全 文 ：文章编号 :100028551 (2004) 062485204
利用放射免疫法测定水中克百威的研究
朱国念1 　吴慧明1 　杨　挺1 　吴　刚2 　胡秀卿3
(1. 浙江大学农药与环境毒理研究所 ,浙江 杭州　310029 ;2. 浙江出入境检验检疫局 ,浙江 杭州　310012 ;
3. 浙江省农业科学院植物保护所 ,浙江 杭州　310023)
摘 　要 :本研究建立了水样中克百威残留的放射免疫分析方法 (RIA) ,与传统的分析方法相比 ,
前处理简单 ,灵敏度更高。研究结果表明 ,该方法的检出限为 01175ngΠml ,用放射免疫测定法
与高效液相色谱法检测相同水样中克百威的残留 ,两者的线性相关系数为 019985。
关键词 :克百威 ;放射免疫测定 ;水
DETERMINATION OF CARBOFURAN IN WATER BY RADIOIMMUNOASSAY
ZHU Guo2nian1 　WU Hui2ming1 　YANG Ting1 　WU Gang2 　HU Xiu2qing3
(1. Institute of Pesticide and Environment Toxicology , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang , 　310029 ;
2. Zhejiang Entry2Exit Inspection and Quarantine Bureau , Hangzhou , Zhejiang , 　310012 ;
3. Institute of Plant Protection , Zhejiang Academy of Agricultural Science , Hangzhou , Zhejiang , 　310021)
Abstract :A competitive radioimmunoassay ( RIA) method was established to detect carbofuran in water samples.
Compared with traditional analytical methods RIA provided a easy procedure with higher sensitivity. The detective
limitation of RIA for carbofuran was proved to be 0. 175ngΠml. A study was performed to test validation of the RIA.
In this study carbofuran residues in water samples were detected simultaneously by RIA and by high performance
liquid chromatograph (HPLC) . The linear correlation coefficient of the test results was measure to be 0. 9985.
Key words :carbofuran ;radioimmunoassay ;water
收稿日期 :2003206212
基金项目 :浙江省自然科学基金资助 (301283)
作者简介 :朱国念 ,男 (1957～) ,浙江诸暨人 ,博士 ,教授 ,主要从事农药环境毒理学与免疫化学分析研究。E2mail : zhugn @zju. edu. cn克百威 (carbofuran ,2 ,32二氢22 ,22二甲基272苯并呋喃基2N2甲基氨基甲酸酯 ,商品名呋喃丹) ,能有效防治农作物和观赏植物上的多种害虫、螨类和线 ,但对人畜高毒 ,在酸性土壤中不易降解 ,还可以通过径流或渗滤污染地面和地下水源[1 ] ,美国已将其作为饮用水中的检测物之一 ,规定其最大残留量为0104mgΠL [2 ] 。常规克百威残留的检测方法 ,包括气相色谱法 ( GC) [3 ] 和高效液相色谱法 ( HPLC) [4 ] 等。但这些方法 ,样品处理需净化 ,浓缩 ,衍生化等繁琐步骤。近年发展起来的免疫测定法具有很高的特异性和灵敏度 ,并能简化前处理 ,目前已有用酶免疫方法检测克百威的报道[5 ,6 ] ,但国内外尚未见克百威放射免疫测定方法的报道。本文在克百威人工抗原[7 ] 及多克隆抗体研究的基础上[8 ] ,研究并建立了径流水(河水) 、地下水 (井水) 、农田水 (池水) ,饮用水 (自来水) 4 种水样中克百威残留量的放射免疫测定法。1 　材料与方法111 　材料和仪器9918 %克百威标准品 ,14 C2克百威 (由匈牙利国家科学院同位素所提供 ,苯并呋喃环第 3 碳位标记 ,
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放射性比活度为 72617MBqΠmmol) 。抗克百威抗体 (与葡聚糖活性炭交联)由本研究所研制。
