缘 园郾 圆缘 圆郾 园 园郾 远
员郾 圆郾 源摇 单因素试验摇 根据正交设计试验筛选出的最
优体系设计单因素试验袁对各个因素进行逐一优化
渊见表 猿冤遥
员郾 猿摇 铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸退火温度选择
退火温度是影响 孕悦砸 特异性的重要因素遥 根据
正交试验结果选择最佳反应体系袁对退火温度进行梯
怨源远
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
摇 摇 摇 摇 摇 表 圆摇 杂悦燥栽鄄孕悦砸 正交试验设计表咱蕴员远渊源缘冤暂
栽葬遭造藻 圆摇 韵则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶 贼燥 杂悦燥栽鄄孕悦砸 泽赠泽贼藻皂 咱蕴员远渊源缘冤暂
水平
造藻增藻造
栽葬择 阅晕粤聚合酶
栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻渊缘哉窑滋造 原员 冤
酝早圆 垣
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
凿晕栽孕泽
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
引物
责则蚤皂藻则泽渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
模板 阅晕粤
贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤渊灶早冤
员 园郾 缘 员郾 园 园郾 员 园郾 猿 圆园
圆 园郾 缘 员郾 缘 园郾 员缘 园郾 源 猿园
猿 园郾 缘 圆郾 园 园郾 圆 园郾 缘 源园
源 园郾 缘 圆郾 缘 园郾 圆缘 园郾 远 缘园
缘 员郾 园 员郾 园 园郾 员缘 园郾 缘 缘园
远 员郾 园 员郾 缘 园郾 员 园郾 远 源园
苑 员郾 园 圆郾 园 园郾 圆缘 园郾 猿 猿园
愿 员郾 园 圆郾 缘 园郾 圆 园郾 源 圆园
怨 员郾 缘 员郾 园 园郾 圆 园郾 远 猿园
员园 员郾 缘 员郾 缘 园郾 圆缘 园郾 缘 圆园
员员 员郾 缘 圆郾 园 园郾 员 园郾 源 缘园
员圆 员郾 缘 圆郾 缘 园郾 员缘 园郾 猿 源园
员猿 圆郾 园 员郾 园 园郾 圆 园郾 源 源园
员源 圆郾 园 员郾 缘 园郾 圆缘 园郾 猿 缘园
员缘 圆郾 园 圆郾 园 园郾 员缘 园郾 远 圆园
员远 圆郾 园 圆郾 缘 园郾 员 园郾 缘 猿园
表 猿摇 杂悦燥栽鄄孕悦砸 扩增影响因子的梯度试验
栽葬遭造藻 猿摇 郧则葬凿蚤藻灶贼 藻曾责藻则蚤皂藻灶贼 燥枣 枣葬糟贼燥则泽 蚤灶枣造怎藻灶糟蚤灶早 杂悦燥栽鄄孕悦砸
模板 阅晕粤
贼藻皂责造葬贼藻 阅晕粤 渊灶早冤 酝早圆 垣 渊 皂皂燥造窑蕴 原员 冤 凿晕栽孕泽渊 皂皂燥造窑蕴 原员 冤 责则蚤皂藻则渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
栽葬择 阅晕粤酶
栽葬择 阅晕粤渊哉冤
员园 圆郾 园 园郾 员 园郾 圆 园郾 缘
