全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊源冤院园缘员缘 耀 园缘圆圆允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄园愿鄄员远摇 接受日期院圆园员猿鄄园员鄄员远
作者简介院金仁耀渊员怨愿员鄄 冤袁男袁浙江遂昌人袁博士尧助理研究员袁主要从事免疫化学分析和食品安全检测领域的研究遥 栽藻造院 园缘苑员鄄愿愿园苑员园圆源鄄苑缘愿苑曰
耘皂葬蚤造院灶燥凿躁蚤灶岳 员远猿援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤园源鄄园缘员缘鄄园怨
基于双特异性单克隆抗体的克百威和三唑磷多残留耘蕴陨杂粤分析方法研究及在环境样品中应用
金仁耀员 摇 朱国念圆
渊员浙江工商大学食品与生物工程学院袁浙江 杭州摇 猿员园园员圆曰 圆 浙江大学农药与环境毒理研究所袁浙江 杭州摇 猿员园园圆怨冤
摘摇 要院采用杂交 原杂交瘤技术制备抗克百威和三唑磷的双特异性单克隆抗体并进行纯化袁通过对反应
模式尧工作浓度尧包被缓冲液尧有机溶剂尧离子强度尧责匀 值等条件优选袁建立优化的 耘蕴陨杂粤 分析方法袁对
克百威和三唑磷的线性回归方程分别为 再 越 圆园郾 园园怨造灶渊曾冤 原 怨郾 怨圆怨猿渊砸圆 越 园郾 怨怨缘怨冤和 再 越 员怨郾 源愿远造灶渊曾冤 垣
猿怨郾 苑缘圆渊砸圆 越 园郾 怨怨源缘冤袁抑制中浓度 陨缘园分别为 圆园灶早窑皂蕴 原员和 员郾 远怨灶早窑皂蕴 原员袁最低检测限 陨圆园分别为 源郾 源远灶早窑
皂蕴 原员和 园郾 猿远灶早窑皂蕴 原员遥 建立的 耘蕴陨杂粤分析方法对水尧土壤等环境样品中克百威和三唑磷的平均添加回
收率介于 愿愿郾 源豫 耀员员苑豫之间袁说明所制备的双特异性单克隆抗体和建立的 耘蕴陨杂粤分析方法可靠袁可应
用于克百威和三唑磷的多残留免疫分析遥
关键词院双特异性单克隆抗体曰克百威曰三唑磷曰多残留检测曰耘蕴陨杂粤
阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 葬 酝怎造贼蚤鄄砸藻泽蚤凿怎藻 耘灶扎赠皂藻鄄蕴蚤灶噪藻凿 陨皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠
月葬泽藻凿 燥灶 月蚤泽责藻糟蚤枣蚤糟 月燥灶燥糟造燥灶葬造 粤灶贼蚤遭燥凿赠 枣燥则 悦葬则遭怎枣怎则葬灶 葬灶凿
栽则蚤葬扎燥责澡燥泽 葬灶凿 陨贼泽 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 粤责责造蚤糟葬贼蚤燥灶
允陨晕 砸藻灶鄄赠葬燥员 摇 在匀哉 郧怎燥鄄灶蚤葬灶圆
渊员 悦燥造造藻早藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 在澡藻躁蚤葬灶早 郧燥灶早泽澡葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园猿缘曰
圆 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 孕藻泽贼蚤糟蚤凿藻 葬灶凿 耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造栽燥曾蚤糟燥造燥早赠袁 在澡藻躁蚤葬灶早 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀葬灶早扎澡燥怎袁在澡藻躁蚤葬灶早摇 猿员园园圆怨冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽澡藻 遭蚤泽责藻糟蚤枣蚤糟 皂燥灶燥糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠 贼燥 晕鄄皂藻贼澡赠造糟葬则遭葬皂葬贼藻 责藻泽贼蚤糟蚤凿藻 糟葬则遭燥枣怎则葬灶 葬灶凿 韵则早葬灶燥责澡燥泽责澡燥则怎泽
责藻泽贼蚤糟蚤凿藻 贼则蚤葬扎燥责澡燥泽 憎葬泽 责则燥凿怎糟藻凿 遭赠 澡赠遭则蚤凿燥 澡赠遭则蚤凿燥皂葬 渊 贼藻贼则葬凿燥皂葬冤 贼藻糟澡灶燥造燥早赠援 粤枣贼藻则 责怎则蚤枣赠蚤灶早 贼澡藻 葬灶贼蚤遭燥凿赠袁 贼澡藻
燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 耘蕴陨杂粤 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶袁 造蚤噪藻 则藻葬糟贼蚤燥灶 枣燥则皂葬贼袁 憎燥则噪蚤灶早 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶袁 糟燥葬贼蚤灶早 遭怎枣枣藻则 泽燥造怎贼蚤燥灶袁 燥则早葬灶蚤糟 泽燥造增藻灶贼袁
责澡燥泽责澡葬贼藻 蚤燥灶 泽贼则藻灶早贼澡 葬灶凿 责匀 增葬造怎藻 憎藻则藻 蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻凿援 栽澡藻 凿藻增藻造燥责藻凿 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 造蚤灶藻葬则 则藻糟怎则泽蚤增藻
藻择怎葬贼蚤燥灶 枣燥造造燥憎藻凿 再 越 圆园郾 园园怨造灶 渊 曾冤 原 怨郾 怨圆怨猿 渊 砸圆 越 园郾 怨怨缘怨 葬灶凿 再 越 员怨郾 源愿远造灶 渊 曾冤 垣 猿怨郾 苑缘圆 渊 砸圆 越 园郾 怨怨源缘冤 枣燥则
糟葬则遭燥枣怎则葬灶 葬灶凿 贼则蚤葬扎燥责澡燥泽袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 陨灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 则葬贼藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 陨缘园 葬灶凿 陨圆园 增葬造怎藻泽 憎藻则藻 圆园灶早窑皂蕴 原员袁源郾 源远灶早