所用的二氯甲烷、邻苯二甲醛 (OPA) 、氢氧化钠、巯基乙醇均为分析纯 ,甲醇、乙腈为色谱纯 ,超纯水
由 0145μm 滤膜过滤。
所用仪器有 : Waters Carbamate Analysis System ,配有 474 荧光检测器 , 515 泵 , Reagent Manager 泵、
Millennium 32 数据处理系统、Waters 柱后反应装置、Waters 温控仪 ;液体闪烁计数仪 (Wallac 1400 DSA) ;
KJ - Ⅱ型离心沉淀机。
112 　方法
11211 　样品前处理 　分别取当地的自来水、河水、井水和池水各 200ml ,添加克百威配备不同浓度的溶
液 ,过滤后直接取样进行 RIA 分析。HPLC的前处理方法 :水样经过滤后用 50ml 二氯甲烷提取 3 次 ,合
并提取液 ,浓缩近干 ,甲醇定容 2ml ,进样。
11212 　克百威的放射免疫测定程序 　采用均相法测定 ,将14 C2克百威、标样 (或样品) 与克百威抗体在
4 ℃下反应平衡 12h 后 ,在各管中加入经葡聚糖包被的活性炭颗粒溶液 (DCC) ,混匀后静置 10min ,利用
DCC具有吸附游离的小分子标记抗原的能力 ,达到分离游离抗原和标记抗原与抗体复合物的目的 ,
3000rpm 离心 10min 后 ,取上清液测定结合的14 C2克百威的放射性活度 (B) 。每个反应各进行 6 个重复。
以标准克百威浓度的对数值为横坐标 ,抗原抗体结合率的对数Logit (BΠB0 )为纵坐标 ,绘制标准曲线。
11213 　高效液相色谱法 　液相色谱条件为色谱柱 :Waters Carbamate Column (319mm ×150mm) ;色谱柱温
25 ℃,反应管温度 90 ℃;流动相 :水∶乙腈 (500ml 乙腈 + 25μl 巯基乙醇) = 3∶1 ;流速 :112mlΠmin ,氢氧化钠
溶液流速 014 mlΠmin ,OPA 衍生剂流速 014 mlΠmin ;荧光检测器的激发波长和发射波长分别为 339nm 和
445nm ,进样量 10μl。
11214 　RIA 方法特异性测定 　选择克百威的代谢物 (呋喃酚) 、4 种氨基甲酸酯类农药 (丁硫克百威、异
丙威、速灭威、灭多威)与 4 种有机磷农药 (甲胺磷、毒死蜱、久效磷、敌敌畏)进行方法特异性试验。用放
射免疫法测定各种结构类似物抑制抗原抗体结合率为 50 %所需的浓度 I50 (μgΠml) ,比较它们对抗体的亲
合性。交叉反应率愈小 ,反应的特异性愈强。计算类似物对克百威的交叉反应性。计算公式为 :交叉反
应率 ( %) = (抑制率为 50 %克百威的浓度)Π(抑制率为 50 %其他结构类似物的浓度) ×100 %。
2 　结果与讨论
211 　标准曲线
将克百威标准品稀释成系列浓度 ,用 RIA 分析得到一条曲线 (见图 1) , y = - 112348 x + 212393 ,
在 01256ngΠml～400010ngΠml 浓度范围内 ,Logit (BΠB0 ) 与克百威浓度的对数值呈显著的线性关系 ,相关系
数为 r2 = 019908。根据样品管的Logit (BΠB0 )值 ,可从标准曲线上读出克百威的含量。用 B0 - 2SD 外推
法 ,可知该法的检测灵敏度为 01175ngΠml。
图 1 　RIA 方法的克百威标准曲线
Fig. 1 　Standard curve of carbofuran by RIA method
212 　RIA方法的特异性测定
本试验用放射免疫测定法对与克百威结构相
似的化合物及数种有机磷农药进行测定 ,测定结
果见表 1。由表可知 ,抗体与丁硫克百威、呋喃酚
的交叉反应略高 ,分别为 5129 %、9115 % ,而与其
它 3 种氨基甲酸酯类农药与 4 种有机磷农药几乎
无交叉反应 (小于 015 %) 。说明该种方法的特异
性较好 ,可保证对样品中克百威残留测定结果的
可靠性。
精密度是指同一样品多次测定结果的变化程
度 ,即反映测定的可重复性。通常以批内误差和
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表 1 　RIA 方法特异性试验
Table 1 　Recognition of several pesticides by RIA method
化合物名称
name of pesticides
抑制浓度
I50 (μgΠml) 交叉反应百分率cross2reactivity( %)
克百威 carbofuran 0165 Π
呋喃酚 benzofuranol 12125 5129
丁硫克百威 carbosulfan 7110 9115
异丙威 isoprocarb 182122 0136
速灭威 metolcarb 14812 0143
