全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2012)05 － 1734 － 07
收稿日期:2012 － 03 － 14
基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(桂科攻 11107010-1-
5，桂科攻11107010-2-13)
作者简介:李晓晖(1986 －) ，男，广东番禹人，硕士研究生，研究
方向为药用植物资源与利用，* 为通讯作者，E-mail:hrshao802
@ 163． com
凉粉草遗传多样性的 SCoT和 ISSR分析
李晓晖1，黎颖菁2，黄荣韶1* ，蒋明廉3，王海华4
(1．广西大学农学院，广西 南宁 530004;2．广西壮族自治区优质农产品开发服务中心，广西 南宁 530022;3． 广西壮族自治区食
品药品检验所，广西 南宁 530021;4． 广西壮族自治区南宁食品药品检验所，广西 南宁 530001)
摘 要:采用 SCoT和 ISSR两种分子标记技术对 7 份凉粉草种质资源进行遗传多样性分析。结果显示:筛选出的 8 条 SCoT引物共
扩增出 90 个位点，多态性比率为 83． 33 %，遗传相似系数变化范围为 0． 47 ～ 0． 83;筛选的 10 条 ISSR引物共扩增出 100 个位点，多
态性比率为 70． 0 %，相似系数变化范围为 0． 61 ～ 0． 80。聚类分析结果显示，7 份凉粉草种质资源被分为三大类，两种分子标记的
分类结果基本一致，表明 SCoT和 ISSR两种分子标记均适用于凉粉草种质资源的遗传多样性研究。
关键词:凉粉草;SCoT;ISSR;遗传多样性分析
中图分类号:S647 文献标识码:A
SCoT and ISSR Analysis of Genetic Diversity of Mesona chinensis
LI Xiao-hui1，LI Ying-jing2，HUANG Rong-shao1* ，JIANG Ming-lian3，WANG Hai-hua4
(1Agricultural College，Guangxi University，Guangxi Nanning 530004，China;2． Guangxi High-quality Agricultural Development Services
Center，Guangxi Nanning 530022，China;3． Guangxi Institute for Food and Drug Control，Guangxi Nanning 530021，China;4． Nanning
Institute for Food and Drug Control，Guangxi Nanning 530001，China )
Abstract:The genetic diversity of 7 Mesona varieties was analyzed by SCoT and ISSR． The results showed that a total of 90 loci were genera-
ted by 8 SCoT primer combinations，of which 83． 33 % was polymorphic and the genetic similarity ranged from 0． 47 to 0． 83． As for ISSR，
100 bands were generated by 10 ISSR primers，of which 70 % was polymorphic and the genetic similarity ranged from 0． 61 to 0． 80． Cluste-
ring analysis indicated that 7 individuals of mesona were classified into three groups． Classification results of SCoT and ISSR were basically
identical，and it revealed that the SCoT and ISSR markers could be used for analysis of genetic diversity and identification of genetic variation
of Mesona chinensis．
Key words:Mesona chinensis;SCoT;ISSR;genetic diversity
凉粉草(Mesona chinensis Benth)为唇形科凉粉
草属一年生草本植物［1］，在广西、广东、福建等省区
有分布，以无性繁殖为主，其枝叶水煮煎汁可制成凉
粉、凉茶，深受广大消费者的喜爱。
