全 文 ：文章编号 :100028551 (2002) 0520320205
克百威残留放射免疫分析方法研究
胡秀卿1 　朱国念2 　徐步进2
(11 浙江省农业科学院植物保护研究所 ,浙江杭州　310021 ;21 浙江大学农业与生物技术学院 ,浙江杭州　310009)
摘 　要 :通过活化酯法与牛血清蛋白联接 ,制备出较高活性的人工抗原 ,以此来免疫兔
子制备抗克百威的多克隆抗体。选择适宜的反应条件 ,以14 C2克百威建立了克百威
放射免疫测定法。该方法对克百威标准品的最低检测量为 01175ngΠml ,线性检测范
围为 01256～400010ngΠml ,I50值为 65010ngΠml。在线性检测范围内 ,添加不同浓度克
百威的蔬菜样品检测的批内、批间变异系数均小于 10 %。在甘蓝菜样品中的添加回
收率试验回收率为 9310 %～10410 % ,变异系数为 413 %～1115 %。所得克百威抗体
特异性强 ,与丁硫克百威的交叉反应率为 9115 % ,与呋喃酚的交叉反应率为 5129 % ,
与供试的其它 3 种氨基甲酸酯类的交叉反应率均小于 015 %。
关键词 :克百威 ;RIA ;残留
收稿日期 :2001208210
作者简介 :胡秀卿 (1976～) ,女 ,浙江兰溪人 ,浙江省农业科学院植物保护研究所研究实习员 ,硕士 ,从事农药残留研究
与农产品质量检测方面的工作
克百威 (呋喃丹)是一种内吸性的 N2甲基氨基甲酸酯类高毒杀虫剂 ,主要用于防治各类农
作物的土壤害虫、叶食类昆虫及线虫。本研究试图建立蔬菜中克百威残留的放射免疫分析方
法 ,以便对蔬菜中克百威残留进行批量快速监测 ,并进一步应用于环境样品监测。
1 　材料与方法
111 　试验材料
11111 　仪器设备 　液体闪烁计数仪 (Wallac 1400 DSA) , KJ2Ⅱ型离心机 ,高分辨核磁共振仪
(AM500 ,Bruker) ,红外测定仪 ( IR435 ,Shimadzu) ,紫外分光光度计 (Beckman Du27) ,质谱仪 ( Es2
quire ALC MSn , Bruker) ,酶联免疫测定仪 (5 Ⅱ型 ,上海)
11112 　化学试剂与药品 　72羟基呋喃酚 (2 ,22二甲基22 ,32二氢272羟基苯并呋喃酚) 由江苏省
铜山农药厂提供 ;氨基己酸、N2羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 、二环己基碳二亚胺 (DCC) 、N ,N2二甲基
甲酰胺 (DMF) 、牛血清白蛋白 (BSA) 、卵清蛋白 (OVA) 、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自
Sigma 公司 ;闪烁液 (2 ,52二苯基　唑 (PPO) 7g + 1 ,42双2[22(52苯基　唑) ]2苯 ( POPOP) 0105g + 二
甲苯 1000ml) ;PBS 缓冲液 (pH为 710 的 PBS 片剂溶于 1000mL 重蒸水) ;葡聚糖活性炭分离剂 :
取活性炭 (Norit A) 012g ,葡聚糖 (Dextran T70) 0102g ,加入 40ml PBS 中。用前先搅拌 2h ,使用时
边搅拌边使用。
023　 核 农 学 报　2002 ,16 (5) :320～324Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
9918 %克百威标准品、9919 %速灭威标准品、9810 %异丙威标准品、9812 %灭多威标准品由
浙江省农业厅药检所提供 ;9910 %丁硫克百威标样由浙江省化工院提供 ;14 C2克百威由匈牙利
国家科学院同位素所提供 ,苯并呋喃环第 3 碳位标记 ,放射性比活度为 72617MBqΠmmol。
11113 　试验动物 　雄性成年新西兰白免由浙江中医学院提供并负责饲养。
112 　试验方法
11211 　克百威半抗原的合成 　以 72羟基呋喃酚为基础原料 ,通过一系列反应合成 62[ [ (2 ,32
二氢22 ,22二甲基272苯并呋喃基氧) 羰基 ]氨基 ]已酸 (简称 BFNH) ,合成物通过1 HNMR、MS、IR
鉴定并以该合成产物为半抗原。
11212 　克百威人工抗原的制备 　用 BFNH 和牛血清白蛋白 (BSA) 通过活化酯法合成克百威2
BSA 复合物 ,以此为抗原免疫动物制备抗克百威抗血清。
11213 　特异性抗体的制备 　克百威人工抗原与佐剂乳化后 ,分别对 3 只新西兰雄性白兔进行
背部皮下多点注射及腿部肌肉注射 ,首次免疫使用福氏完全佐剂 ,而后的加强免疫用福氏不完
全佐剂 ,每次加强免疫后 7～10d 耳缘静脉采血测定抗血清效价 ,待效价大于 16000 以上 ,心脏
采血 ,制备抗血清。
