全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊愿冤院员猿苑园 耀 员猿苑愿
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员源鄄园员鄄员猿摇 接受日期院圆园员源鄄园源鄄员园
基金项目院北京市自然科学基金项目 渊远员园员园园员 冤袁北京市科技计划课题 渊 在员圆员员园园园园员圆员圆园园圆 冤袁北京市农林科学院科技创新基金 渊 晕燥援
运允悦载圆园员员园员园园员冤
作者简介院李洁琼袁女袁主要从事生防微生物的相关研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 贼泽造躁择员怨愿愿岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院于莉袁女袁教授袁主要从事植物病理学教学和科研工作遥 耘鄄皂葬蚤造院赠怎造蚤圆猿远圆岳 澡燥贼皂葬蚤造援 糟燥皂
刘伟成袁男袁研究员袁主要从事植物病害及其生防微生物研究遥 耘 原 皂葬蚤造院造蚤怎憎蚤糟澡岳 员远猿援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园愿鄄员猿苑园鄄园怨
悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 泽责援 在蕴圆远员蛋白酶基因的克隆尧
表达及其酶学特性
李洁琼员袁圆 摇 张殿朋圆 摇 卢彩鸽圆 摇 吴慧玲圆 摇 于摇 莉员 摇 刘伟成圆
渊员 广东海洋大学农学院袁广东 湛江摇 缘圆源园愿愿曰 圆北京市农林科学院植物保护环境保护研究所袁北京摇 员园园园怨苑冤
摘摇 要院分离自西藏色季拉山海拔 源缘猿园 皂高山草甸土壤的山冈单胞菌渊悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 泽责援 冤在蕴圆远员 代谢产物
具有很高的蛋白酶活性袁为了明确其蛋白酶种类及其作用特点袁本文采用限制性内切酶法构建了菌株
在蕴圆远员 的基因组文库袁利用透明圈法筛选其胞外蛋白酶活性克隆袁对其基因及蛋白结构进行了分析袁进
一步研究了该酶的表达和酶学特性遥 结果表明院该蛋白酶基因渊命名为 糟葬责则燥冤包含一个长为 员园怨圆 遭责 的
完整开放阅读框渊郧藻灶月葬灶噪院运云怨怨圆愿源缘冤袁其编码蛋白由 猿远猿 个氨基酸组成曰序列比对和同源性分析结果
显示袁该氨基酸序列与食真菌山冈单胞菌渊悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 枣怎灶早蚤增燥则葬灶泽冤栽藻则猿猿员 胞外蛋白酶序列渊晕悦园员缘愿缘远冤
相似性最高袁为 愿猿豫 曰一级尧二级和三级结构分析均显示该蛋白含酝猿缘 金属蛋白酶家族渊耘悦 猿郾 源郾 圆源郾 圆园冤
保守结构域遥 蛋白酶基因在大肠杆菌 阅匀缘琢 中异源表达获得了约 猿愿 噪阅葬 的目的蛋白遥 在蕴圆远员 粗酶液
对金属蛋白酶抑制剂 耘阅栽粤敏感袁最适作用 责匀值为 苑袁最适温度 猿园益袁在 员园益时仍保持 苑园豫以上酶活
力遥 综合分析可知袁该蛋白酶为中性低温金属蛋白酶遥 具有较好的开发应用潜能遥 研究结果为微生物
蛋白酶的开发提供了新型种质资源袁也为探求不同生境微生物蛋白酶的系统进化关系提供了基础信息遥
关键词院山冈单胞菌曰蛋白酶曰基因曰克隆与表达
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园愿援 员猿苑园
摇 摇 蛋白酶是一类催化肽链中肽键水解的酶咱员暂 袁已广
泛应用于食品尧医药尧洗涤尧纺织尧制革尧发酵和废物处
理等领域袁其销售份额约占全球用酶的 远园豫 袁是世界
三大工业用酶之一咱圆暂 遥 蛋白酶可通过破坏害虫体壁
和病原真菌细胞壁来抵抗病虫害咱猿暂 袁因此袁也是重要
的病程相关蛋白之一遥 该酶广泛存在于动物内脏尧植
物茎叶尧果实和微生物中袁按其分布不同分为胞内蛋白
酶和胞外蛋白酶袁胞内蛋白酶与细胞内经常发生的蛋
白质分解代谢有关袁胞外蛋白酶是动物和微生物将蛋
白酶分泌到胞外水解蛋白以供其吸收和利用咱源暂 曰根据
活性温度的高低可分为高温蛋白酶渊最适温度 远园益以
上冤 咱缘暂 尧中温蛋白酶渊最适温度 缘园益左右冤和低温蛋白
酶渊最适温度 源园益以下冤 咱远暂 遥
近年来袁随着基因工程尧发酵技术的发展袁蛋白酶
工业得到了飞速的发展袁在世界生产蛋白酶工业中约
有 圆 辕 猿 是依赖微生物发酵生产的袁其中利用最多的是
芽孢杆菌属渊月葬糟蚤造造怎泽冤的细菌咱苑暂 遥 但是袁工业化生产的
大多为中温酶袁其菌株的生长温度为 猿园益以上袁蛋白
酶的最适温度为 源缘 耀 缘园益 咱愿暂 袁极大地限制了蛋白酶在
低温领域的应用袁且低温蛋白酶在低温高效催化尧节省
能源尧热不稳定等方面有着中温蛋白酶无法比拟的优
越性遥 因此袁目前国内外学者已将研究的热点转向寻
找和开发新型微生物低温蛋白酶资源袁以满足日新月
异的工业发展和应用的需求咱怨 原 员员暂 遥
特殊生境微生物长期栖居于极端生态环境中袁独
特的地理尧气候特征造就了其特殊的基因类型尧生理及
代谢机制袁是新型活性产物和先导化合物渊如酶尧抗生
素尧多糖及脂类等冤的潜在优良种质资源库遥 菌株
在蕴圆远员 分离自海拔 源缘猿园 皂的西藏色季拉山草甸土壤袁
经鉴定属于山冈单胞菌属渊悦燥造造蚤皂燥灶葬泽冤袁平板检测其代
园苑猿员
摇 愿 期 悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 泽责援 在蕴圆远员 蛋白酶基因的克隆尧表达及其酶学特性
谢产物具有很高的蛋白酶活性遥 本试验通过构建菌株
在蕴圆远员 基因组文库来筛选其胞外蛋白酶基因并对其进
行了分析尧表达验证及酶学性质研究袁以期为高效微生
物源蛋白酶的研发提供创新型种质资源袁并为其后续
的高产菌种选育尧作用机理研究及其开发应用奠定基
础袁也为探索特殊生境微生物与其它微生物间蛋白酶
的系统进化关系提供理论依据遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 供试菌株
菌株 在蕴圆远员 由北京市农林科学院植物保护环境
保护研究所分离自海拔 源缘猿园 皂 的西藏色季拉高山草
甸土壤中遥
员郾 圆摇 培养基
运月培养基咱员圆暂 曰蕴月 培养基咱员猿暂 曰蛋白酶检测渊重组