灭多威 methomyl 142123 0146
甲胺磷 methamidophos > 250 < 0126
毒死蜱 chlorpyrifos > 250 < 0126
久效磷 menocrotophos > 250 < 0126
敌敌畏 dichlorvos > 250 < 0126批间误差来表示精密度。测定结果如表 2 所示。由表可知 ,该方法的批内、批间及整体变异系数均小于 10 %。准确度是指测定值与真值的符合程度 ,通常以回收率试验来表示 ,对于 4 种水样的回收率的结果见表 3 ,回收率在 96180 %～103120 %之间。213 　RIA与 HPLC方法比较在 RIA 方法的线性范围内 ,设置 8 个浓度 ,添加到水样中 ,然后分别用 HPLC 与 RIA进行分析 ,然后以 RIA 分析得到的数据为 Y ,
以 HPLC分析得到的数据为 X ,得出 ,方程式
为 y = 019579 x - 010035 ,相关系数为 01998 ,如图 2。用 RIA 分析所得到的数据比 HPLC 所得的数据
高 ,这可能与在 HPLC方法分析前处理复杂 ,致使克百威的量有所损失有关。
表 2 　RIA 方法检测百克威的精密度测试结果
Table 2 　Precision of RIA method for measurement of carbofuran
样品
sample
添加浓度
added concentration
(μgΠml) 平均值average(μgΠml) 批内变异系数CV within2assay( %) 批间变异系数CV between2assay( %) 整体变异系数CV total2assay( %)
河水 0101 010099 4174 2139 5155
river water 011 010973 3171 1141 4106
1 01962 1182 0184 2102
井水 0101 010103 4128 1157 4163
well water 011 010996 3106 1124 3130
1 019710 1142 0195 1176
池水 0101 010101 5150 1171 2187
pool water 011 010975 2172 0181 2199
1 019569 2175 0189 2191
自来水 0101 010104 4182 1163 5118
tape water 011 010987 2134 0193 2161
1 019729 1182 0157 2106
表 3 　RIA 方法测定水样中克百威添加回收率试验结果
Table 3 　Recovery rate of carbofuran added to water samples by RIA method
样品
sample
添加浓度
added concentration (μgΠml) 测定值value of measurement (μgΠml) 回收率recovery rate ( %) 变异系数CV( %)
河水 0105 010494 98180 5145
river water 015 014840 96180 2171
4 318868 97115 2156
井水 0105 010501 100120 3123
well water 015 014891 97182 1149
4 318920 97130 2157
池水 0105 010507 101140 4192
pool water 015 014936 98172 1109
4 319192 97198 2120
自来水 0105 010516 103120 5100
tape water 015 015007 100114 1186
4 318968 97142 1149
784　6 期 利用放射免疫法测定水中克百威的研究
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图 2 　RIA 与 HPLC方法分析水样中克百威含量的比较
Fig. 2 　Comparison of carbofuran content in
water samples measured by RIA and HPLC
3 　结论
用 RIA 方法分析水样中克百威 ,水样不需要
繁琐的前处理 ,经过滤后即可进行分析 ,未产生基
质影响。灵敏度比传统的色谱分析方法更高 ,达
到 01175ngΠml , 4 种水样的回收率在 96180 %～
103120 %之间 ,其准确度 ,精确度都符合残留分析
的要求。这种方法可以同时测量大量的样品 ,这
是传统的色谱方法所不能比拟的。本研究的结果
表明用 RIA 方法进行各种环境水样中克百威残留
量的监测是可行的。
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