目标起始密码子多态性(Start codon targeted
polymorphism，SCoT)标记是 Collard 和 Mackill［2］在
水稻研究上提出的一种基于单引物扩增反应(single
primer amplification reaction，SPAR)的新型分子标
记，其原理是根据植物基因中的 ATG翻译起始位点
侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩
增，产生偏向候选功能基因区显性多态性标记，并且
操作简单，多态性丰富，已成功用于柑橘［3］、龙
眼［4］、芒果［5］等园艺植物。 ISSR(Inter-Simple Se-
quence Repeats 简单序列重复区间)分子标记技术
由于其具有多态性高，重复性好等优点［6］，已被广
泛用于植物种质资源的鉴定和遗传多样性研
究［7 ～ 8］。目前对凉粉草的研究多集中于成分的提
取、活性方面［9 ～ 10］的研究及食品开发，对遗传多样
性的研究未见报道。本研究拟通过 SCoT和 ISSR技
术对 7份凉粉草种质进行遗传多样性分析，以期更科
学有效地对凉粉草种质资源进行保护、利用和创新。
1 材料与方法
1． 1 供试材料
于 2010 年从广西、广东、福建等地采集 7 份凉
粉草地方栽培资源，栽培于广西大学农学院试验基
4381
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
2012 年 25 卷 5 期
Vol. 25 No. 5
DOI:10.16213/j.cnki.scjas.2012.05.022
表 1 供试材料及来源
Table 1 Source of tested materials
序号
No．
材料
Materials
引种地 /原产地
Place of collection /origin
1 灵山大叶 Lingshan big leave 广西灵山 Lingshan，Guangxi
2 灵山小叶 Lingshan leaflet 广西灵山 Lingshan，Guangxi
3 下坝仙草 Xiaba Mesona 福建武平 Wuping，Fujian
4 派潭仙草 Paitan Mesona 广东增城 Zengcheng，Guangdong
5 三甲仙草 Sanjia Mesona 广东阳春 Yangchun，Guangdong
6 越南 1 号 Vietnam 1 广西南宁 Naning，Guangxi
7 梧州仙草 Wuzhou Mesona 广西梧州 Wuzhou，Guangxi
地，详细信息见表 1。2011 年 5 月，进行遗传多样性
分析采样，采摘各凉粉草材料的健康幼嫩叶片，－ 70
℃冰箱保存备用。
1． 2 DNA的提取与检测
采用改良的 CTAB法提取叶片基因组 DNA［11］，
用 1． 0 %的琼脂糖电泳检测 DNA 质量，DNA 浓度
通过分光光度计测定，用无菌水稀释至 50 ng /μl，－
20 ℃保存备用。
1． 3 引物筛选及 PCR扩增
80 条 SCoT 引物和 100 条 ISSR 引物均由上海
生物工程有限公司合成，利用梯度 PCR扩增仪筛选
引物及退火温度。
PCR扩增:20 μl 的反应体系，其中 10 × buffer
2． 0 μl，50 ng /μl DNA 1． 0 μl，30 μmol /L引物 1 μl，
4． 0 mmol /L dNTP 0． 5 μl，2． 5 U /μl 的 DNA聚合酶
0． 4 μl，加水至 20． 0 μl。PCR 扩增参数为:94 ℃预
变性 4 min;94 ℃变性 1 min，退火 1 min，72 ℃延伸
2 min，35 个循环;72 ℃延伸 10 min，10 ℃保存。扩
增反应结束后加入 4 μl溴酚蓝混匀，取 6 μl扩增产
物在 1． 5 %琼脂糖凝胶中电泳，电极缓冲液为 1 ×
TAE，染色后用紫外凝胶成像系统照相。
1． 4 数据分析
对 SCoT和 ISSR 标记电泳结果采用人工计带
法，只对清晰可辨的条带进行统计，根据条带的有无
计数，有带计为“1”，无带计为“0”，形成 0 /1 矩阵，
将图形资料转化为数据资料。将整理好的数据按照
NTSYSpc 2． 10e 软件要求的格式输入，首先进行相
似性(Simularity)分析，形成相似系数矩阵，按非加
权组平均法方法进行聚类分析，使用 NTSYSpc 2．
10e 的 Dcenter 模块对 GS 矩阵做中心化处理，得到
主成分分析图。多态性信息量(PIC)采用软件 PIC-
Cale 0． 6 计算。
2 结果与分析
2． 1 凉粉草基因组 DNA的检测
用改良 CTAB法提取样品总 DNA的 OD260 /280值
为 1． 62 ～ 1． 97，经 1． 0 %的琼脂糖电泳检测，样品
DNA为 1 条清晰完整的条带，没有明显的拖尾，也