子筛选冤培养基院进口脱脂奶粉 员园 早袁琼脂 员缘 早袁去离子
水 员 园园园 皂蕴袁员圆员益灭菌 员缘皂蚤灶遥
员郾 猿摇 主要仪器和试剂
粤郧圆圆猿猿员 型 藻责责藻灶凿燥则枣 孕悦砸 仪渊德国 耘责责藻灶凿燥则枣 公
司冤袁阅运鄄愿阅型电热恒温水浴槽渊上海一恒科技有限公
司冤袁酝杂悦鄄员园园 型恒温混匀仪渊杭州爽盛仪器有限公
司冤袁阅再再鄄远悦型电泳仪渊北京市六一仪器厂冤袁允再鄄杂悦在远
型垂直电泳槽渊上海珂淮仪器有限公司冤袁栽匀在鄄猿园园悦
型恒温培养摇床 渊太仓市华美生化仪器厂冤袁 杂蚤早皂葬
猿运猿园 台式高速冷冻离心机渊德国 杂蚤早葬皂葬公司冤遥
脱脂奶粉购自美国 月阅 化学试剂公司曰月葬皂匀 玉
酶尧责哉悦员员愿 载体购于 栽粤运粤砸粤 公司曰大肠杆菌 阅匀缘琢
感受态细胞袁圆 伊 栽葬择 孕悦砸 酝葬泽贼藻则酝蚤曾尧载鄄早葬造尧陨孕栽郧尧细菌
基因组提取试剂盒渊阅孕猿园圆 原 园圆冤尧琼脂糖凝胶 阅晕粤回
收试剂盒渊阅孕圆园怨 原 园猿冤尧普通质粒小提试剂盒渊阅孕员园猿
原 园猿冤购于 栽陨粤晕郧耘晕 公司袁其他试剂均为国产分析
纯袁试验所涉及引物和测序均由北京中美泰合生物技
术有限公司完成遥
员郾 源摇 菌株蛋白酶活性检测
采用透明圈法咱员源暂 袁菌株 在蕴圆远员 在 运月 平板上划线
接种袁圆缘益静置培养 源愿 原 苑圆澡袁挑单菌落点接于蛋白酶
检测平板袁圆缘益培养 猿 原 缘凿袁以接种于 员郾 缘豫水琼脂培
养基平板的处理为对照袁观察菌落周围是否有透明圈
产生遥
员郾 缘摇 菌株基因组 阅晕粤的提取
挑取 运月平板上活化培养的菌株 在蕴圆远员 单菌落接
种于 运月 液体培养基袁圆缘益 员远园则窑皂蚤灶 原员振荡培养 猿远澡
左右至对数生长后期袁然后按细菌基因组 阅晕粤提取试
剂盒操作手册提取基因组 阅晕粤袁经 园郾 苑豫琼脂糖凝胶
电泳和紫外分光光度法检测后备用遥
员郾 远摇 菌株 在蕴圆远员 基因组文库的构建及阳性克隆子的
筛选
员郾 远郾 员摇 基因组 阅晕粤的部分消化及目的片段回收摇 用
月葬皂匀 玉对菌株 在蕴圆远员 基因组 阅晕粤进行部分酶切袁反
应体系为 缘园滋蕴院员园 伊 遭怎枣枣藻则 运 缘滋蕴袁 月葬皂匀 玉 员滋蕴袁模
版 阅晕粤 圆园滋蕴袁凿凿匀圆韵 圆源滋蕴遥 同时设置 远 个平行反应袁
其中一份用 凿凿匀圆韵 替代酶作为对照袁猿苑益恒温反应曰
每 圆园皂蚤灶取出一份反应产物袁加 缘滋蕴员园 伊 造燥葬凿蚤灶早 遭怎枣枣藻则
置于 原圆园益终止反应曰园郾 苑豫琼脂糖凝胶电泳检验酶切
反应程度遥
琼脂糖凝胶 阅晕粤回收试剂盒回收纯化 员 原 苑郾 缘 噪遭
阅晕粤酶切片段袁 原 圆园益保存备用遥
员郾 远郾 圆摇 质粒酶切及去磷酸化 摇 月葬皂匀 玉酶切质粒
责哉悦员员愿袁反应体系为 缘园滋蕴院员园 伊 遭怎枣枣藻则 运 缘滋蕴袁月葬皂匀
玉圆郾 缘滋蕴袁责哉悦员员愿 圆缘滋蕴袁凿凿匀圆韵 员苑郾 缘滋蕴袁猿苑益反应 猿澡袁园郾 苑豫琼脂糖凝胶电泳检测袁切胶回收质粒酶切片段
进行去磷酸化袁反应体系为 缘园滋蕴院员园 伊 遭怎枣枣藻则 缘滋蕴袁质
粒酶切回收片段 圆园滋蕴袁悦陨粤孕 员滋蕴袁凿凿匀圆韵 圆源滋蕴袁猿苑益
保温 猿园皂蚤灶后袁远缘益反应 猿园皂蚤灶 灭活 悦陨粤孕袁普通 阅晕粤
产物回收试剂盒回收目的片段袁 原 圆园益保存备用遥
员郾 远郾 猿摇 表达载体的构建及转化摇 栽源 阅晕粤 蕴蚤早葬泽藻 连接
基因组酶切片段与 责哉悦员员愿 载体酶切去磷酸化片段袁
热击法转入大肠杆菌 阅匀缘琢袁涂布于 蕴月 平板 渊含
员园园滋早窑皂蕴 原员氨苄青霉素尧圆源滋早窑皂蕴 原员 陨孕栽郧尧源园滋早窑
皂蕴 原员 载鄄郧葬造冤袁猿苑益静置培养过夜袁随机挑选 圆园 个白色
转化子利用通用引物 月糟葬月耘杂栽 孕则蚤皂藻则 酝员猿 原 源苑 和
月糟葬月耘杂栽 孕则蚤皂藻则 砸灾鄄酝渊序列如表 员冤进行菌落 孕悦砸 检
测文库平均插入片断的大小袁反应体系 猿园滋蕴院圆 伊 栽葬择
孕悦砸 酝葬泽贼藻则酝蚤曾 员缘滋蕴袁孕则蚤皂藻则 酝员猿 原 源苑渊员园滋皂燥造窑蕴 原员 冤
员滋蕴袁孕则蚤皂藻则 砸灾鄄酝 渊员园滋皂燥造窑蕴 原员 冤 员滋蕴袁模版袁 凿凿匀圆韵员猿滋蕴遥 扩增条件院怨缘益预变性 缘皂蚤灶袁怨源益变性 源园 泽曰
缘猿益退火 源园 泽袁苑圆益延伸 员皂蚤灶 猿园 泽袁运行 猿缘 个循环曰最
后 苑圆益延伸 员园皂蚤灶遥 随机挑选 员园 园园园 个阳性转化子
作为文库保存遥
表 员摇 菌落 孕悦砸所使用的引物
栽葬遭造藻 员摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 枣燥则 糟燥造燥灶赠 孕悦砸
孕则蚤皂藻则 灶葬皂藻 孕则蚤皂藻则 泽藻择怎藻灶糟藻 渊缘忆 原 猿忆冤
月糟葬月耘杂栽 孕则蚤皂藻则 酝员猿 原 源苑 悦郧悦悦粤郧郧郧栽栽栽栽悦悦悦粤郧栽悦粤悦郧粤悦
月糟葬月耘杂栽 孕则蚤皂藻则 砸灾鄄酝 郧粤郧悦郧郧粤栽粤粤悦粤粤栽栽栽悦粤悦粤悦粤郧郧
员苑猿员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
员郾 远郾 源摇 蛋白酶基因阳性克隆的筛选摇 将构建好的基
因组文库涂布于重组子筛选平板渊含 员园园滋早窑皂蕴 原员氨
苄青霉素尧圆源滋早窑皂蕴 原员 陨孕栽郧冤袁猿苑益恒温培养 员 耀 猿凿袁观
察菌落周围是否有透明圈产生曰对阳性转化子进行菌
落 孕悦砸检测渊方法同 员郾 远郾 猿冤袁平板复筛一次袁提取重
组质粒进行酶切验证并测序遥
员郾 苑摇 蛋白酶基因序列比对及蛋白结构分析
测序结果在 晕悦月陨 上进行 月造葬泽贼 比对袁运用 韵砸云
云蚤灶凿藻则预测开放阅读框遥 通过 耘曾孕粤杂赠 分析编码蛋白
的基本理化性质袁在 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 责则藻凿蚤糟贼责则燥贼藻蚤灶援 燥则早 辕
网站上进行蛋白一级结构分析袁利用软件 杂蚤早灶葬造孕 源郾 员
渊 澡贼贼责院 辕 辕 憎憎憎援 糟遭泽援 凿贼怎援 凿噪 辕 冤 分 析 信 号 肽袁 采 用
酝藻早葬缘郾 园圆 软件构建 晕允 进化树袁通过 杂韵孕酝粤 软件
渊澡贼贼责院 辕 辕 灶责泽葬鄄责遭蚤造援 蚤遭糟责援 枣则 辕 糟早蚤鄄遭蚤灶 辕 泽藻糟责则藻凿 赃 泽燥责皂葬援 责造冤
分析蛋白二级结构袁并利用同源建模服务器 杂宰陨杂杂鄄