窑皂蕴 原员 葬灶凿 员郾 远怨灶早窑皂蕴 原员袁 园郾 猿远灶早窑皂蕴 原员 枣燥则 糟葬则遭燥枣怎则葬灶 葬灶凿 贼则蚤葬扎燥责澡燥泽袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 皂藻葬灶 则藻糟燥增藻则赠 燥枣 糟葬则遭燥枣怎则葬灶
葬灶凿 贼则蚤葬扎燥责澡燥泽 蚤灶 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼葬造 泽葬皂责造藻泽 泽怎糟澡 葬泽 憎葬贼藻则 葬灶凿 泽燥蚤造泽 憎藻则藻 愿愿郾 源豫 葬灶凿 员员苑豫 袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援 栽澡藻 则藻泽怎造贼
泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 凿藻增藻造燥责藻凿 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 遭葬泽藻凿 燥灶 遭蚤泽责藻糟蚤枣蚤糟 皂燥灶燥糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠 憎葬泽 则藻造蚤葬遭造藻 葬灶凿 怎泽藻枣怎造 枣燥则 皂怎造贼蚤鄄
则藻泽蚤凿怎藻 葬泽泽葬赠 枣燥则 责藻泽贼蚤糟蚤凿藻 糟葬则遭燥枣怎则葬灶 葬灶凿 贼则蚤葬扎燥责澡燥泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院月蚤泽责藻糟蚤枣蚤糟葬 皂燥灶燥糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿赠曰 悦葬则遭燥枣怎则葬灶曰 栽则蚤葬扎燥责澡燥泽曰 酝怎造贼蚤鄄则藻泽蚤凿怎藻曰 耘蕴陨杂粤
缘员缘
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
摇 摇 农药残留的危害性目前已经被人们广泛认识袁其
违禁使用和超量滥用而引起的食品安全问题时有发
生袁如何提高其监管效率尧完善监管体系尧提升检测技
术水平是保障食品质量安全的最后环节咱员暂 遥 由于目
前农药品种繁多袁多残留现象严峻袁开展多残留检测技
术研究袁尤其是实现快速尧高通量尧能现场操作等检测
技术显得尤为迫切袁而免疫分析方法咱圆暂正是具备这些
特点被应用与农药多残留检测分析遥 目前采用免疫分
析方法进行农药多残留检测通常有两种方法袁一种是
采用一类药物的共有结构作为免疫半抗原袁获得对同
类农药具有特异性识别反应的广谱抗体袁如 粤造燥糟燥糟藻则
等咱猿暂用有机磷的通用结构膦酸作为半抗原袁成功制备
了广谱性的多克隆抗体袁且对 员园 种以上的有机磷农药
有特异性识别曰骆爱兰等咱源暂用拟除虫菊酯类农药的共
有结构间苯氧基苯甲酸渊孕月粤冤为半抗原袁也成功制备
了广谱性的多克隆抗体袁并对 缘 种菊酯有特异性识别遥
另一种是采用将多个农药的半抗原偶联到载体蛋白上
制备成人工抗原袁经过动物免疫获得对目标农药有特
异性识别的野宽谱冶抗体袁如 宰葬灶早 等咱缘暂通过对人工抗
原的设计袁将克百威尧三唑磷尧毒死蜱和甲基对硫磷半
抗原偶联到一个载体蛋白分子上袁制备出了多抗原决
定簇的人工抗原并获得了能同时识别上述 源 种农药的
野宽谱特异性冶多克隆抗体袁达到多残留检测的目的遥
抗体在农药多残留免疫分析中的作用非常关键袁
已报道的多残留免疫分析的抗体多为多克隆抗体袁由
于多克隆抗体会随着动物种类及个体差异而有变化袁
生产数量有限及可重复性差袁在应用中会受到一定的
限制袁随着单克隆抗体技术的出现咱远暂 袁解决了抗体制
备过程中抗体性状不稳定的问题遥 特别是基于杂交 原
杂交瘤技术的双特异性单克隆抗体技术的建立咱苑 原 愿暂和
应用咱怨 原 员员暂 袁为多残留免疫分析技术提供了新的思路袁
该技术从抗体的结构和特性上入手袁区别于传统的多
残留免疫分析技术在半抗原和人工抗原的结构上进行
一系列的改造袁通过杂交 原杂交瘤技术获得能特异性
识别两种小分子化合物甚至是两类小分子化合物的双
特异性单克隆抗体袁为小分子化合物多残留检测技术
的发展开辟新的研究思路和发展方向遥
本论文以克百威和三唑磷为研究对象袁在前期研
制抗克百威和三唑磷双特异性单克隆抗体的基础
上咱员圆暂 袁以包被抗体尧酶标半抗原渊 栽匀匀藻鄄匀砸孕袁月云晕月鄄
匀砸孕冤和样品中的半抗原竞争反应模式袁建立检测克百
威和三唑磷的 耘蕴陨杂粤方法袁为双特异性单克隆抗体在
兽药快速检测中的应用前景提供重要技术依据遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 试验材料
员郾 员郾 员摇 试剂耗材摇 双特异性单克隆抗体尧克百威尧三
唑磷酶标半抗原由本实验室自制曰怨怨郾 愿豫克百威标准
品由浙江省疾病预防控制中心提供曰三唑磷渊怨怨郾 缘豫 冤
标准品由浙江省农药检定所提供曰辣根过氧化物酶
渊匀砸孕冤为 粤酝砸耘杂悦韵 产品曰美国 悦韵砸晕陨晕郧怨远 孔酶标
板渊货号 怨园员愿冤曰土壤样品和水样品取自浙江杭州曰其
他化学试剂均为国产分析纯遥
员郾 员郾 圆摇 主要仪器 摇 上海嘉鹏科技有限公司 砸耘 原 缘圆
粤粤粤型旋转蒸发器曰上海欣茂仪器公司 哉灾 苑缘园源责糟 型
分光光度计曰杂陨耘酝耘晕杂 公司低温冰箱曰太仓市科教器
材厂 宰匀 原 愿远员 漩涡震荡器曰杂葬则贼燥则蚤怎泽 公司电子天平曰
月蚤燥鄄砸葬凿 远愿园 酶标仪曰美国 酝阅 公司 酝葬曾圆园园园 型洗板
机曰江苏康泰医疗器材厂 酝酝 原员 型微量振荡器遥
员郾 圆摇 试验方法
员郾 圆郾 员摇 双特异性单克隆抗体的制备和纯化摇 双特异
性单克隆抗体的制备方法按照 允蚤灶 等咱员圆暂的方法进行遥
克百威尧三唑磷半抗原和人工抗原的合成分别按照朱