11214 　克百威的放射免疫测定程序 　放射性活度采用均相法测量。用磷酸缓冲液 (pH712) 配
制一系列反应液 ,在 4 ℃下平衡 12h ,用葡聚糖活性炭吸附游离的14 C2克百威 ,经离心沉淀 ,用均
相法测定上清液中的放射性活度 ,结果为结合的14 C2克百威的放射性活度 (B) 。每反应各设置
3 重复。以标准克百威浓度的对数值为横坐标 ,以Logit (BΠB0 )为纵坐标 ,绘制标准曲线。
11215 　特异性试验 　选择 4 种氨基甲酸酯类农药 (丁硫克百威、异丙威、速灭威、灭多威) 和 1
种克百威的降解产物 (呋喃酚)进行特异性测定。RIA 法测定上述 5 种结构类似物抑制 50 %所
需的浓度 I50 (μgΠml) ,比较它们对抗体的亲合性。用下式计算类似物对克百威的交叉反应性。
交叉反应率 ( %) = I50 (克百威)I50 (结构类似物) ×100。
11216 　蔬菜样品的制备和添加回收率的测定 　将甘蓝样品剪碎后 ,称取多份样品 ,每份 10g。
每份样品中分别准确添加一系列浓度的克百威标样 ,设置空白对照。静置 12h 后分别用 50ml
的丙酮振荡提取 15min。提取液抽滤后减压浓缩至 2ml 左右 ,用 PBS 溶液定容至 10ml。该溶液
经 3000rpm 离心 10min 后 ,取上清液稀释适当倍数后用于 RIA 分析。
分别添加 6 个梯度浓度的克百威 ,各设 3 个重复。所测得的浓度与已知的添加浓度比较 ,
得到添加回收率。
2 　结果与分析
211 　兔抗克百威抗血清最佳工作浓度的确定
以合成的克百威2BSA 复合物对 3 只新西兰雄性白兔免疫 3 个月后 ,接受免疫的白兔血清
中都有抗体产生 ,其中第 1 只兔子所产生的抗体与克百威的结合力最强 (见图 1) 。抗血清的
滴度一般选择在与标记抗原的结合率为 33 %～50 %时的稀释浓度。由图 1 中得出抗血清的最
适工作浓度为 1∶8000。
212 　反应温度的选择
为了选择适宜的反应温度 ,对 3 种不同的温育条件 (4、25、37 ℃) 作了比较试验 (图 2) 。结
123　5 期 克百威残留放射免疫分析方法研究
果表明 ,在 4 ℃反应时结合率最高 ,但反应时间较长。当温度较高时 ,反应速度加快 ,但解离率
也增加 ,从而降低了结合率。在实际应用时宜采用 4 ℃反应 12h 以上为好。
图 1 　呋喃丹抗血清稀释曲线
Fig. 1 　Dilution curve of carbofuran antiserum
图 2 　反应温度对结合率与平衡时间的影响
Fig. 2 　Influence of reaction temperature on
bound rate and balance time
213 　标准曲线和检测灵敏度
将克百威纯品用 PBS 稀释成系列浓度 ,并在上述最佳抗体工作浓度及最佳反应条件下制
定标准曲线 (图 3) 。从标准曲线可知 ,克百威在 01256～400010ngΠml 范围内 ,Logit (BΠB0 ) 与克
百威浓度的对数值呈显著的线性关系 ,相关系数为 r2 = 019818。根据样品管的 Logit (BΠB0 ) 值 ,
可从标准曲线上查出克百威的含量。用 B022SD 外推法 ,从标准曲线上查得检测的灵敏度为
01175ngΠml。
图 3 　克百威 RIA 的标准曲线和样品稀释曲线
Fig. 3 　Standard and sample curves of carbofuran by RIA
　
214 　抗体的特异性测定
由表 1 可知 ,当抑制抗体与包被抗原结合率达 50 %时 ,克百威所需浓度为 0165μgΠml ,结构
类似物丁硫克百威所需浓度为 7110μgΠml ,降解产物呋喃酚所需浓度为 12129μgΠml ,而其它 3 种
氨基甲酯酯类农药所需浓度为 142123～182122μgΠml。几种供试克百威结构类似物中 ,抗体与
丁硫克百威、呋喃酚的交叉反应略高 ,分别为 9115 %和 5129 % ,而与其它 3 种氨基甲酸酯类似
物几乎无交叉反应 (小于 015 %) 。说明该抗体的特异性较好 ,可保证对样品中克百威残留测
定结果的可靠性。
223 核　农　学　报 16 卷
表 1 　克百威抗血清特异性试验
Table 1 　Recognition of several compounds
by carbofuran antibody
化合物名称 compound I50 (μgΠml) 交叉反应百分率polyclonal antibody
cross2reactivity( %)
克百威 carbofuran 0165 Π
呋喃酚 carbofuran2phenol 12129 5129
丁硫克百威 carbosulfan 7110 9115