圆园 圆郾 圆缘 园郾 员缘 园郾 猿 员郾 园
猿园 圆郾 缘 园郾 圆 园郾 源 员郾 缘
源园 圆郾 苑缘 园郾 圆缘 园郾 缘 圆郾 园
缘园 猿郾 园 园郾 猿 园郾 远 圆郾 缘
图 员摇 铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反应体系正交试验优化结果
云蚤早援 员摇 栽澡藻 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 则藻泽怎造贼泽 燥枣 阅援 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻 杂悦燥栽鄄孕悦砸
度试验遥 试验设置了 员圆 个温度梯度院源源郾 园益尧源缘郾 园益尧
源远郾 猿益尧 源苑郾 远益尧 源怨郾 源益尧 缘员郾 园益尧 缘圆郾 苑益尧 缘源郾 缘益尧
缘远郾 猿益尧缘苑郾 愿益尧缘怨郾 圆益尧远园郾 员益遥 除退火温度不同外袁
反应程序与正交试验设计相同遥
员郾 源摇 数据统计与处理
参照何正文等咱员圆暂的方法袁依据谱带的强弱尧杂带
的多少和背景深浅对每个处理的 猿 个重复依次打分遥
条带数量丰富尧清晰尧稳定的最佳产物记 员远 分袁最差的
计 员 分遥 猿 次重复分别独立统计袁对各个处理的分数
做极差分析和方差分析袁确定最佳反应体系遥
员郾 缘摇 杂悦燥栽标记的通用性验证
选取 猿圆 份铁皮石斛材料对优化的 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反
应体系进行引物通用性验证遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 正交设计直观分析和方差分析
通过分析正交设计试验结果渊图 员冤可知袁扩增结
果因 阅晕粤模板尧酝早圆 垣 尧凿晕栽孕泽尧引物和 栽葬择 聚合酶等用
量搭配组合的不同而存在明显差异遥 从正交试验扩增
园缘远
摇 源 期 铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系构建及优化
电泳图可以看出 员远 个组合均能扩增出条带袁只是条带
数量及条带清晰度有所不同渊图 员冤遥 其中组合 愿 和 员员
扩增的条带分散最好袁也最清晰遥 依据谱带的强弱尧杂
带的多少和背景深浅给 员 耀 员远 处理的 猿 个重复打分袁猿
个重复的平均分依次为 猿尧猿郾 远远苑尧缘尧圆郾 远远苑尧猿郾 远远苑尧
愿郾 远远苑尧缘郾 猿猿猿尧 怨郾 猿猿猿尧 猿郾 远远苑尧 怨郾 猿猿猿尧 员员郾 远远苑尧 员园郾 远远苑尧
圆郾 猿猿猿尧 愿郾 远远苑尧 愿郾 远远苑尧 愿郾 猿猿猿 分遥 利用 韵则蚤早蚤灶愿郾 园 和
杂孕杂杂员猿郾 园 软件分别对正交试验 猿 次重复的 员远 个处理
进行直观分析和方差分析袁结果见图 圆尧表 源 和表 缘遥
表 源摇 正交设计直观分析结果
栽葬遭造藻 源摇 陨灶贼怎蚤贼蚤增藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 则藻泽怎造贼泽 燥枣 燥则贼澡燥早燥灶葬造 凿藻泽蚤早灶
结果
则藻泽怎造贼
模板 阅晕粤
渊灶早冤
酝早圆 垣