国念等咱员猿暂和 郧怎蚤 等咱员源暂的方法进行袁制备的人工抗原
免疫小鼠后取脾脏细胞与 杂孕圆 辕 园 细胞融合袁然后通过
检测尧筛选能分泌克百威单克隆抗体和分泌三唑磷单
克隆抗体的杂交瘤细胞株袁在此基础上袁采用诱导法袁
使杂交瘤细胞的 匀郧孕砸栽酶或 栽运酶缺失袁然后采用杂
交 原杂交瘤技术融合筛选获得抗克百威和三唑磷的四
体杂交瘤细胞株袁并通过注射 月粤蕴月 辕 悦 小鼠进行腹水
制备遥 制备的腹水采用辛酸 原硫酸铵法纯化咱员缘暂 袁用紫
外分光光度计分别测定纯化抗体的紫外 圆远园 灶皂 和
圆愿园 灶皂的光密度袁用 蕴燥憎则赠鄄噪葬造燥噪葬则 公式计算蛋白质的
浓度袁其余纯化的单抗 原 苑园益保存备用遥
员郾 圆郾 圆摇 包被温度和时间选择摇 在一定温度渊园 耀 源猿益冤
和时间渊园 耀 源愿 澡冤范围内袁包被效果随时间的延长和温
度的升高而增加袁然而由于高温尤其是长时间高温易引
起蛋白质变性袁包被时间过长尧温度过高都不利于包被遥
因此本试验选择在 源益 包被过夜渊员圆 澡冤曰猿苑益包被 员 澡尧
圆 澡尧猿 澡和 源猿益包被 员 澡尧圆 澡尧猿 澡等几种模式袁通过测定
韵阅源怨园灶皂值以确定最佳包被温度和时间遥
员郾 圆郾 猿摇 包被缓冲液选择摇 本实验选用 园郾 园缘 皂燥造窑蕴 原员
责匀 怨郾 远 悦月杂尧园郾 员 皂燥造窑蕴 原员 责匀 怨郾 远 悦月杂尧园郾 圆 皂燥造窑蕴 原员 责匀
怨郾 远 悦月杂尧生理盐水尧责匀 苑郾 园 孕月杂尧责匀 苑郾 源 孕月杂尧责匀 愿郾 园
孕月杂尧责匀 缘郾 缘 柠檬酸 原 晕葬圆匀孕韵源尧蒸馏水稀释包被抗原
等几种模式进行包被袁通过测定 韵阅源怨园灶皂值以选择包被
远员缘
摇 源 期 基于双特异性单克隆抗体的克百威和三唑磷多残留 耘蕴陨杂粤分析方法研究及在环境样品中应用
缓冲液遥
员郾 圆郾 源摇 最佳工作浓度选择摇 将抗体用最佳包被液稀
释成一系列浓度袁 分别依次加入 怨远 孔酶标板
渊员园园滋蕴 辕 憎藻造造冤袁最佳包被温度和包被时间下进行包被
后 孕月杂栽洗涤 猿 次曰加 圆豫脱脂牛奶每孔 猿园园滋蕴袁猿苑益
孵育 园郾 缘 澡袁孕月杂栽洗涤 猿 次曰加入预先以封闭液稀释成
不同浓度的酶标半抗原渊员园园滋蕴 辕 憎藻造造冤袁猿苑益下孵育 员
澡袁孕月杂栽洗涤 猿 次曰加入底物溶液渊员园园滋蕴 辕 憎藻造造冤袁猿苑益
温育 员缘皂蚤灶袁加入终止液渊缘园滋蕴 辕 憎藻造造冤袁用酶标仪测定
韵阅源怨园灶皂值袁以 韵阅源怨园 灶皂值约为 员郾 园袁抗体 原酶标半抗原用
量较少的浓度组合为抗体 原抗原的工作浓度遥
员郾 圆郾 缘摇 有机溶剂选择摇 在最佳工作浓度下袁农药标样
缓冲液中加入一定含量的甲醇尧丙酮尧乙腈渊含量为 缘尧
员园尧圆园尧源园豫 袁与酶标抗原混合后有机溶剂最终含量为
圆郾 缘尧缘尧员园尧圆园豫 冤袁通过测定不同溶剂不同浓度下对抗
原抗体结合反应的影响袁选择影响最小的溶剂和浓度
作为 耘蕴陨杂粤反应条件遥
员郾 圆郾 远摇 离子强度选择摇 用含不同离子浓度的 孕月杂 缓
冲液 渊园郾 园员皂燥造窑蕴 原员袁 园郾 园圆皂燥造窑蕴 原员袁 园郾 园缘皂燥造窑蕴 原员 和
园郾 员皂燥造窑蕴 原员冤配置标样袁考察不同离子浓度下对抗原抗
体结合反应的影响袁选择影响最小的离子浓度作为
耘蕴陨杂粤反应条件遥
员郾 圆郾 苑摇 责匀值选择摇 用含不同 责匀值强度的 孕月杂 缓冲
液渊责匀值为 远郾 园袁远郾 缘袁苑郾 园袁苑郾 源袁愿郾 园 和 愿郾 缘冤配置标样袁
考察不同 责匀 值对抗原抗体结合反应的影响袁选择影
响最小的 责匀值作为 耘蕴陨杂粤反应条件遥
员郾 圆郾 愿摇 样品添加回收率实验摇 样品前处理方法为水
样院吸取 员园皂蕴 预先过滤或离心的水样品袁准确添加以
甲醇配制的农药标液 园郾 员皂蕴袁混匀袁直接用于 耘蕴陨杂粤
检测遥 土壤样品院将土壤样品风干袁过 远园 目试验筛袁称
取 圆 早 样品袁以 圆皂蕴 乙腈震荡提取 员皂蚤灶袁离心渊源 园园园
则窑皂蚤灶 原员袁 缘皂蚤灶冤袁吸取 员皂蕴上清液袁 氮气吹干袁加入一
定量的 孕月杂渊优化条件下的缓冲液冤袁旋涡震荡 员皂蚤灶袁
用于 耘蕴陨杂粤检测遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 双特异性单克隆抗体的制备和纯化
融合的四体杂交瘤细胞经培养 员园凿袁同时用克百
威人工抗原和三唑磷人工抗原检测细胞培养上清袁经
阳性测定和灵敏度测定袁获得一株四体杂交瘤细胞
员圆悦员袁后经多次克隆后袁细胞悬液注射小鼠腹腔制备
腹水袁员 周后抽取腹水遥 经测定袁腹水对克百威和三唑
磷的效价均在 员 伊 员园 原远以上袁以 孕 辕 晕 跃 圆郾 员 为单克隆抗
体最大稀释度遥 腹水采用辛酸 原硫酸铵纯化后冻干并
保存于 原苑园益遥
圆郾 圆摇 包被温度和时间
不同包被温度和时间的影响结果见表 员遥 由表中
可知袁包被 员 澡情况下袁猿苑益与 源猿益的包被效果没有明
显差别袁当包被时间超过 员 澡情况下袁猿苑益包被效果比
源猿益包被效果要好袁说明当包被温度过高袁一方面可能
会产生高吸附速率和高解吸速率袁另一方面可能是影
响抗体或包被抗原的性状的稳定性袁导致包被效果的
下降遥 源益 包被 员圆 澡条件下的包被效果与 猿苑益包被 圆
澡条件下的效果没有明显差别袁但是 源益包被所需时间
相对更长袁因此袁选择 猿苑益包被 圆 澡条件作为最佳包被
条件遥
表 员摇 不同包被温度尧时间的包被效果
栽葬遭造藻 员摇 韵阅源怨园灶皂 增葬造怎藻泽 怎灶凿藻则 凿蚤枣枣藻则藻灶贼
糟燥葬贼蚤灶早 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻 葬灶凿 贼蚤皂藻
温度 栽藻皂责藻则葬贼怎则藻 时间 栽蚤皂藻 韵阅源怨园灶皂
源益 员圆 澡 员援 猿苑源
猿苑益 员 澡 员援 员员圆
圆 澡 员援 源苑缘
猿 澡 员援 源愿猿
源猿益 员 澡 员援 园怨远
圆 澡 员援 猿远猿
猿 澡 员援 猿苑员
圆郾 猿摇 包被缓冲液