酝韵阅耘蕴进行蛋白三级结构预测袁根据酶蛋白氨基酸序
列信息在蛋白质结构库中搜寻模板袁采用结构仿真模
拟渊孕则燥酝燥凿域冤及能量最小化分析渊郧砸韵鄄酝韵杂怨远冤建
模袁通过在线工具 孕则燥糟澡藻糟噪进行可信度检测遥
员郾 愿摇 蛋白酶基因的诱导表达及检测
将蛋白酶基因阳性转化子接种于 蕴月 液体培养基
渊含 员园园滋早窑皂蕴 原员氨苄青霉素冤袁猿苑益 员愿园则窑皂蚤灶 原员振荡
培养过夜袁再按 员豫的接种量转接一次袁以同样的培养
条件培养至菌液的 韵阅远园园值达 园郾 缘袁加入终浓度为
员皂皂燥造窑蕴 原员的 陨孕栽郧袁猿园益 员愿园则窑皂蚤灶 原员分别诱导培养
圆源澡和 源愿澡袁源 园园园则窑皂蚤灶 原员离心 员园皂蚤灶袁收集上清袁以其
非诱导常规培养和空载 责哉悦员员愿 转化子诱导培养 源愿澡
为对照袁打孔法咱员缘暂 渊各孔加液量均为 员园园滋蕴冤和 杂阅杂鄄
孕粤郧耘咱员远暂 渊员圆豫的分离胶和 缘豫的浓缩胶冤电泳法检测
蛋白酶基因的表达遥
员郾 怨摇 蛋白酶生物学特性检测
员郾 怨郾 员摇 蛋白酶酶活测定摇 菌株 在蕴圆远员 在发酵培养基
中 圆缘益 员远园则窑皂蚤灶 原员振荡培养 猿 耀 缘 凿袁其蛋白酶基因阳
性转化子按 员郾 愿 的方法诱导培养 源愿 澡袁分别收集上清
液袁在 责匀值 苑郾 缘 的 孕月杂缓冲液中用孔径为 猿郾 缘 噪阅葬透
析袋透析处理袁真空冷冻干燥至粉状袁用蒸馏水溶解得
粗酶液遥 采用 云燥造蚤灶 法咱员苑暂测定粗酶液酶活袁以 猿缘益尧
责匀 苑郾 缘 条件下袁每分钟水解酪蛋白产生 员滋早 酪氨酸所
需的酶量定义为一个酶活力单位渊哉冤遥
员郾 怨郾 圆摇 温度对蛋白酶活性的影响摇 取 圆园园滋蕴 粗酶液
与 愿园园滋蕴 员豫酪蛋白溶液渊责匀 值 苑郾 缘冤混匀袁分别在 园
耀远园益条件下测定酶活力袁以最高酶活力为 员园园豫 袁计
算其他条件下的相对酶活力袁绘制酶活力温度曲线遥
员郾 怨郾 猿摇 责匀 对蛋白酶活性的影响摇 设置 责匀 源 原 员园 的
梯度缓冲液渊责匀 值 源 耀 缘 采用醋酸 原醋酸钠缓冲液袁
责匀 远 耀 愿 采用磷酸盐缓冲液袁责匀 值 怨 耀 员园 采用 郧造赠鄄
晕葬韵匀缓冲液冤袁粗酶液分别在各 责匀 梯度缓冲液中室
温处理 远园皂蚤灶袁测定酶活袁以最高酶活力为 员园园豫 袁绘制
酶活力 责匀曲线遥
员郾 怨郾 源摇 金属离子对酶活力的影响摇 取浓度为 圆园皂皂燥造
窑蕴 原员的 晕葬 垣 尧运 垣 尧悦葬圆 垣 尧酝早圆 垣 尧在灶圆 垣 尧悦怎圆 垣 尧悦燥圆 垣 等 员园
种金属离子及金属蛋白酶抑制剂 耘阅栽粤渊责匀值 苑郾 园冤分
别与粗酶液混合袁使离子终浓度为 员园皂皂燥造窑蕴 原员袁以未
经处理酶液的酶活力为 员园园豫 袁检测各处理对酶活力
的影响袁并利用 杂孕杂杂 软件通过 云蚤泽糟澡藻则爷 泽 最小显著差
数法进行差异显著性分析遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 菌株 在蕴圆远员 的蛋白酶活性
菌株 在蕴圆远员 在蛋白酶检测平板上 圆缘益培养 源凿
后袁菌落直径为 园郾 缘糟皂袁菌落周围产生了明显的透明
圈袁其直径为 猿郾 远糟皂袁透明圈直径 辕菌落直经的比值达
到 苑郾 圆渊图 员冤袁表明其扩散至培养基中的代谢产物具
有很强的蛋白酶活性遥
图 员摇 菌株 在蕴圆远员 在蛋白酶活性检测
平板上的透明圈
云蚤早援 员摇 栽则葬灶泽责葬则藻灶贼 扎燥灶藻 责则燥凿怎糟藻凿 遭赠 在蕴圆远员
燥灶 责则燥贼藻葬泽藻 贼藻泽贼蚤灶早 皂藻凿蚤怎皂 责造葬贼藻
圆郾 圆摇 基因组 阅晕粤的提取及文库构建
提取的菌株 在蕴圆远员 基因组 阅晕粤 经紫外分光光度
法检测袁其 韵阅圆远园 辕 韵阅圆愿园 越 员郾 愿缘圆袁含量约为 园郾 圆圆滋早窑
滋蕴 原员袁纯度质量符合建库要求遥 月葬皂匀 玉酶切不同时
间的结果表明袁当酶切 远园皂蚤灶 时袁消化后的 阅晕粤 片段
分布均匀符合试验要求渊图 圆冤遥
构建的菌株 在蕴圆远员 基因组文库经平板计数估算
总克隆数约为 员猿缘园园 个遥 菌落 孕悦砸 电泳结果显示袁文
库平均插入片断大小约为 圆郾 愿 噪遭袁空载率小于 缘豫 袁涵
圆苑猿员
摇 愿 期 悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 泽责援 在蕴圆远员 蛋白酶基因的克隆尧表达及其酶学特性
注院员颐 员缘 园园园 遭责 阅晕粤 蕴葬凿凿藻则 酝葬则噪藻则曰圆院基因组 阅晕粤酶切 园皂蚤灶曰
猿院基因组 阅晕粤酶切 远园皂蚤灶遥
晕燥贼藻院蕴葬灶藻 员颐 员缘 园园园 遭责 阅晕粤 蕴葬凿凿藻则 酝葬则噪藻则曰 蕴葬灶藻 圆院 栽澡藻 枣则葬早皂藻灶贼泽
燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 凿蚤早藻泽贼藻凿 枣燥则 园皂蚤灶曰
蕴葬灶藻 猿院 栽澡藻 枣则葬早皂藻灶贼泽 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 凿蚤早藻泽贼藻凿 枣燥则 远园皂蚤灶援
图 圆摇 菌株 在蕴圆远员 基因组 阅晕粤 月葬皂匀 玉酶切图谱
云蚤早援 圆摇 孕葬则贼蚤葬造 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 早藻灶燥皂蚤糟 阅晕粤 燥枣 泽贼则葬蚤灶 在蕴圆远员
盖约 猿缘郾 怨员 酝遭的外源 阅晕粤遥 参考食真菌山冈单胞菌
渊 悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 枣怎灶早蚤增燥则葬灶泽 冤 栽藻则猿猿员 全 基 因 组 阅晕粤
渊晕悦园员缘愿缘远冤长度袁假设 在蕴圆远员 细菌基因组 阅晕粤 长度
为 缘郾 圆 酝遭袁则文库涵盖了约 远郾 怨 倍的菌株 在蕴圆远员 全基
因组信息遥
圆郾 猿摇 蛋白酶基因阳性克隆子的筛选
构建好的基因组文库在重组子筛选平板上 猿苑益
恒温培养 圆 凿 后袁观察到有一重组子菌落周围出现明
显的透明圈渊图 猿 原 粤冤遥 挑取该菌落袁以空载 责哉悦员员愿
转化子为对照重复测定验证了其蛋白酶活性渊图 猿 原
月冤袁表明该重组子已携带了蛋白酶基因袁将该基因命
名为 糟葬责则燥遥
圆郾 源摇 序列测定及结构分析