渊皂皂燥造窑蕴 原员 冤
凿晕栽孕泽
渊 皂皂燥造窑蕴 原员 冤
栽葬择 阅晕粤聚合酶
渊哉冤
引物 责则蚤皂藻则
渊滋皂燥造窑蕴 原员 冤
运员 猿园郾 猿猿猿 员圆郾 远远苑 猿员郾 远远苑 员源郾 猿猿源 圆苑郾 远远苑
运圆 圆员 猿园郾 猿猿源 圆远郾 远远愿 圆苑 圆苑
运猿 圆远郾 远远苑 猿园郾 远远苑 圆远郾 远远苑 猿缘郾 猿猿源 圆远郾 猿猿猿
运源 圆远郾 远远愿 猿员 员怨郾 远远远 圆愿 圆猿郾 远远愿
噪员 员园郾 员员员 源郾 圆圆圆 员园郾 缘缘远 源郾 苑苑愿 怨郾 圆圆圆
噪圆 苑 员园郾 员员员 愿郾 愿愿怨 怨 怨
噪猿 愿郾 愿愿怨 员园郾 圆圆圆 愿郾 愿愿怨 员员郾 苑苑愿 愿郾 苑苑愿
噪源 愿郾 愿愿怨 员园郾 猿猿猿 远郾 缘缘缘 怨郾 猿猿猿 苑郾 愿愿怨
砸 猿郾 员员员 远郾 员员员 源郾 园园员 苑 员郾 猿猿猿
注院运蚤院表示任一列上水平号为 蚤渊本试验中 蚤 越 员袁圆袁猿 或 源冤时袁所对应的试验结果之和遥 噪蚤院 噪蚤 越 噪蚤 辕 泽袁泽为任一列上各水平出现的次数袁噪蚤 表示任一列
上因素取水平 蚤时所得试验结果之和遥 砸表示极差遥
晕燥贼藻院 运蚤院 憎澡藻灶 蚤 越 员袁圆袁猿袁 燥则 源袁 悦燥则则藻泽责燥灶凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 泽怎皂 燥枣 贼澡藻 贼藻泽贼 则藻泽怎造贼泽援 噪蚤院 噪蚤 越 噪蚤 辕 泽袁泽 则藻责则藻泽藻灶贼 贼澡藻 枣则藻择怎藻灶糟赠 燥灶 葬灶赠 造蚤藻袁 噪蚤 则藻责则藻泽藻灶贼 憎澡藻灶 噪蚤 越 蚤袁 贼澡藻
泽怎皂 燥枣 贼澡藻 贼藻泽贼 则藻泽怎造贼泽援 砸 则藻责则藻泽藻灶贼 则葬灶早藻援
表 缘摇 杂孕杂杂员猿郾 园 方差分析结果
栽葬遭造藻 缘摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 增葬则蚤葬灶糟藻泽 遭赠 杂孕杂杂员猿郾 园
变异来源
增葬则蚤葬灶糟藻 泽燥怎则糟藻
平方和
泽怎皂 燥枣 泽择怎葬则藻泽
自由度
凿枣
均方
皂藻葬灶 泽择怎葬则藻
云值
云 增葬造怎藻
显著性
杂蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼
校正模型 糟燥则则藻糟贼藻凿 皂燥凿藻造 源源愿郾 缘愿猿渊葬冤 员缘 圆怨郾 怨园远 圆郾 愿愿愿 园郾 园园远
截距 蚤灶贼藻则糟藻责贼 圆园缘源郾 园愿猿 员 圆园缘源郾 园愿猿 员怨愿郾 猿愿圆 园郾 园园园
栽葬择 员苑员郾 园愿猿 猿 缘苑郾 园圆愿 缘郾 缘园愿 园郾 园园源
酝早圆 垣 员愿圆郾 源员苑 猿 远园郾 愿园远 缘郾 愿苑猿 园郾 园园猿
凿晕栽孕泽 缘源郾 苑缘园 猿 员愿郾 圆缘园 员郾 苑远猿 园郾 员苑源
引物 责则蚤皂藻则 远郾 怨员苑 猿 圆郾 猿园远 园郾 圆圆猿 园郾 愿愿园
模板 阅晕粤 贼藻皂责造藻贼 阅晕粤 猿猿郾 源员苑 猿 员员郾 员猿怨 员郾 园苑远 园郾 猿苑猿
误差 藻则则燥则 猿猿员郾 猿猿猿 猿圆 员园郾 猿缘源
总计 贼燥贼葬造 圆愿猿源郾 园园园 源愿
校正总和 糟燥则则藻糟贼藻凿 贼燥贼葬造 苑苑怨郾 怨员苑 源苑