异丙威 isoprocarb 182122 0136
速灭威 MTMC 148120 0143
灭多威 methomyl 142123 0146215 　方法的精密度精密度通常以批内误差和批间误差来表示。取 3 个添加不同浓度克百威的样品 ,各设置 4 个重复 ,每 5 天测定 1 次 ,连续测定 3次。由表 2 可知 ,该方法的批内、批间变异均小于 10 %。216 　方法的准确度21611 　回收率 　试验结果见表 3 ,克百威的平均回收率达 9616 % ,平均变异系数小于
10 %。
21612 　健全性试验 　将添加克百威的菜叶样品的提取液作系列稀释 ,进行重叠性试验 ,结果
表明 ,样品提取样的稀释曲线与克百威标准曲线基本平行 (见图 3) 。
表 2 　精密度测试结果
Table 2 　Results of precision research
添加浓度
concentration of
carbofuran (μg·ml - 1)
批内平均结合率±标准差
mean within2assay
binding(BΠB0) ±SD 批内平均变异CV % 批间平均结合率±标准差 (变异系数)mean between2assaybinding (BΠB0) ±SD(CV %)
01098 ±01008
011 01095 ±01006 719 01093 ±01007 (712)
01085 ±01008
01927 ±01030
1 01985 ±01097 611 01937 ±01044 (417)
01899 ±01040
91655 ±01468
10 91779 ±01549 517 91481 ±01414 (414)
91008 ±0159
表 3 　菜叶中克百威添加回收率试验结果
Table 3 　Recoveries of carbofuran add to Chinese cabbage by RIA
添加浓度
concentration of carbofuran (μg·ml - 1)
测定的克百威量
detected volume of carbofuran (μgΠmL) 回收率recovery ( %) 变异系数CV %
0105 01052 ±01006 10410 ±1210 1115
011 01093 ±01007 9310 ±710 715
015 01502 ±01045 10014 ±910 910
1 01937 ±01044 9317 ±414 417
5 41678 ±01430 9316 ±413 416
10 91481 ±01414 9418 ±411 413
3 　讨 　论
选择适宜的反应条件是建立克百威 RIA 方法的前提。对 3 种不同反应温度下的克百威抗
原抗体结合反应进行了比较试验。表明采用 37 ℃温育 2h ,25 ℃温育 4h ,4 ℃温育 12h 以上均能
获得较为满意的结果。在高温 (37 ℃)情况下 ,虽然平衡时间短 ,但降低了抗原抗体的结合率。
本实验提倡使用 25 ℃温育 4h 或 4 ℃温育 12h 以上 ,可获得较高的灵敏度。根据上述实验结果
建立了克百威的 RIA 检测方法 ,该方法在 0101～400010ngΠml 范围内 ,Logit (BΠB0 )与克百威浓度的
323　5 期 克百威残留放射免疫分析方法研究
对数值呈显著的线性关系 ,方法灵敏度为 01175ngΠml ,符合农药残留分析检测灵敏度的要求。
用具有多种抗原决定簇的免疫原 (蛋白质或多肽) 制备的免疫血清 ,其中所含抗体分子往
往是混合体 ,其亲合常数也是平均数。高度特异性是一种抗血清必备的先决条件。本实验对
克百威与 4 种氨基甲酸酯类农药 (丁硫克百威、异丙威、速灭威、灭多威) 以及 1 种克百威的降
解产物 (呋喃酚)进行了特异性试验。其中抗体与丁硫克百威、呋喃酚的交叉反应略高 ,分别为
9115 %和 5129 % ,而对其它 3 种氨基甲酸酯类农药几乎无交叉反应 ,表明本试验得到克百威抗
体对克百威有较高的亲合性和选择性 ,这一结果对实际样品 (含未知农药残留) 中克百威残留
的定性与定量检测均有较高的价值。本实验交叉反应测定值与 Abad 等的研究结果相比略偏
高[4 ] 。探究其原因 ,我们认为造成这种差别的主要因素在于二者免疫测定中所用的抗体不同 ,
我们所制备抗体是多克隆抗体 ,特异性相对较小 ,而 Abad 等的免疫测定中 ,所制备的抗体为单
克隆抗体 ,其特异性更强。
根据 Cerceo 提出的效点系统打分法[5 ]以零标准管结合率、取代比率、百分精密度、百分准
确度、灵敏度 5 项指标对克百威的放射免疫分析法进行了质量评价。Cerceo 认为 5 项指标打
分结果在 28 分以上属于较优的方法。本方法的得分达 28 分 ,说明用 RIA 测定蔬菜中克百威
残留的方法的可行且可靠的。