酶切验证重组质粒 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥插入片段大小
约为 员郾 缘 噪遭 左右渊图 源冤袁测序获得了长度为 员源苑缘 遭责
的核苷酸序列遥 通过 晕悦月陨 的 韵砸云 云蚤灶凿藻则 分析袁依据
与食 真 菌 山 冈 单 胞 菌 栽藻则猿猿员 全 基 因 组 序 列
渊晕悦园员缘愿缘远冤中胞外蛋白酶基因的比对结果袁该序列包
含一个 员园怨圆 遭责 的完整开放阅读框袁缘忆上游 圆圆苑 遭责 和
猿忆下游 员缘远 遭责的核苷酸序列均为非编码区袁其开放阅
读框编码由 猿远猿 个氨基酸组成的胞外蛋白酶袁其中酸
性氨基酸 圆怨 个袁碱性氨基酸个 圆愿 个袁所有氨基酸组成
中袁丙氨酸渊粤造葬冤含量最高袁为 员猿郾 愿豫 袁甲硫氨酸渊酝藻贼冤
含量最低袁为 园郾 远豫 遥 且氨基酸序列含 在灶圆 垣结合保守
域 匀耘载载匀 和 郧栽载阅载载再郧咱员愿暂 袁属于 酝猿缘 金属蛋白酶
注院粤院蛋白酶基因阳性转化子初筛结果曰月院蛋白酶基因阳性转
化子复筛结果曰月 原 员院空载 责哉悦员员愿 转化子曰月 原 圆院责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥
摇 摇 摇 阳性转化子遥
晕燥贼藻院 粤院 栽澡藻 则藻泽怎造贼 燥枣 责则蚤皂葬则赠 泽糟则藻藻灶蚤灶早 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽
憎蚤贼澡 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥曰 月院 栽澡藻 则藻泽怎造贼 燥枣 则藻鄄泽糟则藻藻灶蚤灶早 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻
贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 憎蚤贼澡 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥曰 月 原 员院 孕燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽
憎蚤贼澡 责哉悦员员愿曰 月 原 圆院 孕燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 憎蚤贼澡 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥援
图 猿摇 蛋白酶基因阳性克隆子的筛选
云蚤早援 猿摇 杂糟则藻藻灶蚤灶早 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 贼则葬灶泽枣燥则皂葬灶贼泽 燥枣
藻曾贼则葬糟藻造造怎造葬则 责则燥贼藻葬泽藻 早藻灶藻援
注院员颐 缘 园园园 遭责 阅晕粤 蕴葬凿凿藻则 酝葬则噪藻则曰圆院责哉悦员员愿 的 月葬皂匀 玉
酶切片段曰猿院责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥的 月葬皂匀 玉酶切片段遥
晕燥贼藻院 蕴葬灶藻 员颐 缘 园园园 遭责 阅晕粤 蕴葬凿凿藻则 酝葬则噪藻则曰 蕴葬灶藻 圆院 栽澡藻
枣则葬早皂藻灶贼泽 燥枣 责哉悦员员愿 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 月葬皂匀 玉曰 蕴葬灶藻 猿院 栽澡藻
枣则葬早皂藻灶贼泽 燥枣 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥 凿蚤早藻泽贼藻凿 遭赠 月葬皂匀 玉援
图 源摇 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥质粒酶切检测结果
云蚤早援 源摇 栽澡藻 则藻泽怎造贼 燥枣 则藻泽贼则蚤糟贼蚤燥灶 藻灶扎赠皂藻
凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥
家族渊耘悦 猿郾 源郾 圆源郾 圆园冤袁提交 郧藻灶月葬灶噪 获得登录号为
运云怨怨圆愿源缘遥 耘曾孕粤杂赠 服务系统中 孕则燥贼孕葬则葬皂 软件计算
结果表明该基因编码蛋白的分子量为 猿苑郾 怨苑 噪阅葬袁分
子式为 悦员远远源 匀圆缘远苑 晕源远猿 韵缘源猿 杂苑袁理论等电点 远郾 远缘袁不稳定
系数 圆愿郾 园员袁总平均疏水性 原 园郾 圆远源袁是一个稳定的亲
水蛋白遥
猿苑猿员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
在蕴圆远员 蛋白酶氨基酸序列通过 杂蚤早灶葬造孕 源郾 员 分析发
现袁晕端 员 原 圆远 位氨基酸为信号肽序列袁剪切位点位于
圆缘 和 圆远 位之间遥 利用 晕悦月陨 的 月造葬泽贼责 进行序列比对
的结果表明袁 与食真菌山冈单胞菌 渊 悦燥造造蚤皂燥灶葬泽
枣怎灶早蚤增燥则葬灶泽冤栽藻则猿猿员 全基因组序列渊晕悦园员缘愿缘远冤中的胞
外蛋白酶基因编码的氨基酸序列相似性最高袁为
愿猿豫 袁而与其它具有同源性的氨基酸序列相似性均低
于 缘圆豫 遥 选择与 在蕴圆远员 蛋白酶氨基酸序列相似性大
于 源园豫的 员苑 个蛋白酶氨基酸序列与该序列构建的系
统进化树显示袁在蕴圆远员 与食真菌山冈单胞菌 栽藻则猿猿员 聚
为一个小分支袁进一步验证了这两个菌株的亲缘关系
最近渊图 缘冤遥
注院节点数字代表 月燥燥贼泽贼则葬责 员 园园园 次验证中该分支可信度的百分比曰比例尺 园郾 员 表明序列中氨基酸的置换比率为 员园豫 遥
晕燥贼藻院 栽澡藻 灶怎皂遭藻则泽 葬贼 灶燥凿藻 蚤灶凿蚤糟葬贼藻 贼澡藻 遭燥燥贼泽贼则葬责 责藻则糟藻灶贼葬早藻泽 燥枣 员 园园园 则藻责藻贼蚤贼蚤燥灶泽援 杂糟葬造藻 遭葬则 蚤灶凿蚤糟葬贼藻泽 员园 泽怎遭泽贼蚤贼怎贼蚤燥灶泽 责藻则 员园园 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽援
图 缘摇 悦葬责则燥与其它蛋白酶基于氨基酸序列的系统进化树