晕燥贼藻院葬 院 砸 泽择怎葬则藻凿 越 园郾 缘苑缘 渊葬凿躁怎泽贼藻凿 砸 泽择怎葬则藻凿 越 园郾 猿苑远冤
摇 摇 极差大小反映了该因素对反应体系的影响程度袁
均值大小反映了每个因素各个水平间的差异遥 由图 圆
中 栽葬择 阅晕粤 聚合酶和 酝早圆 垣 不同浓度曲线变化可看
出袁其均值差异较大袁影响较显著袁其余依次为 凿晕栽孕泽尧
阅晕粤模板和引物遥 由表 源 可得出 缘 个因素对 孕悦砸 反
应体系的影响由大到小依次为院栽葬择 阅晕粤 聚合酶 跃
酝早圆 垣 跃 凿晕栽孕泽 跃模板 阅晕粤 跃引物遥
根据 栽葬择 阅晕粤聚合酶各水平均值可知渊图 圆冤袁当
栽葬择 阅晕粤聚合酶为 员郾 缘哉时袁显著高于其他水平袁扩增
结果也最为清晰遥 图 圆 结果表明 酝早圆 垣浓度越大袁效果
越好袁但多重比较分析后袁认为 酝早圆 垣浓度为 圆郾 缘皂皂燥造
窑蕴 原员时最适遥 经过以上分析结果确定正交试验的最
优体系为院酝早圆 垣 浓度 圆郾 缘皂皂燥造窑蕴 原员尧 凿晕栽孕泽 浓度为
园郾 圆皂皂燥造窑蕴 原员尧栽葬择 阅晕粤 聚合酶用量为 员郾 缘哉尧引物浓
度为 园郾 源滋皂燥造窑蕴 原员尧阅晕粤 模板用量 圆园灶早遥
圆郾 圆摇 单因素试验中各因素对铁皮石斛 杂悦燥栽 扩增结
果的影响
阅晕粤 模板用量过大会降低特异性扩增效率袁增加
非特异性产物袁而过少则可能扩增不出条带或条带太
弱不利于分析咱员猿暂 遥 试验结果渊图 猿冤表明袁模板浓度为
员缘远
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
图 圆摇 阅晕粤 尧凿晕栽孕泽尧酝早圆 垣 尧引物和 栽葬择 阅晕粤聚合酶的效应
云蚤早援 圆摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 阅晕粤袁 凿晕栽孕泽袁 酝早圆 垣 袁 责则蚤皂藻则 葬灶凿 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻
图 猿摇 阅晕粤 模板用量和 酝早圆 垣浓度对铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反应的影响
云蚤早援 猿摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 阅晕粤 葬灶凿 酝早圆 垣 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥灶 杂悦燥栽鄄孕悦砸 燥枣 阅援 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻
员园尧圆园尧猿园尧源园 和 缘园灶早 时袁均可获得清晰的扩增条带遥
考虑节约和扩增效果袁圆园滋造 体系中 阅晕粤 模板用量
猿园灶早 最适宜遥
酝早圆 垣是 栽葬择 阅晕粤 聚合酶活性所必需的袁 对反应
有显著影响遥 浓度过低袁 酶的活力降低曰反之袁则催化
非特异性扩增咱员源暂 遥 试验结果表明袁酝早圆 垣浓度为 圆郾 园 耀
猿郾 园皂皂燥造窑蕴 原员时袁均能扩增出较清晰的条带遥 考虑节
约及扩增效果袁圆园滋造 体系中 酝早圆 垣 浓度以 圆郾 缘皂皂燥造窑