没有 RNA条带，说明所提的 DNA纯度较高，可直接
用于 SCoT和 ISSR标记分析。
2． 2 SCoT和 ISSR的总 DNA扩增产物多态性的比
较分析
通过引物初筛选试验，从 80 条 SCoT 引物中筛
选出 8 条扩增条带清晰、稳定性好的引物，对 7 份凉
粉草种质进行 PCR 扩增，共在 90 个位点获得扩增
片段，平均每个 SCoT引物扩增的条带为 11． 3 条，其
中多态性位点共 75 条，多态性比率在 62． 5 % ～
100． 0 %之间，多态性比率平均为 83． 33 %(表 2)。
PCR扩增产物的电泳结果显示，8 条引物的扩增条
带在 8 ～ 13 条之间，条带清晰，主带明显，扩增条带
的多态性丰富，片段长度在 100 ～ 2000 bp 之间(图
2) ，其中有 3 条引物的多态性比率达到 100． 0 %。
从 100 条 ISSR引物中筛选出 10 条扩增条带清晰、
稳定性好的引物，共在 100 个位点获得扩增片段，平
均每个 ISSR 引物扩增的条带为 10 条，其中多态性
位点共 70 条，多态性比率在 50 % ～ 77． 78 %之间，
多态性比率平均为 70 %(表 3)。10 条引物的扩增
条带在 8 ～ 15 条之间，条带清晰，主带明显，扩增条
图 1 凉粉草基因组 DNA琼脂糖凝胶电泳检测
Fig． 1 Agarose gel electrophoresis of Mesona genomic DNA
53815 期 李晓晖等:凉粉草遗传多样性的 SCoT和 ISSR分析
带的多态性丰富，片段长度在 100 ～ 2000 bp 之间
(图 2)。SCoT 引物的多态性信息量(PIC)在 0． 70
～ 0． 90 之间，平均值为 0． 84;ISSR 引物的多态性信
息量(PIC)在 0． 64 ～ 0． 87 之间，平均值为 0． 79。
以上结果表明，SCoT 和 ISSR 分子标记均能扩
增出丰富的多态性位点，从多态性比率来看，SCoT
标记高于 ISSR 标记;从多态性信息量来说，两者的
平均 PIC 值都大于 0． 5，达到高度多态，而 SCoT 标
记比 ISSR标记的 PIC 值略大，说明 SCoT 能检测出
更多的多态性遗传位点。
2． 3 遗传相似性分析
利用 NTsyspc 2． 10e 软件对 7 份材料的相似系
数进行统计，得到 SCoT和 ISSR标记的 jaccard 相似
性系数矩阵(表 4，表 5)。结果表明，SCoT 标记的 7
个种之间的相似性系数的变异范围在 0． 47 ～ 0． 83
之间。其中灵山大叶和派潭仙草的相似性系数最
小，数值为 0． 47;三甲仙草和梧州仙草的相似性系
数最大，为 0． 83。ISSR标记的 7 个种之间的相似性
系数的变异范围在 0． 61 ～ 0． 80 之间。其中灵山小
叶和下坝仙草、灵山小叶和派潭仙草这两组的相似
性系数最小，均为 0． 61;三甲仙草和梧州仙草的相
似性系数最大，为 0． 80。
对凉粉草 SCoT、ISSR 标记遗传相似性对比，从
表 6 可以看出，SCoT分子标记的遗传相似性系数的
区间范围略大于 ISSR分子标记，平均遗传相似性系
数小于 ISSR。两相比较，SCoT 分子标记能够检测
到更高的遗传变异。
表 2 8 条 SCoT引物扩增效率及多态性信息量 PIC
Table 2 Amplification efficiency of 8 SCoT primers and PIC
SCoT引物
SCoT primer
引物序列(5’-3’)
Sequences(5’-3’)
总位点数
No． of total bands
多态性位点
No． of polymorphic bands
多态性位点百分数 %
Percentage of
polymorphic
bands(PPB，%)
多态性信息量
Polymorphism
information
content(PIC)
SC16 ACCATGGCTACCACCGAC 17 13 76． 47 0． 90
SC17 ACCATGGCTACCACCGAG 13 12 92． 31 0． 89
SC19 ACCATGGCTACCACCGGC 8 5 62． 50 0． 70
SC23 CACCATGGCTACCACCAG 11 8 72． 73 0． 84
SC24 CACCATGGCTACCACCAT 12 12 100． 00 0． 90
SC25 ACCATGGCTACCACCGGG 9 9 100． 00 0． 85
SC27 ACCATGGCTACCACCGTG 9 9 100． 00 0． 84
SC31 CCATGGCTACCACCGCCT 11 7 63． 64 0． 77
总数 Total 90 75 － －
平均 Average 11． 25 9． 38 83． 33 0． 84