云蚤早援 缘摇 孕澡赠造燥早藻灶藻贼蚤糟 贼则藻藻袁 遭葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 凿藻凿怎糟藻凿 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿 泽藻择怎藻灶糟藻泽 燥枣 悦葬责则燥 枣则燥皂 在蕴圆远员 葬灶凿 燥贼澡藻则 则藻造葬贼藻凿 责则燥贼藻葬泽藻泽援
运用 杂韵孕酝粤软件分析 悦葬责则燥的二级结构袁结果显
示该蛋白含 圆愿郾 怨猿豫 的 琢 螺旋袁圆源郾 苑怨豫 的延伸链袁
员郾 远缘豫的 茁转角袁源源郾 远猿豫的无规则卷曲遥
通过 杂宰陨杂杂鄄酝韵阅耘蕴 在蛋白质结构数据库中搜寻
到 在蕴圆远员 蛋白酶 员怨苑 到 猿远猿 位氨基酸残基与多叶奇果
菌渊郧则蚤枣燥造葬 枣则燥灶凿燥泽葬冤锌肽酶 员早员圆 的 粤链序列一致性达
缘圆郾 怨愿豫 渊 跃 猿园豫 冤袁符合同源建模的条件遥 依据 员早员圆
原子结构 粤 链信息袁采用 杂宰陨杂杂鄄酝韵阅耘蕴 的结构建模
程序 孕则燥酝燥凿陨陨及能量最小化程序 郧砸韵酝韵杂怨远 构建了
悦葬责则燥蛋白三级结构渊图 远 原 粤冤袁可以看到该蛋白质立
体结构特点与 酝猿缘 家族蛋白酶三级结构很相似袁即典
型的 琢 辕 茁型结构袁中心含有一个 琢螺旋和 茁折叠构成
的 在灶圆 垣结合域遥 利用 孕则燥糟澡藻糟噪检测袁其主链构象位于
最佳容许区域尧附加容许区域和一般容许区域的氨基
酸残基分别为 愿怨郾 圆豫 尧怨郾 愿豫和 员郾 园豫 袁不容许区内无
氨基酸残基渊图 远 原 月冤遥 模拟所得的 在蕴圆远员 蛋白酶三
维结构在 砸葬皂葬糟澡葬灶凿则葬灶图中一般容许区的 椎 角和 追
角大于 怨园豫 袁从理论上表明模建的结果是可靠的遥
圆郾 缘摇 菌株 在蕴圆远员 蛋白酶基因在大肠杆菌中的诱导表
达
在蕴圆远员 蛋白酶基因阳性转化子诱导培养的上清
液袁经打孔法检测可见明显的透明圈袁说明其具有蛋白
酶活性袁且诱导培养 源愿 澡 的酶活强于培养 圆源 澡 的袁而
非诱导常规培养和空载 责哉悦员员愿 转化子诱导培养的对
照均未见透明圈渊图 苑冤袁由此证明了蛋白酶基因已在
大肠杆菌 阅匀缘琢 中诱导表达曰经 杂阅杂鄄孕粤郧耘 验证袁 此
蛋白酶分子量大约为 猿愿 噪阅葬渊图 愿冤遥
圆郾 远摇 菌株 在蕴圆远员 蛋白酶酶学特性
蛋白酶活性测定结果表明袁责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥 阳性
转化子和菌株 在蕴圆远员 所产的 悦葬责则燥 最适温度均为
猿园益袁在 猿园益 耀 源园益范围内酶活力较高袁源园益以上酶
活力急骤下降袁而在 员园益时仍保持在 苑园豫以上渊图 怨
原 粤冤袁表现出低温蛋白酶特性曰不同的 责匀条件也影响
其酶活性袁最适作用 责匀 值为 苑袁在 责匀 值 远郾 缘 耀 苑郾 缘 范
源苑猿员
摇 愿 期 悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 泽责援 在蕴圆远员 蛋白酶基因的克隆尧表达及其酶学特性
图 远摇 悦葬责则燥三级结构渊粤冤及 砸葬皂葬糟澡葬灶凿则葬灶渊月冤图
云蚤早援 远摇 栽澡藻 贼澡则藻藻鄄凿蚤皂藻灶泽蚤燥灶葬造 泽贼则怎糟贼怎则藻 葬灶凿 砸葬皂葬糟澡葬灶凿则葬灶 责造燥贼 燥枣 悦葬责则燥
注院员院责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥阳性转化子非诱导培养 源愿 澡曰圆院空载 责哉悦员员愿
转化子诱导培养 源愿 澡曰猿 和 源院责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥 阳性转化子分别诱导
摇 摇 培养 圆源 澡和 源愿 澡遥
晕燥贼藻院 员院 栽澡藻 枣藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼 燥枣 耘援 糟燥蚤造 阅匀缘琢 憎蚤贼澡 责哉悦员员愿 原
糟葬责则燥 早则燥憎灶 葬贼 猿园益 枣燥则 源愿 澡曰 圆院 栽澡藻 枣藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼 燥枣 耘援 糟燥蚤造
阅匀缘琢 憎蚤贼澡 责哉悦员员愿 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 陨孕栽郧 葬贼 猿园益 枣燥则 源愿 澡曰 猿 原 源院 栽澡藻
枣藻则皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼 燥枣 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 陨孕栽郧
摇 摇 葬贼 猿园益 枣燥则 圆源 葬灶凿 源愿 澡袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
图 苑摇 表达产物活性检测
云蚤早援 苑摇 灾藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责则燥贼藻葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 燥枣 贼澡藻
则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 耘援 糟燥蚤造 阅匀缘琢 憎蚤贼澡 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥
燥灶 责则燥贼藻葬泽藻 贼藻泽贼蚤灶早 皂藻凿蚤怎皂 责造葬贼藻援
围内活性较高袁过酸或过碱的环境均对酶活有较大的
抑制作用渊图 怨 原 月冤袁属中性蛋白酶遥
金属蛋白酶抑制剂 耘阅栽粤 及金属离子对 悦葬责则燥 酶
活影响试验结果显示渊表 圆冤袁该蛋白酶对 耘阅栽粤 非常
敏感袁员园 皂皂燥造窑蕴 原员的浓度就可使酶基本失活遥 各种金
属离子对蛋白酶活性的影响存在差异遥 在灶圆 垣 尧酝灶圆 垣对
酶活有激活作用袁当 在灶圆 垣 浓度为 员园 皂皂燥造窑蕴 原员时袁
责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥阳性转化子和菌株 在蕴圆远员 所产蛋白酶
注院酝院蛋白 酝葬则噪藻则曰员 原 圆院责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥 阳性转化子分别诱导