蕴 原员为宜遥
凿晕栽孕泽 浓度对铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 扩增效果的影
响如图 源 所示袁凿晕栽孕泽 浓度太低或太高袁扩增的条带都
不清晰遥 因此袁圆园滋造 体系中 凿晕栽孕泽 浓度以 园郾 员缘皂皂燥造
圆缘远
摇 源 期 铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系构建及优化
窑蕴 原员为宜遥
引物是 孕悦砸 反应的原料袁直接影响扩增效果遥 如
图 源 所示袁引物浓度较低时扩增条带较弱袁浓度较高时
扩增的条带模糊袁因此选择 园郾 源皂皂燥造窑蕴 原员为引物最适
浓度遥
从图 源 可知袁栽葬择 阅晕粤 聚合酶用量高低都会影响
扩增效果袁较低或较高时扩增条带较弱遥 故本试验选
择 栽葬择 阅晕粤聚合酶适宜用量为 员郾 缘哉遥
图 源摇 凿晕栽孕泽尧引物和 栽葬择 阅晕粤 聚合酶用量对铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反应的影响
云蚤早援 源摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 凿晕栽孕泽尧责则蚤皂藻则 葬灶凿 栽葬择 阅晕粤 责燥造赠皂藻则葬泽藻 燥灶 杂悦燥栽鄄孕悦砸 燥枣 阅援 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻
圆郾 猿摇 铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸退火温度选择
退火温度是影响 孕悦砸 特异性的重要因素遥 在本
研究的 员圆 个退火温度中袁源源郾 园益尧源缘郾 园益尧源远郾 猿益和
源苑郾 远益扩增的条带少袁背景较弱曰随着退火温度的升
高袁扩增条带数目增加袁背景增强袁如 源怨郾 源益尧缘员郾 园益
和 缘圆郾 苑益扩增条带清晰但扩增条带数较 缘源郾 缘益少袁而
当退火温度上升到 缘远郾 猿益尧缘苑郾 愿益尧缘怨郾 圆益和 远园郾 员益
扩增条带背景较强袁条带减少袁非特异性条带增多遥 因
此袁以条带清晰尧无特异性条带为依据袁确定本试验的
最佳退火温度为 缘源郾 缘益遥
图 缘摇 退火温度对铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反应的影响
云蚤早援 缘摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 葬灶灶藻葬造蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 燥灶 杂悦燥栽鄄孕悦砸 燥枣 阅援 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻
圆郾 源摇 杂悦燥栽鄄孕悦砸反应体系验证
采用已建立起的最优铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反应体
系对 猿圆 份铁皮石斛材料进行扩增袁结果见图 远袁猿圆 份
材料扩增条带都非常清晰袁多态性丰富袁特异性强袁说