不同缓冲液包被效果见表 圆遥 由表中可知袁用蒸
馏水包被的酶标板效果最差袁说明一定的离子浓度有
利于蛋白质分子在载体表面的吸附遥 在 悦月杂 缓冲体
系中袁随着 悦月杂 离子浓度的增加袁韵阅源怨园灶皂值降低袁包被
效果下降曰在 孕月杂缓冲体系中袁责匀 在 愿郾 园 时包被效果
比 责匀在 苑郾 源 和 苑郾 园 时要好袁但在相同 责匀 值条件下袁
离子浓度的变化影响不是很明显袁因此袁选择 园郾 园缘
皂燥造窑蕴 原员 责匀 愿郾 园 的 孕月杂作为抗体包被缓冲液遥
圆郾 源摇 工作浓度确定
采用方阵试验法测定抗体和酶标半抗原的稀释
度袁三唑磷采用异源分析袁酶标半抗原为 栽匀匀藻鄄匀砸孕袁
克百威酶标半抗原为 月云晕月鄄匀砸孕袁通过测定袁韵阅源怨园灶皂值
在 员郾 园 左右袁灵敏度最高的浓度组合为 月蚤泽酝糟粤遭尧
栽匀匀藻鄄匀砸孕的浓度分别为 源滋早窑皂蕴 原员和 员缘郾 远灶早窑皂蕴 原员曰
月蚤泽酝糟粤遭袁 月云晕月鄄匀砸孕 的浓度分别为 员滋早窑皂蕴 原员 和
员缘郾 远灶早窑皂蕴 原员袁以此组合作为最优工作浓度遥
苑员缘
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
图 员摇 有机溶剂对克百威渊左冤和三唑磷渊右冤耘蕴陨杂粤的影响
云蚤早援 员摇 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 燥则早葬灶蚤糟 泽燥造增藻灶贼 燥灶 悦葬则遭燥枣怎则葬灶 渊 造藻枣贼冤 葬灶凿 栽则蚤葬扎燥责澡燥泽 渊则蚤早澡贼冤 耘蕴陨杂粤
表 圆摇 不同缓冲液的包被效果比较
栽贼葬遭造藻 圆摇 悦燥皂责葬则蚤泽燥灶 燥枣 糟燥葬贼蚤灶早 藻枣枣藻糟贼
憎蚤贼澡 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 糟燥葬贼蚤灶早 遭怎枣枣藻则泽
缓冲液
月怎枣枣藻则
责匀值
责匀 灾葬造怎藻
离子强度
孕澡燥泽责澡葬贼藻 蚤燥灶
渊皂燥造窑蕴 原员 冤
韵阅源怨园灶皂
悦月杂 怨援 远 园援 园缘 员援 猿圆源
园援 员园 员援 圆缘远
园援 圆园 员援 员愿苑
孕月杂 苑援 园 园援 园员 员援 圆圆猿
园援 园缘 员援 圆圆远
苑援 源 园援 园员 员援 圆愿缘
园援 园缘 员援 猿员圆
愿援 园 园援 园员 员援 猿缘远
园援 园缘 员援 缘园猿
柠檬酸 原 晕葬圆匀孕韵源悦蚤贼则蚤糟 葬糟蚤凿 遭怎枣枣藻则
缘援 缘 园援 园缘 员援 圆缘远
生理盐水 杂葬造蚤灶葬 苑援 园 园援 员缘 员援 猿员缘
蒸馏水 阅蚤泽贼蚤造造藻凿 憎葬贼藻则 苑援 园 园 园援 猿猿源
圆郾 缘摇 有机溶剂
有机溶剂的影响见图 员遥 由图可知袁各种有机溶
剂含量高时对 耘蕴陨杂粤反应均有非常明显的抑制作用遥
对克百威的影响袁随着有机溶剂含量的增加袁吸光值
渊粤遭皂葬曾冤逐渐降低袁而 陨缘园值则逐渐升高曰特别是在高
浓度情况下袁变化趋势更大袁其中在含 源园豫丙酮和乙
腈的情况下连标准曲线都无法建立袁在低浓度情况下
粤遭皂葬曾 和 陨缘园变化不大袁其中丙酮的 粤遭皂葬曾比甲醇和乙
腈高袁而 陨缘园比甲醇和乙腈要低曰对三唑磷的影响袁大趋
势上随着有机溶剂含量的增加袁粤遭皂葬曾 逐渐降低袁而
陨缘园值则逐渐升高袁其中 陨缘园值的变化波动范围比较大袁
丙酮和乙腈在 源园豫含量的条件下标准曲线建立不成
功袁丙酮含量在 缘豫条件下的 陨缘园最小遥 综合考虑袁克百
威和三唑磷有机溶剂优化选为丙酮袁含量均为 缘豫 遥
圆郾 远摇 离子强度
离子强度影响见图 圆遥 由图可知袁对克百威的影
响袁随着离子浓度的增加袁粤遭皂葬曾没有明显的变化遥 而
陨缘园值则逐渐降低袁在 园郾 员皂燥造窑蕴 原员浓度达到最低值遥 因
此袁选择 园郾 员皂燥造窑蕴 原员离子浓度的 孕月杂 作为最优的缓冲
液曰对三唑磷的影响袁随着离子浓度的增加袁粤遭皂葬曾 也
没有明显变化袁而 陨缘园值变化则先降低袁后逐渐升高袁在
园郾 园缘皂燥造窑蕴 原员时达到最低点袁因此袁选择 园郾 园缘皂燥造窑蕴 原员
离子浓度的 孕月杂作为最优的缓冲液遥
圆郾 苑摇 责匀值
责匀值影响结果见图 猿遥 由图可知袁随着 责匀 值的
愿员缘
摇 源 期 基于双特异性单克隆抗体的克百威和三唑磷多残留 耘蕴陨杂粤分析方法研究及在环境样品中应用
图 圆摇 离子浓度对克百威渊左冤和三唑磷渊右冤耘蕴陨杂粤的影响
云蚤早援 圆摇 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 陨燥灶蚤糟 杂贼则藻灶早贼澡 燥灶 悦葬则遭燥枣怎则葬灶 渊 造藻枣贼冤 葬灶凿 栽则蚤葬扎燥责澡燥泽 渊则蚤早澡贼冤 耘蕴陨杂粤
图 猿摇 责匀对克百威渊左冤和三唑磷渊右冤耘蕴陨杂粤的影响
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 藻枣枣藻糟贼 燥枣 责匀 燥灶 悦葬则遭燥枣怎则葬灶 渊 造藻枣贼冤 葬灶凿 栽则蚤葬扎燥责澡燥泽 渊则蚤早澡贼冤 耘蕴陨杂粤
变化袁粤遭皂葬曾没有明显的波动变化袁而 陨缘园值的波动则
较大袁随着 责匀值的升高袁克百威和三唑磷的 陨缘园值均出
现先下降后回升的现象袁其中克百威在 责匀 值为 苑郾 源
时 陨缘园值达到最低点袁三唑磷在 责匀 值为 苑郾 园 时 陨缘园值达
到最低点袁因此选择 责匀 苑郾 园 和 苑郾 源 作为三唑磷和克百
威的最优 责匀值遥
圆郾 愿摇 优化条件汇总
通过对包被体系尧最佳工作浓度尧有机溶剂尧离子
浓度和 责匀值的条件筛选袁 最优化的 耘蕴陨杂粤 条件汇总
见表 猿遥
在优化的 耘蕴陨杂粤分析条件下袁对克百威和三唑磷
分别建立标准曲线袁以考察其在最优化的反应体系中
的检测灵敏度袁结果见图 源遥 由图可知袁克百威 耘蕴陨杂粤
反应标准曲线线性回归方程为 再 越 圆园郾 园园怨造灶 渊 曾冤 原
怨郾 怨圆怨猿袁砸圆 越 园郾 怨怨缘怨袁 陨缘园为 圆园灶早援 皂蕴 原员袁 陨员园为 圆郾 苑园灶早援