表 3 10 条 ISSR引物扩增效率及多态性信息量 PIC
Table 3 Amplification efficiency of 10 ISSR primers and PIC
ISSR引物
ISSR primer
引物序列(5’-3’)
Sequences(5’-3’)
总位点数
No． of securable bands
多态性位点
No． of polymorphic
bands
多态性位点百分数 %
Percentage of
polymorphic
bands(PPB，%)
多态性信息量
Polymorphism
information
content(PIC)
U817 (CA)8A 9 7 77． 78 0． 78
U822 (TC)8A 10 8 80． 00 0． 85
U834 (AG)8YT 10 7 70． 00 0． 81
U840 (GA)8YT 12 8 66． 67 0． 81
U856 (AC)8YA 9 6 66． 67 0． 77
U868 (GAA)6 8 7 87． 5 0． 82
U873 GA(CAGA)3CA 15 10 66． 67 0． 87
U879 (CTTCA)3 8 4 50． 00 0． 64
U881 (GGGTG)3 9 7 77． 78 0． 80
U899 CATGGTGTTGGTCATTGTTCCA 10 6 60． 00 0． 78
总数 Total 100 70 － －
平均 Average 10 7 70． 00 0． 79
6381 西 南 农 业 学 报 25 卷
M． DL 2000 marker;1 ～ 7．代表的样品名称参见表 1
图 2 SCoT引物(SC19、SC24)和 ISSR引物(U840、U899)扩增产物的电泳图谱
Fig． 2 Electrophoresis pattern amplified with SCoT primers(SC19，SC24)and ISSR primers(U840，U899)
表 4 ISSR标记的 jaccard相似性系数
Table 4 Jaccard similarity coefficient of ISSR
灵山大叶
Lingshan
big leave
灵山小叶
Lingshan
leaflet
下坝仙草
Xiaba
Mesona
派潭仙草
Paitan
Mesona
三甲仙草
Sanjia
Mesona
越南 1 号
Vietnam 1
梧州仙草
Wuzhou
Mesona
灵山大叶 1
灵山小叶 0． 7 1
下坝仙草 0． 71 0． 61 1
派潭仙草 0． 67 0． 61 0． 66 1
三甲仙草 0． 71 0． 75 0． 74 0． 66 1
越南 1 号 0． 73 0． 61 0． 7 0． 64 0． 62 1
梧州仙草 0． 77 0． 77 0． 68 0． 62 0． 8 0． 66 1
表 5 SCoT标记的 jaccard相似性系数
Table 5 Jaccard similarity coefficient of SCoT
灵山大叶
Lingshan
big leave
灵山小叶
Lingshan
leaflet
下坝仙草
Xiaba
Mesona
派潭仙草
Paitan
Mesona
三甲仙草
Sanjia
Mesona
越南 1 号
Vietnam 1
梧州仙草
Wuzhou
Mesona
灵山大叶 1
灵山小叶 0． 666667 1
下坝仙草 0． 755556 0． 6 1
派潭仙草 0． 466667 0． 511111 0． 488889 1
三甲仙草 0． 755556 0． 711111 0． 733333 0． 533333 1
越南 1 号 0． 555556 0． 577778 0． 511111 0． 688889 0． 577778 1
梧州仙草 0． 655556 0． 677778 0． 611111 0． 522222 0． 833333 0． 522222 1
表 6 凉粉草 SCoT、ISSR标记遗传相似性对比
Table 6 The comparison of the similarity correlation on SCoT and ISSR markers
标记
Marker
区间
Range
均值
Mean
标准差
S． D．
变异系数
c． v． %
SCoT 0． 47 ～ 0． 83 0． 62 0． 10 16． 77
ISSR 0． 61 ～ 0． 80 0． 69 0． 058 8． 50
73815 期 李晓晖等:凉粉草遗传多样性的 SCoT和 ISSR分析
2． 4 SCoT和 ISSR标记的聚类分析
根据计算所得的遗传相似性系数，采用 UPGMA
法进行聚类分析，构建聚类图(图 3)。
由图 3 可以看出，在阈值为 0． 68 时，SCoT 标记
将 7 份凉粉草种质分为 3 大类群，第 1 类群有 2 种，