明该优化体系适合于铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 的差异分析
和遗传多样性分析遥
猿摇 讨论
猿郾 员摇 杂悦燥栽鄄孕悦砸的影响因素
目前基于 孕悦砸 扩增的分子标记发展较快且应用
广泛袁而 孕悦砸是一个多因素影响的综合反应体系遥 如
孕悦砸扩增反应中的变性尧复性尧延伸的温度和时间袁反
摇 摇
应过程的循环次数袁以及反应体系中的不同试剂浓度袁
如模板 阅晕粤的用量尧酝早圆 垣 尧栽葬择 阅晕粤聚合酶尧凿晕栽孕泽和
杂悦燥栽引物的浓度等许多因子都会对扩增反应过程和
结果产生影响袁因此要保证铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 试验
结果的稳定性尧重复性和可信性袁因此针对 孕悦砸 扩增
反应的 缘 要素及试验条件进行反应体系的优化咱员缘袁员远暂 遥
优化 孕悦砸反应体系的方法很多袁许多研究者采用正交
试验设计和单因素试验相结合的方法对 孕悦砸 反应体
系进行优化袁正交试验设计综合考虑了各因素及其交
互作用袁能以较少的试验次数得到较多的信息咱员苑 耀 员怨暂 遥
单因素试验操作简单袁能够对每个因素逐项优
化咱圆园袁圆员暂 遥
猿缘远
核摇 农摇 学摇 报 圆远 卷
图 远摇 猿圆 份铁皮石斛材料的 杂悦燥栽鄄孕悦砸 扩增结果
云蚤早援 远摇 杂悦燥栽鄄孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 则藻泽怎造贼泽 燥枣 猿圆 阅援 燥枣枣蚤糟蚤灶葬造藻 增葬则蚤藻贼蚤藻泽
酝院阅蕴猿园园园 皂葬则噪藻则
摇 摇 本研究采用正交试验设计和单因素试验相结合的
方法对铁皮石斛 杂悦燥栽鄄孕悦砸 反应体系进行了优化袁通
过直观分析和方差分析结果表明袁试验中 缘 个因素对
孕悦砸反应体系的影响由大到小依次为院栽葬择 阅晕粤 聚合
酶 跃 酝早圆 垣 跃 凿晕栽孕泽 跃模板 阅晕粤 跃引物袁在一定范围内
引物尧凿晕栽孕泽浓度尧阅晕粤 模板用量对铁皮石斛 杂悦燥栽 扩
增结果无显著影响袁而 栽葬择 阅晕粤 聚合酶浓度和 酝早圆 垣
浓度影响显著遥 单因素试验结果表明不同 酝早圆 垣浓度
和 栽葬择 阅晕粤 聚合酶条件袁扩增谱带数量尧亮度和清晰
度差异较大袁其他因子不同浓度下没有明显差异遥 与
张君玉等咱圆圆暂通过直观分析和方差分析优化葡萄 杂糟燥栽
反应体系时确定的关键影响因子不一致遥
猿郾 圆摇 杂悦燥栽标记的通用性
杂悦燥栽 标记是一种新型目的基因分子标记袁具有操
作简单袁重复性好袁能有效产生和性状连锁的标记袁并
且引物可以在物种间通用等优点咱圆圆暂 遥 目前 杂悦燥栽标记
已经在龙眼咱员园暂 尧花生咱圆猿暂 尧葡萄咱圆源暂 尧枇杷咱圆缘暂 尧牡丹咱圆远暂和
棉花咱圆苑暂等作物的遗传多样性研究中应用袁除此之外袁
在甘蔗上应用 杂悦燥栽 标记筛选得到抗寒相关基因咱愿暂 袁
所有这些均表明 杂悦燥栽 标记物种间的通用性很高遥 本
试验在 猿圆 份不同的铁皮石斛材料的研究结果证明了
杂悦燥栽标记在铁皮石斛种质资源的遗传多样性尧种质鉴
定尧遗传图谱构建和基因定位方面的可行性遥
参考文献院
咱 员 暂摇 国家药典委员会编援 中国药典援 一部咱 杂暂援 北京院中国医药科技
出版社袁 圆园员园院 圆远缘