皂蕴 原员袁线性范围 源郾 源远 耀 愿怨郾 缘圆灶早援 皂蕴 原员曰三唑磷 耘蕴陨杂粤
反应标准曲线线性回归方程为 再 越 员怨郾 源愿远造灶 渊 曾冤 垣
猿怨郾 苑缘圆袁砸圆 越 园郾 怨怨源缘袁陨缘园为 员郾 远怨灶早援 皂蕴 原员袁陨员园为 园郾 圆圆灶早援
皂蕴 原员袁线性范围 园郾 猿远 耀 苑郾 愿怨灶早援 皂蕴 原员遥
圆郾 怨摇 样品分析
根据建立的分析方法袁进行添加回收率试验袁结果
见表 源遥 克百威添加回收率情况如下院克百威水样的
添加浓度为 缘尧员园 和 圆园灶早窑皂蕴 原员 猿 个梯度袁从试验结果
来看袁水样的平均回收率在 员园员郾 源豫 耀 员员苑郾 园豫范围内
波动袁其中自来水的波动最大袁在 远猿豫 耀 员源远豫的大跨
度区间范围内袁自来水的回收率结果的变异系数大袁达
到 圆园豫以上袁其他水样的回收率变化范围相对要窄袁
在 苑愿豫 耀 员源圆豫 之间袁且变异系数的变化范围在
员员郾 远豫 耀员远郾 员豫之间袁说明测定结果比较稳定袁方法可
行性高曰土壤样品的添加浓度为 员园 和 圆园灶早窑皂早 原员袁 回
怨员缘
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
摇 摇 摇 摇 摇 表 猿摇 耘蕴陨杂粤条件优化总结
栽葬遭造藻 猿摇 杂怎皂皂葬则赠 燥枣 贼澡藻 耘蕴陨杂粤 悦澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟泽
包被抗体浓度
粤灶贼蚤遭燥凿赠 悦燥葬贼蚤灶早 糟燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
三唑磷
栽则蚤葬扎燥责澡燥泽
克百威
悦葬则遭燥枣怎则葬灶
月蚤泽酝糟粤遭 渊滋早窑皂蕴 原员 冤 源 员
咱栽匀匀藻鄄匀砸孕暂 渊灶早窑皂蕴 原员 冤 员缘远 灶葬葬
咱月云晕月鄄匀砸孕暂渊灶早窑皂蕴 原员 冤 灶葬葬 员缘远
缓冲液条件 月怎枣枣藻则 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶
包被缓冲液 悦燥葬贼蚤灶早 月怎枣枣藻则 园援 园缘 酝 孕月杂 园援 园缘 酝 孕月杂
封闭液 原脱脂牛奶渊豫 冤月造燥糟噪蚤灶早 月怎枣枣藻则 圆 圆
有机溶剂渊豫 冤杂燥造增藻灶贼 贼燥造藻则葬灶糟藻 缘豫 粤糟藻贼燥灶藻 缘豫 粤糟藻贼燥灶藻
离子浓度 孕澡燥泽责澡葬贼藻 蚤燥灶渊皂 皂燥造窑蕴 原员 冤 缘园 员园园
责匀值 苑援 园 苑援 源
标准曲线参数 粤灶葬造赠贼蚤糟葬造 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤泽贼蚤糟泽 燥枣 泽贼葬灶凿葬则凿 糟怎则增藻
陨缘园 渊灶早窑皂蕴 原员 冤 员援 远怨 圆园援 园
陨圆园 耀 陨愿园 园援 猿远 耀 苑援 愿怨 源援 源远 耀 愿怨援 缘圆
陨员园 园援 圆圆 圆援 苑园
反应体系参数 粤泽泽葬赠 糟燥灶凿蚤贼蚤燥灶
包被时间 悦燥葬贼蚤灶早 渊澡冤 圆 圆
反应时间 陨皂皂怎灶燥则藻葬糟贼蚤燥灶渊澡冤 员 员
显色时间 悦燥造燥则 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼渊皂蚤灶冤 员缘 员缘
摇 摇 注院葬没有应用 晕燥贼藻院 葬灶燥贼 葬责责造蚤糟葬遭造藻
图 源摇 克百威渊左冤 和三唑磷渊右冤耘蕴陨杂粤标准曲线
云蚤早援 源摇 耘蕴陨杂粤 泽贼葬灶凿葬则凿 糟怎则增藻 枣燥则 悦葬则遭燥枣怎则葬灶 渊 造藻枣贼冤 葬灶凿 栽则蚤葬扎燥责澡燥泽 渊则蚤早澡贼冤
收率平均值在 愿怨郾 员豫 耀 员园远郾 猿豫 之间袁波动范围在
愿圆豫 耀员圆员豫之间袁变异系数低袁在 缘郾 源豫 耀 员猿郾 源豫之
间袁说明土壤样品检测结果稳定袁方法可靠性高遥
摇 摇 三唑磷添加回收率情况如下院三唑磷水样添加浓
度为 园郾 缘尧员 和 缘灶早援 皂蕴 原员袁回收率结果显示袁平均回收
率在 怨员郾 圆豫 耀员圆缘郾 愿豫范围内遥 其中自来水的波动范
围最大袁在 苑远豫 耀 员缘源豫之间袁检测结果偏高袁变异系
数高袁在 员缘郾 猿豫 耀 猿远豫范围内袁其余的水样的回收率
在比较理想的范围内波动袁苑源豫 耀 员猿源豫之间袁而且变
异系数相对自来水要低袁说明对水样的检测方法可信
度较好曰对土壤样品袁其平均回收率在 愿愿郾 源豫 耀
怨苑郾 源豫范围内袁变化波动范围在 苑远豫 耀 员园愿豫 袁而且变
异系数低袁苑郾 缘豫 耀 员园郾 缘豫之间袁说明建立的方法能很
好的检测土壤样品袁建立的免疫分析方法可信遥
园圆缘
摇 源 期 基于双特异性单克隆抗体的克百威和三唑磷多残留 耘蕴陨杂粤分析方法研究及在环境样品中应用
表 源摇 克百威尧三唑磷样品添加回收率分析
栽葬遭造藻 源摇 粤灶葬造赠泽蚤泽 遭赠 贼澡藻 燥责贼蚤皂蚤扎藻凿 耘蕴陨杂粤 燥枣 泽葬皂责造藻泽 泽责蚤噪藻凿 憎蚤贼澡 糟葬则遭燥枣怎则葬灶
克百威 悦葬则遭燥枣怎则葬灶 三唑磷 栽则蚤葬扎燥责澡燥泽
样品
杂葬皂责造藻
添加
浓度
悦燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
渊灶早窑皂蕴 原员 冤
回收率
砸藻糟燥增藻则赠
渊豫 冤
变化
范围
砸葬灶早藻
变异系数
悦灾渊豫 冤
样品
杂葬皂责造藻
添加
浓度
悦燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶
渊灶早窑皂蕴 原员 冤
回收率
砸藻糟燥增藻则赠
渊豫 冤
变化
范围
砸葬灶早藻
变异
系数
悦灾渊豫 冤
自来水 缘 员园员援 源 远猿 耀 员猿远 圆员援 远 自来水 园援 缘 怨员援 圆 苑远 耀 员猿愿 圆远
栽葬责 憎葬贼藻则 员园 员园猿援 园 苑远 耀 员源远 圆圆援 愿 栽葬责 憎葬贼藻则 员 员圆员援 怨 怨园 耀 员缘源 员苑援 愿圆园 员员源援 圆 苑苑 耀 员源缘 圆园援 愿 缘 员圆员援 源 愿猿 耀 员源源 员缘援 猿