培养 圆源 和 源愿 澡 后的总蛋白曰 猿院空载 责哉悦员员愿 转化子诱导培养
摇 摇 源愿 澡后的总蛋白遥
晕燥贼藻院 蕴葬灶藻 酝院 酝燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪藻则泽曰 蕴葬灶藻 员 原 圆院 栽燥贼葬造 责则燥贼藻蚤灶
燥枣 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 陨孕栽郧 葬贼 猿园益 枣燥则 圆源 葬灶凿
源愿 澡 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠曰 蕴葬灶藻 猿院 栽燥贼葬造 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 责哉悦员员愿 蚤灶 耘援 糟燥造蚤
摇 摇 摇 摇 蚤灶凿怎糟藻凿 憎蚤贼澡 陨孕栽郧 葬贼 猿园益 枣燥则 源愿 澡援
图 愿摇 目的蛋白 杂阅杂鄄孕粤郧耘检测图谱
云蚤早援 愿摇 杂阅杂鄄孕粤郧耘 泽责藻糟贼则怎皂 燥枣 贼澡藻 责则燥贼藻蚤灶
藻灶糟燥凿藻凿 遭赠 糟葬责则燥 蚤灶 耘援 糟燥造蚤
分别为 员苑员郾 源猿 依 远郾 猿 和 员苑圆郾 源缘 依 圆郾 猿曰晕葬 垣 尧运 垣对酶活
无显著影响曰而 悦燥圆 垣 尧悦怎圆 垣 尧云藻圆 垣 尧云藻猿 垣 尧悦葬圆 垣和 酝早圆 垣
则对酶活表现出了抑制作用袁其中以 悦燥圆 垣的抑制作用
最强袁其浓度为 员园 皂皂燥造窑蕴 原员时袁责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥 阳性
转化子和菌株 在蕴圆远员 的蛋白酶酶活分别仅为 员园郾 苑员 依
缘郾 员 和 员缘郾 愿圆 依 圆郾 愿曰悦葬圆 垣和 酝早圆 垣抑制作用较弱遥 由此
缘苑猿员
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
图 怨摇 温度渊粤冤尧责匀渊月冤对蛋白酶活性的影响
云蚤早援 怨摇 耘枣枣藻糟贼 燥枣 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 葬灶凿 责匀 燥灶 贼澡藻 责则燥贼藻葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠
可见袁悦葬责则燥具有金属蛋白酶的典型特征遥
摇 摇 杂孕杂杂独立样本 贼 检验的结果表明袁不同温度尧责匀
及金属离子对 悦葬责则燥 酶活性的影响在 责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥
阳性转化子和菌株 在蕴圆远员 之间均无显著性差异曰推测
可能是因为菌株 在蕴圆远员 分泌到胞外的蛋白酶仅此一
种袁或产生的其它蛋白酶的胞外分泌量较低而不足以
对 悦葬责则燥酶活产生显著性的影响遥
表 圆摇 不同金属离子处理对酶活力的影响
栽葬遭造藻 圆摇 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 皂藻贼葬造 蚤燥灶泽 燥灶 贼澡藻 责则燥贼藻葬泽藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠
金属离子
酝藻贼葬造 蚤燥灶 辕
员园皂皂燥造窑蕴 原员
相对酶活力
砸藻造葬贼蚤增藻 藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 辕 豫
耘援 糟燥造蚤渊责哉悦员员愿 原 糟葬责则燥冤 在蕴圆远员
晕葬 垣 怨愿郾 圆员 依 园郾 猿 糟凿 怨愿郾 怨愿 依 园郾 缘 遭糟
运 垣 怨缘郾 圆源 依 园郾 怨 糟凿藻 怨远郾 怨源 依 园郾 源 糟
悦葬圆 垣 怨员郾 园苑 依 员郾 远 藻 怨园郾 愿圆 依 园郾 圆 凿
酝早圆 垣 怨源郾 园缘 依 员郾 远 凿藻 怨愿郾 源苑 依 园郾 远 糟
在灶圆 垣 员苑员郾 源猿 依 远郾 猿 葬 员苑圆郾 源缘 依 圆郾 猿 葬
悦怎圆 垣 缘猿郾 缘苑 依 圆郾 猿 早 缘愿郾 员远 依 猿郾 圆 枣
悦燥圆 垣 员园郾 苑员 依 缘郾 员 澡 员缘郾 愿圆 依 圆郾 愿 澡
酝灶圆 垣 员园源郾 苑远 依 园郾 远 遭 员园圆郾 缘缘 依 员郾 员 遭
云藻猿 垣 远远郾 远苑 依 员郾 猿 枣 苑园郾 源员 依 猿郾 圆 藻
云藻圆 垣 缘缘郾 怨缘 依 源郾 远 早 缘圆郾 园源 依 园郾 怨 早
耘阅栽粤渊责匀苑郾 缘冤 愿郾 猿猿 依 圆郾 园 澡 员员郾 圆圆 依 猿郾 苑 蚤
悦运 员园园郾 园园 依 园郾 园 遭糟 员园园郾 园园 依 园郾 园 遭糟
摇 摇 注院表中相对酶活为平均值 依标准差曰其后的小写字母仅表示差异
显著性分析结果袁同一列内带有不同字母的均值在 葬 越 园郾 园缘 水平上具
有显著性差异曰以 猿缘益尧责匀 苑郾 缘 条件下的酶活力为 员园园豫作对照遥
晕燥贼藻院 阅葬贼葬 责则藻泽藻灶贼 贼澡藻 责藻则糟藻灶贼葬早藻 燥枣 则藻造葬贼蚤增藻 藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠援 野 依 冶
皂藻葬灶泽 贼澡藻 泽贼葬灶凿葬则凿 凿藻增蚤葬贼蚤燥灶 燥枣 藻葬糟澡 贼则藻葬贼皂藻灶贼援 栽澡藻 阅葬贼葬 憎藻则藻 葬灶葬造赠扎藻凿 枣燥则
泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻 遭赠 云蚤泽糟澡藻则爷 泽 造藻葬泽贼 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 贼藻泽贼 渊 葬 越 园郾 园缘冤袁 葬灶凿
增葬造怎藻泽 憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 造藻贼贼藻则泽 葬则藻 泽贼葬贼蚤泽贼蚤糟葬造造赠 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 凿蚤枣枣藻则藻灶贼援 栽澡藻
藻灶扎赠皂藻 葬糟贼蚤增蚤贼赠 葬贼 猿缘益 葬灶凿 责匀 苑郾 缘 憎葬泽 则藻糟燥则凿藻凿 葬泽 员园园豫 葬灶凿 怎泽藻凿 葬泽
糟燥灶贼则燥造援
猿摇 讨论
目前袁国内外报道的微生物源低温蛋白酶大多是