参考文献 :
[1 ] 　F¾rber H ,SchÊler HF. Gas chromatographic determination of carbamate pesticides after flash2heater methylation with trimethylsulfonium
hydroxide. J Agric Food Chem. 1993. 41 :217～220.
[2 ] 　Garvey B D. High2performance liquid chromatographic methods for the determination of N2methylcarbamate pesticides in water , soil ,
plants and air. J Chromatogr. 1993. 642 :89～105.
[3 ] 　Yang S S , Goldsmith A I ,Smetena I. Recent advances in the residue analysis of N2methylcarbamate pesticides. J Chromatogr. 1996.
754 :3～16.
[4 ] 　Abad A , Moreno MJ , Montoya A. Development of monoclonal antibody2based immunoassays to the N2methylcarbamate pesiticide car2
bofuran. J Agric Food Chem. 1999. 47 :2475～2485.
[5 ] 　李振申 ,等. 实用放射免疫学. 北京 :科学技术文献出版社 ,1989.
IMMUNOASSAY FOR THE DETERMINATION OF CARBOFURAN RESIDUE
HU Xiu2qing1 　ZHU Guo2nian2 　XU Bu2jin2
(11 Institute of Plant Protection , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310021 ;
21 College of Agriculture and Biotechnology , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310029)
ABSTRACT :The determination of carbofuran residue by radioimmunoassay was studied. Carbo2
furan hapten BFNH was synthesized , conjugated to BSA , and used as immunizing antigen in rab2
bits. The detection limit of the RIA was 01175 ngΠml and a linear detection range was from 01256
ngΠml to 400010 ngΠml , with an I50 value around 65010 ngΠml. The carbofuran recoveries in cab2
bage samples were ranging from 9310 % to 10410 %, with coeff icients of variation of 413 %～
1115 %. The results demonstrated that the accuracy , presision and sensitivity of the operation
procedure satif ied the critical of pesticide residue analysis. The antiserum was specif ic for carbo2
furan , and the cross2reactivity of the antiserum to carbosulfan and carbofuran2phenol was 9115 %
and 5129 %, respectively , however other three kinds of N2methylcarbamate pesticides were negli2
gible ( < 015 %) .
Key words :carbofuran ; radioimmunoassay ; residue
423 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2002 ,16 (5) :320～324