池塘水 缘 员员苑援 园 怨猿 耀 员源圆 员远援 员 河水 园援 缘 员园缘援 愿 愿圆 耀 员圆缘 员缘援 圆
孕燥灶凿 憎葬贼藻则 员园 员员圆援 苑 愿远 耀 员猿缘 员源援 远 孕燥灶凿 憎葬贼藻则 员 员园远援 缘 愿园 耀 员猿源 员苑援 缘圆园 员园源援 愿 愿园 耀 员圆远 员员援 远 缘 员圆缘援 愿 员员愿 耀 员猿源 源援 员
河水 缘 员园缘援 远 苑愿 耀 员圆猿 员缘援 源 池塘水 园援 缘 怨远援 员 苑缘 耀 员圆愿 员苑援 缘
砸蚤增藻则 憎葬贼藻则 员园 员园猿援 圆 愿苑 耀 员圆员 员圆援 愿 砸蚤增藻则 憎葬贼藻则 员 员园员援 园 苑源 耀 员圆源 员缘援 愿圆园 员园缘援 圆 愿苑 耀 员猿愿 员员援 怨 缘 员园猿援 源 怨苑 耀 员员愿 远援 源
黄红壤 员园 怨远援 远 怨圆 耀 员园圆 缘援 圆 黄红壤 员 愿愿援 源 苑远 耀 怨怨 怨援 猿
再藻造造燥憎鄄则藻凿 泽燥蚤造 圆园 愿怨援 员 愿圆 耀 怨远 缘援 源 再藻造造燥憎鄄则藻凿 泽燥蚤造 圆 怨园援 愿 愿园 耀 员园猿 员园援 缘
小粉土 员园 员园远援 猿 怨猿 耀 员员远 怨援 缘 小粉土 员 怨源援 猿 愿苑 耀 员园远 苑援 缘
杂蚤造贼鄄造燥葬皂赠 责葬凿凿赠 泽燥蚤造 圆园 员园源援 愿 愿远 耀 员圆员 员猿援 源 杂蚤造贼鄄造燥葬皂赠 责葬凿凿赠 泽燥蚤造 圆 怨苑援 源 愿远 耀 员园愿 愿援 园
青紫泥 员园 怨愿援 园 愿怨 耀 员员猿 愿援 源 青紫泥 员 怨苑援 猿 愿愿 耀 员园愿 愿援 猿
孕怎则责造藻 糟造葬赠藻凿 责葬凿凿赠 泽燥蚤造 圆园 怨苑援 缘 怨猿 耀 员园苑 缘援 远 孕怎则责造藻 糟造葬赠藻凿 责葬凿凿赠 泽燥蚤造 圆 怨远援 员 愿圆 耀 员园愿 怨援 苑
猿摇 讨论
猿郾 员摇 免疫分析技术是农兽药快速多残留检测技术发
展的趋势
农药多残留酶免疫分析法的基本原理是根据待测
物的共性结构或共有结构特征袁设计并合成具有其通
用结构特征的半抗原袁偶联大分子蛋白后作为人工抗
原并免疫动物袁通过制备特异性抗体渊或称宽谱特异
性抗体尧广谱特异性抗体冤袁利用抗体建立酶免疫吸附
测定渊耘蕴陨杂粤冤尧免疫胶体金渊郧陨悦粤冤等免疫分析法遥 目
前已有农药多残留免疫分析技术相关研究报道袁如
孕怎造造藻灶等咱员远暂 尧酝葬噪等咱员苑暂 尧祝金凤等咱员愿暂 尧杨挺等咱员怨暂和李
志茹等咱圆园暂建立的针对拟除虫菊酯类农药的免疫多残
留分析技术袁悦燥造蚤灶 等咱圆员暂 尧杂怎凿蚤 等咱圆圆暂 尧月葬灶噪泽 等咱圆猿暂 尧允葬灶早
等咱圆源暂 尧刘贤进等咱圆缘暂和 蕴蚤葬灶早 等咱圆远暂等开展了有机磷农
药的多残留免疫分析研究遥 另外袁在氟喹诺酮类咱圆苑 原 圆愿暂
和磺胺类咱圆怨 原 猿园暂等兽药方面也有多残留免疫分析技术
研究的报道袁说明随着免疫分析技术的深入应用研究袁
已在农兽药多残留快速检测中发挥着越来越重要的作
用袁已逐渐成为农兽药多残留检测技术发展趋势遥
抗体在免疫分析技术中的作用非常关键袁目前报
道的农兽药多残留免疫分析技术具有两个特点院一是
从改造抗原结构入手袁通过设计合成一类药物的通用
结构来制备抗体袁实现对一类药物的检测曰二是所制备
的抗体基本上以多克隆抗体为主遥 由于多克隆抗体批
间差异性比较大袁而且不能实现同性状抗体的大量生
产袁不利于后续的产业化开发袁存在一定的局限性遥 根
据抗体自身的特性袁每个天然抗体分子具有两个完全
一样的抗原结合位点袁如何充分发挥其结合位点袁扩大
其识别种类袁以便能应用于多残留检测分析袁为探索农
兽药多残留免疫分析提供新的思路遥 因此袁通过改造
抗体自身的结构来实现改变抗原结合位点的识别目
标袁已有通过使用化学交联的方法制备双特异性抗体
的报道咱猿员暂 袁但由于该方法制备的抗体复合物形状不稳
定袁限制了其发展袁而通过杂交 原杂交瘤技术制备双特
异性单克隆抗体则能很好的解决上述存在的不足袁为
多残留免疫分析技术提供新的研究思路袁并有可能发
展为新的研究方向遥
猿郾 圆摇 双特异性单克隆抗体技术为农兽药多残留免疫
分析技术发展提供新思路
采用细胞工程法中的四体杂交瘤技术制备的双特
员圆缘
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员猿袁圆苑渊源冤院园缘员缘 耀 园缘圆圆
异性单克隆抗体袁与以往的采用化学偶联的方法制备
的双特异性抗体相比具有抗体形状更加稳定尧产量不
受限制等独特优势袁根据其特性袁将双特异性单克隆抗
体应用与小分子药物的多残留免疫快速分析必将是未
来的趋势遥 本试验在前期制备双特异性单克隆抗体的
基础上袁经过一系列的条件如包被缓冲体系尧离子强
度尧有机溶剂和 责匀值等的优化袁建立双特异性单克隆
抗体的最佳 耘蕴陨杂粤 分析技术袁并通过对水尧土壤等环
境样品的添加回收率分析袁根据试验结果说明所制备
的双特异性单克隆抗体其抗体特性形状稳定袁添加回
收率结果显示袁所建立的 耘蕴陨杂粤 分析方法可信度高袁
可用于环境样品的检测遥
猿郾 猿摇 本试验还需进一步开展研究的问题
本论文是在抗克百威 原三唑磷双特异性单克隆抗
体基础上建立 耘蕴陨杂粤分析方法袁该方法主要针对单一
目标化合物开展检测袁而多残留分析待测样品中往往
同时含有多种目标化合物袁之间会有相互干扰袁会影响
分析的精度袁因此袁下一步将重点开展样品中多种目标
化合物同时存在下的检测分析方法研究袁分析多药物
残留下的信号叠加效应袁并建立新的评价指标和判定
标准袁以更好的发挥双特异性单克隆抗体在多残留免
疫分析中的应用价值遥
源摇 结论
本论文以抗克百威 原三唑磷双特异性单克隆抗体
为研究对象袁通过对反应缓冲体系条件的优化和筛选袁
建立最佳条件下的 耘蕴陨杂粤 分析方法袁并进行添加回收
率试验袁从添加回收率试验结果说明所建立的 耘蕴陨杂粤
分析方法适合于水尧土壤等环境样品的检测袁具有很好
的应用价值袁说明双特异单克隆抗体能应用于农兽药
多残留快速免疫分析技术袁下一步将重点开展混合样