来自深海尧极地尧雪山等极端环境中的嗜冷菌或耐冷
菌咱圆暂 遥 本试验菌株 在蕴圆远员 分离自西藏色季拉山海拔
源缘猿园 皂的高山草甸土壤袁所栖息的高寒荒漠环境年均
温 约 园益袁最暖月均温 约 远益袁园益以上的天数 约 员圆园 凿袁
高于 园益的年积温 约 员 园园园益 咱员怨暂 遥 对高寒生态环境的
适应使菌株 在蕴圆远员 具备了耐低温的特性袁其生长温度
范围为 源 耀 猿园益袁最适生长温度为 圆缘益袁在 猿园益以上
的温度下不生长袁依据 酝燥则蚤贼葬咱圆园暂对嗜冷菌和耐冷菌的
定义袁该菌株属于耐冷菌遥 酶学性质试验表明袁菌株
在蕴圆远员 产生的胞外蛋白酶在 员园益条件下酶活力可保持
在 苑园 豫以上袁是一种低温蛋白酶遥 已报道的低温蛋白
酶产生菌主要有假交替单胞菌属渊孕泽藻怎凿燥葬造贼藻则燥皂燥灶葬泽冤尧
科 尔 韦 尔 氏 菌 属 渊 悦燥造憎藻造造蚤葬 冤尧 黄 单 胞 菌 属
渊载葬灶贼澡燥皂燥灶葬泽冤和气单胞菌属渊粤藻则燥皂燥灶葬泽冤袁对交替单
胞菌属渊粤造贼藻则燥皂燥灶葬泽冤尧希瓦氏菌属渊杂澡藻憎葬灶藻造造葬冤尧芽孢
杆菌属渊月葬糟蚤造造怎泽冤尧金黄杆菌属渊悦澡则赠泽藻燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂冤尧嗜
冷杆 菌 属 渊 孕泽赠糟澡则燥遭葬糟贼藻则 冤 和 鞘 氨 醇 单 胞 菌 属
渊杂责澡蚤灶早燥皂燥灶葬泽冤等属也有少量的报道咱圆员暂 遥 而对山冈
单胞菌属的种袁仅见有 蕴藻增藻葬怎 等咱圆圆暂在食真菌山冈单
胞菌 栽藻则猿猿员 全基因组序列渊晕悦园员缘愿缘远冤分析中推测了
其蛋白酶基因编码的胞外蛋白酶袁未见对其酶学性质
等的相关报道袁因此袁尚无对山冈单胞菌所产低温蛋白
酶的系统研究遥
本文通过构建耐冷菌 在蕴圆远员 基因组文库筛选出
了其胞外蛋白酶基因 糟葬责则燥袁分析其编码的氨基酸序列
发现活性催化中心渊匀猿员猿袁耘猿员源袁匀猿员苑 葬灶凿 阅猿圆远冤是属
于金属蛋白酶 酝猿缘 家族的保守域袁其序列与食真菌山
远苑猿员
摇 愿 期 悦燥造造蚤皂燥灶葬泽 泽责援 在蕴圆远员 蛋白酶基因的克隆尧表达及其酶学特性
冈单胞菌 栽藻则猿猿员 全基因组序列渊晕悦园员缘愿缘远冤中蛋白酶
基因编码的胞外蛋白酶序列相似性最高袁为 愿猿豫 袁基
于氨基酸序列的系统发育进化树分析进一步验证了这
一结果遥 因此袁初步认为菌株 在蕴圆远员 所产蛋白酶与菌
株 栽藻则猿猿员 的胞外蛋白酶是同一类蛋白酶遥 为了深入
探究 悦葬责则燥的结构功能袁利用生物信息学方法对该酶
蛋白结构做了详细的分析袁发现该酶的核心部分表现
出了金属蛋白酶 酝猿缘 家族典型的 琢 辕 茁折叠结构特征曰
中心结构域由 苑 个 琢 螺旋和 源 个 茁 折叠构成曰源 对二
硫键渊缘 原 圆园员尧苑缘 原 圆苑员尧苑苑 原 圆苑猿尧怨苑 原 圆怨猿冤使其结构稳
定袁具有一个 在灶圆 垣催化中心袁圆 个组氨酸和 员 个天冬氨
酸与酶活性中心部位金属离子结合形成配位键起催化
作用遥 据此推测山冈单胞菌可能是一类优良的金属蛋
白酶 酝猿缘 家族低温蛋白酶种质资源库遥
综上所述袁本试验通过对菌株 在蕴圆远员 所产生的蛋
白酶基因及其编码蛋白结构和酶学性质的研究袁初步
认为该蛋白酶是隶属于金属蛋白酶 酝猿缘 家族的一类
新潜在的低温胞外蛋白酶袁但还需通过 载 射线尧多维
核磁共振和耐冷机制等方面的研究进一步分析验证遥
对来源于西藏雪域高原高寒荒漠环境的山冈单胞菌
在蕴圆远员 所产低温蛋白酶的研究袁丰富了低温蛋白酶产
生菌种类及其生态分布的多样性袁也填补了山冈单胞
菌在这一领域研究的理论空白袁为其低温蛋白酶种质
资源的开发利用奠定了基础遥
源摇 结论
山冈单胞菌 在蕴圆远员 蛋白酶基因包含一个长为
员园怨圆 遭责的完整开放阅读框渊韵砸云冤袁编码 猿远猿 个氨基酸
组成的酶蛋白袁分子量约 猿愿 噪阅葬袁其氨基酸序列中含
酝猿缘 金属蛋白酶家族渊耘悦 猿郾 源郾 圆源郾 圆园冤保守结构域袁且
对金属蛋白酶抑制剂 耘阅栽粤 敏感袁最适温度为 猿园益袁
在 员园益时仍保持 苑园豫以上酶活力遥 据此可知该蛋白
酶为隶属于金属蛋白酶 酝猿缘 家族的低温胞外蛋白酶遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 蕴蚤 匝袁 再蚤 蕴袁 酝葬则藻噪 孕袁 陨增藻则泽燥灶 月 蕴援 悦燥皂皂藻则糟蚤葬造 责则燥贼藻葬泽藻泽院 孕则藻泽藻灶贼
葬灶凿 枣怎贼怎则藻 咱允暂 援 云耘月杂 蕴藻贼贼藻则泽袁 圆园员猿袁 缘愿苑渊愿冤院 员员缘缘 原 员员远猿
咱 圆 暂 摇 运怎凿凿怎泽 酝袁 砸葬皂贼藻噪藻 孕 宰援 砸藻糟藻灶贼 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼泽 蚤灶 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 葬灶凿
遭蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早蚤糟葬造 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 燥枣 糟燥造凿鄄葬糟贼蚤增藻 皂蚤糟则燥遭蚤葬造 责则燥贼藻葬泽藻泽咱 允暂 援
悦则蚤贼蚤糟葬造 砸藻增蚤藻憎泽 蚤灶 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁 圆园员圆袁 猿愿渊源冤院 猿猿园 原 猿猿愿
咱 猿 暂 摇 栽泽蚤葬贼泽蚤葬灶蚤 蕴袁 郧藻增葬藻则贼 运袁 灾葬灶 月则藻怎泽藻早藻皂 云援 晕葬贼怎则葬造 泽怎遭泽贼则葬贼藻泽 燥枣
责造葬灶贼 责则燥贼藻葬泽藻泽院 澡燥憎 糟葬灶 责则燥贼藻葬泽藻 凿藻早则葬凿燥皂蚤糟泽 藻曾贼藻灶凿 燥怎则
噪灶燥憎造藻凿早藻钥 咱允暂 援 孕澡赠泽蚤燥造燥早蚤葬 孕造葬灶贼葬则怎皂袁 圆园员圆袁 员源缘渊员冤院 圆愿 原 源园
咱 源 暂 摇 运葬造蚤泽扎 匀 酝援 酝蚤糟则燥遭蚤葬造 责则燥贼藻蚤灶葬泽藻泽 咱 允暂 援 粤凿增葬灶糟藻泽 蚤灶 月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造
耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 员怨愿愿袁 猿远院 员 原 远缘