咱 圆 暂摇 国家环境保护局袁 中国科学院植物研究所援 中国珍稀濒危保护
植物名录咱酝暂援 北京院 科学出版社袁 员怨愿苑
咱 猿 暂摇 谢明璐袁 侯北伟袁 韩摇 丽袁 马艳红袁 丁小余援 珍稀铁皮石斛 杂杂砸
标记的开发及种质纯度鉴定咱允暂 援 药学学报袁 圆园员园袁 源缘 渊缘冤院 远远苑
原 远苑圆
咱 源 暂摇 张摇 铭袁 黄华荣袁 廖苏梅援 石斛属 砸粤孕阅 分析及鉴定铁皮石斛
的特异性引物设计咱允 暂 援 中国中药杂志袁 圆园园员袁 圆远渊苑冤 院 源源圆 原
源源苑
咱 缘 暂 摇 白摇 音袁 包英华袁 王全文援 国产石斛属植物亲缘关系的 粤云蕴孕 分
析咱允 暂 援园艺学报袁 圆园园苑袁 猿源 渊远冤 院 员缘远怨 原 员缘苑源
咱 远 暂摇 再怎藻 郧 匀袁 蕴葬皂 糟澡葬灶 蕴 栽袁 匀燥灶早 再援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 泽蚤皂责造藻 泽藻择怎藻灶糟藻
则藻责藻葬贼 渊杂杂砸冤 皂葬则噪藻则泽 葬灶凿 贼 澡藻蚤则 怎泽藻 蚤灶 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 阅藻灶凿则燥遭蚤怎皂
增葬则蚤藻贼蚤藻泽 咱允 暂 援 酝燥造藻糟怎造葬则 耘糟燥造 晕燥贼藻泽袁 圆园园远袁 远 院 愿猿圆 原 愿猿源
咱 苑 暂摇 悦燥造造葬则凿 月 悦 再袁 酝葬糟噪蚤造造 阅 允援 杂贼葬则贼 糟燥凿燥灶 贼葬则早藻贼藻凿 渊 杂悦燥栽 冤
责燥造赠皂燥则责澡蚤泽皂院 葬 泽蚤皂责造藻袁灶燥增藻造 阅晕粤 皂葬则噪藻则 贼藻糟澡灶蚤择怎藻 枣燥则 早藻灶藻则葬贼蚤灶早
早藻灶藻鄄贼葬则早藻贼藻凿 皂葬则噪藻则泽 蚤灶 责造葬灶贼泽咱 允暂 援 孕造葬灶贼 酝燥造 月蚤燥造 砸藻责袁 圆园园怨袁圆苑
渊员冤院 愿远 原 怨猿
咱 愿 暂摇 陈香玲袁李杨瑞袁杨丽涛袁 吴建明袁 罗摇 聪袁 熊前发袁 杨摇 柳援 低
温胁迫下甘蔗抗寒相关基因的 糟阅晕粤鄄杂悦韵栽 差异显示咱 允暂 援 生物
技术通报袁圆园员园袁 愿院 员圆园 原 员圆源
咱 怨 暂摇 蒋巧巧袁 龙桂友袁 李武文袁 邓子牛援 杂悦燥栽 结合克隆测序鉴别湖
南甜橙变异类型咱允暂 援 中国农学通报袁 圆园员员袁圆苑渊远冤院员源愿 原 员缘源
咱员园暂摇 陈摇 虎袁 何新华袁 罗摇 聪袁 朱建华袁 李摇 峰援 龙眼 圆源 个品种的
杂悦燥栽 遗传多样性分析咱允暂 援 园艺学报袁 圆园员园袁 猿苑渊员园冤 院 员远缘员 原
源缘远
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员圆袁圆远渊源冤院园远源愿 耀 园远缘缘
员远缘源
咱员员暂摇 陈香玲袁 李杨瑞袁 杨丽涛袁 吴建明袁 熊前发袁 罗 摇 聪援 糟阅晕粤鄄
杂悦韵栽基因差异表达两种电泳方法的比较研究咱 允暂 援 生物技术通
报袁 圆园员园袁员园院 怨猿 原 怨缘
咱员圆暂摇 何正文袁 刘运生袁 陈立华袁 曹美鸿袁 夏家辉援 正交设计直观分析
法优化 孕悦砸条件咱允暂 援 湖南医科大学学报袁 员怨怨愿袁 圆猿渊源冤院 源园猿 原
源园源
咱员猿暂摇 司 摇 鹏袁 戴洪义袁 薛华柏袁 张玉刚袁 郭俊英袁 曹尚银援 苹果