品的分析技术研究遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 罗小勇援 农药残留及其对策咱允暂 援 中国农学通报袁圆园园怨袁圆缘渊员愿冤院
猿源源 原 猿源苑
咱 圆 暂 摇 杂葬皂葬则葬躁藻藻憎葬 哉袁 宰藻蚤 悦 陨袁 匀怎葬灶早 栽 杂援 粤责责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠
蚤灶 贼澡藻 枣燥燥凿 蚤灶凿怎泽贼则赠咱 允暂 援 悦则糟 悦则蚤贼蚤糟葬造 砸藻增蚤藻憎泽 蚤灶 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿
晕怎贼则蚤贼蚤燥灶袁 员怨怨员袁圆怨院源园猿 原 源猿源
咱 猿 暂 摇 粤造糟燥糟藻则袁 酝 允 悦袁 阅蚤造造燥灶 孕 孕 袁 酝葬皂蚤灶早 月 酝袁 阅燥赠藻灶 悦袁 蕴藻藻 匀 粤袁
阅葬造赠 杂 允袁 韵爷 运藻灶灶藻凿赠 砸袁 酝燥则早葬灶 酝 砸 粤援 哉泽藻 燥枣 责澡燥泽责澡燥灶蚤糟 葬糟蚤凿
葬泽 葬 早藻灶藻则蚤糟 澡葬责贼藻灶 蚤灶 贼澡藻 责则燥凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 遭则燥葬凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 葬灶贼蚤鄄
燥则早葬灶燥责澡燥泽责澡葬贼藻 责藻泽贼蚤糟蚤凿藻 葬灶贼蚤遭燥凿赠咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻 葬灶凿
云燥燥凿 悦澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园园袁源愿渊远冤院圆圆圆愿 原 圆圆猿猿
咱 源 暂 摇 骆爱兰袁余向阳袁张存政袁祝树德袁刘贤进援 拟除虫菊酯类农药多
残留酶免疫分析方法的建立咱 允暂 援 中国农业科学袁圆园园缘袁猿愿渊圆冤院
猿园愿 原 猿员圆
咱 缘 暂摇 宰葬灶早 杂 栽袁 郧怎蚤 宰 允袁 郧怎燥 再 砸袁 在澡怎 郧 晕援 孕则藻责葬则葬贼蚤燥灶 燥枣 葬 皂怎造贼蚤鄄
澡葬责贼藻灶 葬灶贼蚤早藻灶 葬灶凿 遭则燥葬凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽 枣燥则 葬
皂怎造贼蚤责造藻 责藻泽贼蚤糟蚤凿藻 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠咱允暂 援 粤灶葬造赠贼蚤糟葬 悦澡蚤皂蚤糟葬 粤糟贼葬袁 圆园园苑袁
缘愿苑院 圆愿苑 – 圆怨圆
咱 远 暂摇 运觟澡造藻则 郧袁 酝蚤造泽贼藻蚤灶 悦援 悦燥灶贼蚤灶怎燥怎泽 糟怎造贼怎则藻泽 燥枣 枣怎泽藻凿 糟藻造造泽 泽藻糟则藻贼蚤灶早
葬灶贼蚤遭燥凿赠 燥枣 责则藻凿藻枣蚤灶藻凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠咱 允暂 援 晕葬贼怎则藻袁员怨苑缘袁圆缘远院 源怨缘 –
源怨苑
咱 苑 暂摇 酝蚤造泽贼藻蚤灶 悦袁 悦怎藻造造燥 粤 悦援 匀赠遭则蚤凿 澡赠遭则蚤凿燥皂葬泽 葬灶凿 贼澡藻蚤则 怎泽藻 蚤灶
蚤皂皂怎灶燥澡蚤泽贼燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠咱允暂 援 晕葬贼怎则藻袁员怨愿猿袁猿园缘院缘猿苑 原 缘源园
咱 愿 暂摇 杂怎则藻泽澡 酝 砸袁 悦怎藻造造燥 粤 悦袁 酝蚤造泽贼藻蚤灶 悦援 月蚤泽责藻糟蚤枣蚤糟 皂燥灶燥糟造燥灶葬造
葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽 枣则燥皂 澡赠遭则蚤凿 澡赠遭则蚤凿燥皂葬泽 咱 允暂 援 酝藻贼澡燥凿泽 耘灶扎赠皂燥造袁员怨愿远袁
员圆员院 圆员园 – 圆圆愿
咱 怨 暂摇 李 荔袁 陈伯权援 抗肾综合征出血热病毒和抗辣根过氧化物酶的
双特异性单克隆抗体的建立咱 允暂 援 病毒学报袁员怨愿怨袁渊源冤院猿猿源 原
猿猿怨
咱员园暂摇 全昱东袁赵 莉袁程 明袁卢锦汉援角蛋白和过氧化物酶双特异性杂
交杂交瘤的建立咱允暂 援 单克隆抗体通讯袁员怨怨园袁远渊员冤院圆园 原 圆猿
咱员员暂摇 云藻则则蚤灶蚤 杂袁 孕则蚤早蚤燥灶藻 陨袁 酝蚤燥贼贼蚤 杂袁 悦蚤糟糟燥灶藻 耘袁 悦葬灶贼燥灶蚤 悦袁 悦澡藻灶 匝袁
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允燥怎则灶葬造 燥枣 悦葬灶糟藻则袁 员怨怨员袁源愿院圆圆苑 原 圆猿缘
咱员圆暂摇 允蚤灶 砸 再袁 郧怎燥 再 砸袁 宰葬灶早 悦 酝袁 宰怎 允 载袁 在澡怎 郧 晕援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣
葬 月蚤泽责藻糟蚤枣蚤 酝燥灶燥糟造燥灶葬造 粤灶贼蚤遭燥凿赠 贼燥 孕藻泽贼蚤糟蚤凿藻 悦葬则遭燥枣怎则葬灶 葬灶凿
栽则蚤葬扎燥责澡燥泽 哉泽蚤灶早 匀赠遭则蚤凿 匀赠遭则蚤凿燥皂葬泽咱允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻袁
圆园园怨袁苑源渊员冤院员 原 远
咱员猿暂摇 朱国念袁吴银良袁程敬丽援 克百威人工抗原的合成与鉴定咱允暂 援 浙
江大学学报院农业与生命科学版袁圆园园圆袁圆愿渊员冤院源苑 原 缘猿
咱员源暂摇 郧怎蚤 宰 允袁 允蚤灶 砸 再袁 悦澡藻灶 在 蕴袁 悦澡藻灶早 允 蕴袁 在澡怎 郧 晕援 匀葬责贼藻灶
泽赠泽贼澡藻泽蚤泽 枣燥则 藻灶扎赠皂藻鄄造蚤灶噪藻凿 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 燥枣 贼澡藻 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻 贼则蚤葬扎燥责澡燥泽