咱 缘 暂摇 谢承佳援 微生物高温蛋白酶的研究和应用进展咱 允暂 援 安徽农业
科学袁 圆园员园袁 猿愿渊猿园冤院 员远苑远缘 原 员远苑远远袁 员远愿园源
咱 远 暂摇 陈秀兰袁 张玉忠袁 王运涛袁 高培基袁 栾裼武援 深海适冷菌
杂酝怨怨员猿 产生的低温蛋白酶咱允暂 援 海洋科学袁 圆园园员袁 圆缘渊员冤院 源 原 怨
咱 苑 暂摇 郧怎责贼葬 砸袁 月藻早 匝 运袁 蕴燥则藻灶扎 孕援 月葬糟贼藻则蚤葬造 葬造噪葬造蚤灶藻 责则燥贼藻葬泽藻泽院
皂燥造藻糟怎造葬则 葬责责则燥葬糟澡藻泽 葬灶凿 蚤灶凿怎泽贼则蚤葬造 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽 咱 允 暂 援 粤责责造蚤藻凿
酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 葬灶凿 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园圆袁 缘怨渊员冤院 员缘 原 猿圆
咱 愿 暂摇 倪永清袁 顾燕玲袁 史学伟袁 郑晓吉袁 韩亮袁 周红袁 程国栋援 天山
一号冰川底部沉积层产蛋白酶耐低温菌株的筛选及其系统发育
咱允暂 援 微生物学报袁 圆园员猿袁 缘猿渊圆冤院 员远源 原 员苑圆
咱 怨 暂摇 运怎凿凿怎泽 酝袁 砸葬皂贼藻噪藻 孕 宰援 孕则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥责贼蚤皂蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬灶
藻曾贼则葬糟藻造造怎造葬则 糟燥造凿鄄葬糟贼蚤增藻 葬造噪葬造蚤灶藻 责则燥贼藻葬泽藻 枣则燥皂 杂贼藻灶燥贼则燥责澡燥皂燥灶葬泽
皂葬造贼燥责澡蚤造蚤葬 酝栽悦悦 苑缘圆愿 葬灶凿 蚤贼泽 葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 蚤灶 凿藻贼藻则早藻灶贼 蚤灶凿怎泽贼则赠
咱允暂 援 粤枣则蚤糟葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 砸藻泽藻葬则糟澡袁 圆园员员袁 缘渊苑冤院 愿园怨
原 愿员远
咱员园暂摇 宰葬灶早 匝 云袁 匀燥怎 再 匀袁 载怎 在袁 酝蚤葬燥 允 蕴袁 蕴蚤 郧 再援 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿
责则燥责藻则贼蚤藻泽 燥枣 葬灶 藻曾贼则葬糟藻造造怎造葬则 糟燥造凿鄄葬糟贼蚤增藻 责则燥贼藻葬泽藻 枣则燥皂 贼澡藻
责泽赠糟澡则燥责澡蚤造蚤糟 遭葬糟贼藻则蚤怎皂 孕泽藻怎凿燥葬造贼藻则燥皂燥灶葬泽 泽责援 晕允圆苑远 咱 允 暂 援
月蚤燥糟澡藻皂蚤糟葬造 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 允燥怎则灶葬造袁 圆园园愿袁 猿愿渊猿冤院 猿远圆 原 猿远愿
咱员员暂摇 杂葬遭葬 陨袁 匝扎葬蚤 孕 匀袁 砸葬贼澡藻则 杂 粤袁 阅葬则 砸 粤袁 匝葬凿则蚤 匝 粤袁 粤澡皂葬凿 晕袁
允燥澡则蚤 杂袁 栽葬灶藻躁葬 杂 悦袁 杂澡葬憎蚤 杂援 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 葬
糟燥造凿 葬糟贼蚤增藻 葬造噪葬造蚤灶藻 责则燥贼藻葬泽藻 枣则燥皂 杂贼藻灶燥贼则燥责澡燥皂燥灶葬泽 泽责援 袁 蚤泽燥造葬贼藻凿
枣则燥皂 运葬泽澡皂蚤则袁 陨灶凿蚤葬 咱 允 暂 援 宰燥则造凿 允燥怎则灶葬造 燥枣 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 葬灶凿
月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园员圆袁 圆愿渊猿冤院 员园苑员 原 员园苑怨
咱员圆暂摇 徐长安袁 罗秀针袁 张怡评袁 陆燕袁 易瑞灶援 一株海洋芽孢杆菌
月园怨 的筛选及其发酵条件优化研究咱 允暂 援 海洋通报袁 圆园园怨袁 圆愿
渊缘冤院 苑源 原 苑愿
咱员猿暂摇 周德庆援 微生物学实验教程 咱酝暂援 北京院 高等教育出版社袁
圆园园远院 猿苑猿
咱员源暂摇 廉立慧袁 吴从平袁 张显忠袁 刘锦华袁 张克勤援 产胞外蛋白酶细菌
的快速筛选及其发酵产酶条件的初步研究咱 允暂 援 泰山医学院学
报袁 圆园园怨袁 猿园渊缘冤院 猿圆员 原 猿圆猿
咱员缘暂摇 王振东袁 罗春艳袁 杨晨袁 张殿朋袁 吴慧玲袁 刘伟成援 海洋细菌
匝阅悦园员 的鉴定及其几丁质酶基因的克隆与分析咱 允暂 援 农业生物
技术学报袁 圆园员猿袁 圆员渊远冤院 苑猿源 原 苑源源
咱员远暂摇 何丽华袁 刘培刚袁 陈金娥袁 刘岩袁 王永强袁 孟智启援 棉铃虫成虫
野生型与体色突变体的蛋白组成比较咱允暂 援 核农学报袁 圆园员圆袁 圆远
渊苑冤院 员园园园 原 员园园缘援
咱员苑暂摇 彭必雨袁 王霞袁 王剑袁 李亮袁 石碧援 制革常用蛋白酶活力测定方
法及结果的比较咱允暂 援 皮革科学与工程袁 圆园园源袁 员源渊猿冤院 苑 原 员员
咱员愿暂摇 杂怎灶 载袁 蕴蚤怎 载袁 郧怎燥 杂袁 匀怎葬灶早 月袁 蕴蚤 宰袁 宰葬灶早 载袁 蕴蚤灶 允袁 栽葬灶早 运援
悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 粤灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 葬 晕燥增藻造 悦燥灶泽藻则增藻凿 酝藻皂遭则葬灶藻 在蚤灶糟鄄
酝藻贼葬造造燥责则燥贼藻葬泽藻 云葬皂蚤造赠 枣则燥皂 杂燥造葬灶怎皂 泽怎则葬贼贼藻灶泽藻咱允暂 援 砸怎泽泽蚤葬灶 允燥怎则灶葬造
燥枣 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠援 圆园园苑袁 缘源渊员冤院 远猿 原 苑猿
咱员怨暂摇 罗建袁 郑维列袁潘刚袁 王景升援 色季拉山区高山寒带种子植物区
系研究咱允暂 援 武汉植物学研究袁 圆园园远袁 圆源渊猿冤院 圆员缘 原 圆员怨
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