杂砸粤孕鄄孕悦砸反应体系的建立咱允暂 援果树学报袁圆园员园袁 圆苑渊圆冤院 员远愿 原
员苑猿
咱员源暂摇 袁长青袁 李摇 平袁 李君文援 孕悦砸 反应条件的优化咱允暂 援 中国公共
卫生袁员怨怨怨袁 员缘渊猿冤院 圆缘缘 原 圆缘远
咱员缘暂摇 宣摇 朴袁 邓摇 婧袁 陈摇 新袁尹春蓉袁陈 放援 苦瓜 陨杂杂砸扩增条件优
化的研究咱允暂 援 核农学报袁 圆园园远袁 圆园渊猿冤院 圆员缘 原 圆员苑
咱员远暂摇 时摇 剑袁 童再康袁 黄华宏袁 刘志高袁 彭沙沙袁 周厚君援 中国石蒜
杂杂砸体系的建立及性状对应分析咱允暂 援 园艺学报袁 圆园员员袁 猿愿渊猿冤院
缘苑员 原 缘苑愿
咱员苑暂摇 倪星群袁 郭景元袁 夏家辉袁 李麓芸袁 何小轩援 利用正交试验设计
确定 孕悦砸最适条件咱允暂 援中国卫生统计袁 员怨怨缘袁 员圆渊源冤院缘猿 原 缘缘
咱员愿暂摇 高燕会袁朱玉球袁黄华宏袁张雷凡袁童再康援 杨梅 砸粤孕阅 原 孕悦砸正
交优化体系的研究咱允暂 援 生物技术袁 圆园园远袁员远渊猿冤院缘缘 原 缘愿
咱员怨暂摇 安摇 静袁徐刚标袁申响保袁谷振军袁张玉梅袁储秀云援 杉木 陨杂杂砸鄄
孕悦砸反应体系的正交优化咱允暂 援 中南林业科技大学学报袁 圆园员员袁
猿员渊猿冤院 员缘远 原 员缘怨
咱圆园暂摇 陈摇 虎袁 何新华袁 罗摇 聪袁 高美萍袁 朱建华援 龙眼 杂糟燥栽鄄孕悦砸 反
应体系的优化咱允暂 援 基因组学与应用生物学袁 圆园园怨袁 圆愿渊缘冤院怨苑园
原 怨苑源
咱圆员暂摇 余桂红袁唐克轩袁马鸿翔袁周淼平袁张摇 旭袁任丽娟袁陆维忠援 小
麦 杂杂悦孕分子标记体系的优化咱 允暂 援 核农学报袁 圆园园苑袁 圆员 渊源冤院
猿猿猿 原 猿猿愿
咱圆圆暂摇 熊发前袁 唐荣华袁 陈忠良袁潘玲华袁庄伟健援目标起始密码子多态
性渊杂悦燥栽冤院 一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术
咱允暂 援分子植物育种袁圆园园怨袁苑渊猿冤院远猿缘 原 远猿愿
咱圆猿暂摇 熊发前袁蒋摇 菁袁钟瑞春袁韩柱强袁贺梁琼袁李摇 忠袁庄伟建袁唐
荣华援目标起始密码子多态性渊杂悦燥栽冤分子标记技术在花生属中
的应用咱允暂 援 作物学报袁 圆园员园袁 猿远渊员圆冤院 圆园缘缘 原 圆园远员
咱圆源暂摇 张君玉袁 郭大龙袁 龚摇 莹袁 刘崇怀袁 李摇 猛袁 张国海援 葡萄目标
起始密码子多态性反应体系的优化 咱 允暂 援 果树学报袁圆园员员袁圆愿
渊圆冤院 圆园怨 原 圆员源
咱圆缘暂摇 韩国辉袁汪卫星袁向素琼袁边摇 禹袁郭启高袁何摇 桥袁李晓林袁梁
国鲁援 多倍体枇杷 杂悦燥栽 分析体系的建立与优化咱 允暂 援 果树学报
圆园员员袁圆愿渊猿冤院 源猿猿 原 源猿苑
咱圆远暂摇 侯小改袁 王摇 娟袁 贾摇 甜袁 张钰乾袁 候摇 娟袁 李嘉珏援 牡丹 杂悦燥栽
分子标记正交优化及引物筛选咱允暂 援 华北农学报袁 圆园员员袁圆远渊缘冤院
怨圆 原 怨远
咱圆苑暂摇 李正鹏袁 李延春袁 樊洪泓袁 胡能兵袁 凌摇 磊袁 林摇 毅袁 蔡永萍援
棉花遗传多样性 杂悦燥栽和 杂砸粤孕标记的研究及比较分析咱允暂 援 激
光生物学报援 圆园员员袁 圆园渊圆冤院 圆猿远 原 圆源源
渊责任编辑摇 王媛媛冤
缘缘远