咱允暂 援 粤灶葬造赠贼蚤糟葬造 月蚤燥糟澡藻皂蚤泽贼则赠袁 圆园园远袁 猿缘苑院怨 原 员源
咱员缘暂摇 陈伯权袁吴美英袁叶群瑞援 几种部分纯化单克隆抗体方法的比较
咱允暂 援病毒学报袁员怨怨园袁 远渊圆冤院员圆圆 原 员圆远
咱员远暂摇 孕怎造造藻灶 杂袁 匀燥糟噪 月援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 藻灶扎赠皂藻 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠泽 枣燥则 贼澡藻
凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 责赠则藻贼澡则燥蚤凿 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻泽 圆 责燥造赠糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤遭燥凿蚤藻泽 枣燥则
责赠则藻贼澡则蚤燥凿 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻泽咱 允暂 援 晕葬造赠贼蚤糟葬造 蕴藻贼贼藻则泽袁员怨怨缘袁圆愿 渊缘冤院苑愿员 原
苑怨缘
咱员苑暂摇 酝葬则噪 杂 运袁 杂澡葬灶 郧 酝袁 蕴藻藻 匀 允袁 宰藻则灶藻则 陨援 阅藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 葬 糟造葬泽泽
泽藻造藻糟贼蚤增藻 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠 枣燥则 贼澡藻 贼赠责藻 陨陨 责赠则藻贼澡则燥蚤凿 蚤灶泽藻糟贼蚤糟蚤凿藻泽 咱 允暂 援
粤灶葬造赠贼蚤糟葬 悦澡蚤皂蚤糟葬 粤糟贼葬袁圆园园缘袁缘猿源院员园怨 原 员圆园
咱员愿暂摇 祝金凤援 陨陨型菊酯类农药广谱特异性抗体的制备和多残留免疫
技术的建立咱阅暂援 扬州院扬州大学袁圆园园愿院员 原 猿圆
咱员怨暂摇 杨挺袁皇甫伟国袁谢显传援 拟除虫菊酯类农药多残留的 陨悦鄄耘蕴陨杂粤
检测方法研究咱允暂 援 食品科技袁圆园园愿袁猿猿渊员圆冤院圆怨员 原 圆怨源
咱圆园暂摇 李志茹援 拟除虫菊酯类农药通用抗体制备及高效氯氟氰菊酯免
疫检测技术研究咱阅暂援 南京院南京农业大学袁圆园园源院员 原 猿园
咱圆员暂摇 悦燥造蚤灶 酝 宰袁 粤灶凿则藻憎 孕 宰袁 匀藻葬贼澡藻则 粤 蕴援 酝燥灶燥糟造燥灶葬造 葬灶贼蚤 蚤凿蚤燥 贼赠责藻
葬灶贼蚤遭燥凿赠 皂蚤皂蚤糟噪蚤灶早 贼澡藻 责藻泽贼蚤糟蚤凿藻 遭蚤灶凿蚤灶早 泽蚤贼藻 燥枣 糟怎贼蚤灶葬泽藻院责燥贼藻灶贼蚤葬造
枣燥则 遭则燥葬凿 泽责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 燥则早葬灶燥责澡燥泽责澡葬贼藻 则藻糟燥早灶蚤造蚤燥灶 咱 允暂 援 允燥怎则灶葬造 燥枣
陨皂皂怎灶燥造燥早蚤糟葬造 酝藻贼澡燥凿泽袁员怨怨怨袁圆圆源院员怨苑 原 圆园圆
咱圆圆暂摇 杂怎凿蚤 允袁 匀藻藻泽糟澡藻灶 宰援 杂贼怎凿蚤藻泽 燥灶 贼澡藻 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣 葬灶 蚤皂皂怎灶燥葬泽泽葬赠
枣燥则 贼澡藻 早则燥怎责 泽责藻糟蚤枣蚤糟 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 凿蚤藻贼澡赠造 藻泽贼藻则 燥枣 责澡燥泽责澡葬贼藻泽袁
贼澡蚤燥责澡燥泽责澡葬贼藻泽袁 凿蚤贼澡蚤燥责澡燥泽责澡葬贼藻泽 葬灶凿 责澡燥泽责澡燥灶葬贼藻泽 咱 允 暂 援 运蚤藻造
酝蚤造糟澡憎蚤则贼泽糟澡 云燥则泽糟澡怎灶早泽遭藻则袁员怨愿愿袁源园院员苑怨 原 圆园猿
渊下转第 缘猿员 页冤
圆圆缘
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
圆园员猿袁圆苑渊源冤院园缘圆猿 耀园缘猿员
皂砸晕粤 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 造藻增藻造泽 燥枣 责蚤贼怎蚤贼葬则赠 蚤灶 允葬责葬灶藻泽藻 憎澡蚤贼藻 则葬遭遭蚤贼泽
渊韵则赠糟贼燥造葬早怎泽 糟怎灶蚤糟怎造怎泽冤 咱允暂援 蕴蚤增藻泽贼燥糟噪 杂糟蚤藻灶糟藻袁 圆园员员袁 员猿怨渊猿冤院圆圆圆
原圆圆怨
咱圆猿暂摇 杂葬噪怎则葬蚤 匀袁 粤凿葬皂泽 月 酝袁 粤凿葬皂泽 栽 耘援 悦燥灶糟藻灶贼则葬贼蚤燥灶 燥枣 早燥灶葬凿燥贼则燥责蚤灶鄄
则藻造藻葬泽蚤灶早 澡燥则皂燥灶藻 则藻糟藻责贼燥则 皂藻泽泽藻灶早藻则 则蚤遭燥灶怎糟造藻蚤糟 葬糟蚤凿 蚤灶 责蚤贼怎蚤贼葬则赠
贼蚤泽泽怎藻 燥枣 燥则糟澡蚤凿藻糟贼燥皂蚤扎藻凿 泽澡藻藻责院 藻枣枣藻糟贼 燥枣 责葬泽泽蚤增藻 蚤皂皂怎灶蚤扎葬贼蚤燥灶 葬早葬蚤灶泽贼
早燥灶葬凿燥贼则燥责蚤灶鄄则藻造藻葬泽蚤灶早 澡燥则皂燥灶藻 咱 允 暂援 允燥怎则灶葬造 燥枣 粤灶蚤皂葬造 杂糟蚤藻灶糟藻袁
员怨怨苑袁 苑缘渊员冤院员愿怨 原员怨源
咱圆源暂摇 郧则藻早早 阅 宰袁 晕藻贼贼 栽 酝援 阅蚤则藻糟贼 藻枣枣藻糟贼泽 燥枣 藻泽贼则葬凿蚤燥造 原 员苑 遭藻贼葬 燥灶 贼澡藻
灶怎皂遭藻则 燥枣 早燥灶葬凿燥贼则燥责蚤灶鄄则藻造藻葬泽蚤灶早 澡燥则皂燥灶藻 则藻糟藻责贼燥则泽 蚤灶 贼澡藻 燥增蚤灶藻
责蚤贼怎蚤贼葬则赠 咱允暂援 月蚤燥造燥早赠 燥枣 砸藻责则燥凿怎糟贼蚤燥灶袁 员怨愿怨袁 源园渊圆冤院圆愿愿 原圆怨猿
咱圆缘暂摇 酝怎则葬泽藻 酝袁 哉藻皂怎则葬 栽袁 郧葬燥 酝袁 陨灶葬凿葬 酝袁 云怎灶葬遭葬泽澡蚤 栽袁 匀蚤则葬澡葬则葬 云援
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