为灵山大叶和下坝仙草;第 2 类群包含 3 种，分别为
8381 西 南 农 业 学 报 25 卷
灵山小叶、三甲仙草、梧州仙草;第 3 类群含有 2 种，
为派潭仙草和越南 1 号。其中三甲仙草和梧州仙草
的相似系数最大，为 0． 83，说明两者的亲缘关系最
近;灵山大叶和派潭仙草的相似系数最小，为 0． 47，
表明两者的亲缘关系最远。
在阈值为 0． 70 时，ISSR 标记将 7 份凉粉草种
质分为 3 大类群，第 1 类群包含三种，为灵山大叶、
越南 1 号和下坝仙草;第 2 类群包括灵山小叶、三甲
仙草、梧州仙草 3 种;第 3 类群为派潭仙草。相似系
数最大的为三甲仙草和派潭仙草(0． 80) ;而灵山小
叶与下坝仙草、派潭仙草、越南 1 号的相似系数均为
0． 61，为最小。
从两种分子标记所得的聚类图中可以看出，除
越南 1 号外，2 种分子标记的分类情况均相同，相似
系数最大的均为三甲仙草和梧州仙草。说明 2 种分
子标记描述凉粉草种质的遗传多样性具有准确性，
能够互为印证。
2． 5 主成分分析
利用 NTsyspc 2． 10e 软件在 EN 式遗传距离下
分别对 SCoT 和 ISSR 分子标记进行 2D 和 3D 主成
分分析(图 4，图 5)。从 SCoT 的主成分分析的 2D
和 3D图(图 4)可以看出，越南 1 号和派潭仙草聚为
一类;下坝仙草和灵山大叶聚为一类;灵山小叶、三
甲仙草和梧州仙草三者聚为一类;结果与 UPGMA
聚类结果相同。从 ISSR的主成分分析 2D 和 3D 图
(图 5)来看，灵山小叶、梧州仙草和三甲仙草聚为一
类;灵山大叶、下坝仙草和越南 1 号聚为一类;派潭
仙草单独为一类，结果也与 UPGMA 聚类结果相同。
从两种分子标记的主成分分析图来看，SCoT 标记的
聚类结果较为直观，聚类效果较好。
图 5 基于 ISSR表型特征的主成分分析(PCA)2D图及 3D图
Fig． 5 2D and 3D maps of principal components analysis based on ISSR phenetic characters
93815 期 李晓晖等:凉粉草遗传多样性的 SCoT和 ISSR分析
3 讨论与结论
据《中国植物志》记载，凉粉草属植物分为小花
凉粉草和凉粉草［12］，前者仅产于云南西部和印度东
北部部分地区，后者在我国南方多数地区均有分布，
推测本试验所采集的样本应属于凉粉草，属于种内
资源。从遗传相似性分析结果来看，SCoT 标记的 7
份凉粉草种质资源之间的相似性系数的变异范围在
0． 47 ～ 0． 83 之间，平均为 0． 62，ISSR 的相似性系数
的变异范围在 0． 61 ～ 0． 80，均值为 0． 69，表明这些
凉粉草种质之间的亲缘关系较远，也说明凉粉草种
内具有较好的遗传多样性。通过 UPGMA 聚类分析
和主成分分析，两种分子标记在越南 1 号和派潭仙
草的分类结果上略有不同，而两种标记结果都反映
出派潭仙草同其他凉粉草种质之间的遗传距离较
大，说明派潭仙草同其他几种凉粉草具有一定的遗
传差异;三甲仙草和梧州仙草在两种分子标记中均
聚为一类，且遗传距离最小，说明两者的亲缘关系最
近，但其地理分布相隔较远，这有可能是由于地区之
间相互引种造成的。对于分子标记聚类分析的结果
与凉粉草种质形态学特征、成分差异是否相关，还有
待于进一步论证。
SCoT标记是根据植物基因中的 ATG 翻译起始
位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进
行扩增，产生偏向候选功能基因区显性多态性标记，
且操作简单，多态性丰富，已成功用于龙眼、芒果等
园艺植物［6 ～ 7］。而 ISSR 分子标记由于其具有成本
低廉、操作简单、重复性强及共显性等优势，已经广
泛应用于植物品种鉴定、遗传多样性等研究中。本
研究利用这两种分子标记技术分别筛选出 8 条
SCoT引物和 10 条 ISSR引物，研究凉粉草种质的遗
传多样性，平均多态性比率分别达到 83． 33 % 和
70． 0 %，表明 SCoT和 ISSR分子标记均能扩增出丰
富的多态性位点。同时聚类结果分析表明，两种分
子标记的分类结果基本一致，说明 SCoT 标记和 IS-
SR标记分析凉粉草遗传多样性是可行的。而 SCoT
分子标记的 PPB的均值和 PIC 的均值都略高于 IS-
SR分子标记，说明 SCoT 分子标记更适合于凉粉草
遗传多样性的研究。本研究首次利用两种分子标记
分析凉粉草种质遗传多样性，为凉粉草种质资源保
护利用奠定了分子标记研究的理论基础。
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(责任编辑 温国泉)
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