全 文 ：核 农 学 报　 ２０１３，２７（１１）：１６４４ ～ １６５１
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１２⁃１０⁃３０　 接受日期：２０１３⁃０５⁃３０
基金项目：海洋公益性行业科研专项（２０１１０５００７）
作者简介：孙静，女，主要从事食品科学与工程研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｓｊ⁃ｂｉｎｂｉｎ＠ １６３． ｃｏｍ
通讯作者：苏秀榕，女，教授，主要从事食品科学与工程、生物化学与分子生物学研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｓｕｘｉｕｒｏｎｇ＠ ｎｂｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１３）１１⁃１６４４⁃０８
地衣芽孢杆菌富集镉的特性及机理研究
孙　 静　 李　 晔　 刘联国　 詹萍萍　 张春丹　 苏秀榕
（宁波大学海洋学院，浙江 宁波　 ３１５２１１）
摘　 要：本文是为了解地衣芽孢杆菌富集镉的特性及机理，为该菌在镉污染治理中的应用提供理论基础。
通过探究镉的初始浓度、培养时间、通气量、接种量对地衣芽孢杆菌富集 Ｃｄ２ ＋特性的影响，进一步利用
红外光谱、圆二色光谱、扫描电镜 －能谱仪和原子力显微镜探讨菌体富集 Ｃｄ２ ＋的机理。 结果表明：在一
定培养条件下，接菌量为 ６％ ，培养 ２４ ｈ，菌体对 Ｃｄ２ ＋的富集趋于平衡；１００ｍＬ 的细菌培养瓶中装 ４０ ～
５０ｍＬ的液体培养基较为适宜；经驯化后的菌体对初始质量浓度为 ５０ ～ ５００ｍｇ·Ｌ － １的 Ｃｄ２ ＋都具有一定
的耐受性和富集能力；菌体富集 Ｃｄ２ ＋后细胞壁及内部有大量颗粒物并检测出有镉元素，对 Ｃｄ２ ＋的富集
主要依靠细胞壁上的羟基（ － ＯＨ）、羰基（ － ＣＯ － ）、酰胺基（ － ＣＯ⁃ＮＨ － ）、磷酸基（ － ＰＯ４ ３ － ）等基团，而
且重金属 Ｃｄ２ ＋还改变了菌体蛋白的空间构象。 因此，本研究初步表明地衣芽孢杆菌抗镉和富集镉的机
制是菌体表面的功能基团、表面分泌物聚集和富集 Ｃｄ２ ＋ ，以及将 Ｃｄ２ ＋运输到菌体内部进行富集。
关键词：地衣芽孢杆菌；镉；富集；机理
　 　 重金属污染和防治一直是环境领域研究的难点和
热点，其中镉是一种毒性很强的重金属元素［１ － ２］。 随
着冶金、采矿、电镀及化工等行业的发展，越来越多的
镉释放到环境中，引起环境和生态恶化。 同时，镉在土
壤中具有较强的代谢活性，极易被作物吸收而进入食
物链，严重威胁人类健康，因而镉污染的治理引起高度
关注［３ － ４］。 与物理修复、化学修复相比，在重金属镉污
染治理领域，微生物修复所具有的安全性、经济性和非
破坏性的优点，使其成为最具有前途的修复技术，是重
金属污染治理的重要研究方向之一［５ － ６］。
目前，国内外研究发现一些微生物如细菌、真菌和
藻类等对重金属镉离子都有很强的耐受性和富集能
力，其中研究的细菌为假单胞菌属 （ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐ． ） ［７ － ８］、芽孢杆菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ． ） ［９］和皮氏罗尔斯
通氏菌属（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｐ． ） ［３， １０］。 刘爱民［１１］从安徽冶炼
厂的污染土壤中获得一株高效耐镉假单胞菌，该菌可
在液体培养基中耐受 ４０ｍｍｏｌ·Ｌ － １ＣｄＳＯ４，在固体培养
基上耐受 ７５ｍｍｏｌ·Ｌ － １ＣｄＳＯ４。 刘红娟等［１２］研究了一
株分离自镉污染土壤对镉具有高抗性的蜡状芽孢杆菌
的抗镉机理，结果发现不同处理方式的菌体吸附的镉
在细胞不同部位的分布不同。 由于细胞本身结构组成
及重金属和微生物之间的相互作用复杂性，对于细菌
的重金属抗性及机理国内外没有统一的理论。 因此，
对重金属和微生物之间的相互作用及机理需作更为深
入的研究。
地衣芽孢杆菌（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）属革兰氏染色阳
性产芽孢菌，在重金属污染防治方面，周鸣等［１３］采用
地衣芽孢杆菌死菌体吸附水中的 Ｃｒ６ ＋ ，最大吸附量为
６０􀆰 ５ｍｇ·ｇ － １。 然而，地衣芽孢杆菌活菌体作为微生物
吸附剂在土壤重金属污染治理方面的研究较少。
本文以地衣芽孢杆菌 Ａ 为研究对象，通过逐步驯
化培养，获得具有一定耐镉性能的菌株；研究了该菌株
在液体培养基中对 Ｃｄ２ ＋的富集特性。 利用扫描电镜、
透射电镜、原子力显微镜观察镉的沉积作用及分布情
况，通过红外光谱探讨了积累镉前后细胞壁表面化学
基团的变化，圆二色光谱研究积累镉前后蛋白质二级
结构，研究了抗镉和富集镉的机制，为此菌结合有机液
肥在促进农作物生长、保护人类健康中的应用奠定基
础。
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　 １１ 期 地衣芽孢杆菌富集镉的特性及机理研究
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
地衣芽孢杆菌 Ａ （Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ Ａ）由宁波大学
海洋学院实验室筛选鉴定。 目的菌种保存于甘油冻存
管中，实验用时从甘油管中取出活化即可。
氯化镉（ＣｄＣｌ２·２Ｈ２Ｏ），分析纯，配成 １ｇ·Ｌ － １的
Ｃｄ２ ＋贮备液，１２１℃ 下高压灭菌 ２０ｍｉｎ，备用。 含有
Ｃｄ２ ＋的培养液及菌体灭菌后，收集于废液桶中，标明
重金属字样，由相关人员统一处理。
牛肉膏蛋白胨液体培养基，经 １２１℃灭菌 ２０ｍｉｎ，
加入单独灭菌后的 ＣｄＣｌ２·２Ｈ２Ｏ 溶液，使 Ｃｄ２ ＋的最终
浓度达到所需的浓度，３７℃，１２０ｒ·ｍｉｎ － １摇床培养。 固
体培养时将上述液体培养基中加入琼脂，置于 ３７℃恒
温培养箱中培养。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 菌种驯化　 从甘油管中取出一定量的菌种，放
入到装有 ５０ｍＬ 液体培养基的 ２５０ｍＬ 锥形瓶中，在
３７℃、１２０ｒ·ｍｉｎ － １的恒温摇床中培养 １６ ｈ（处于对数
期），８０００ｒ·ｍｉｎ － １、１０ｍｉｎ 离心后，用生理盐水制成
１０ｍＬ菌悬液。 采用 Ｃｄ２ ＋浓度逐步升高的方法进行驯
化，经过长期的驯化，获得能够耐受高浓度 Ｃｄ２ ＋的菌。
１􀆰 ２􀆰 ２　 富集特性 　 菌种储备液制备：将耐受高浓度
Ｃｄ２ ＋的地衣芽孢杆菌接种到一定浓度的 Ｃｄ２ ＋培养基
中培养 １６ ｈ，取培养液在 ８０００ｒ·ｍｉｎ － １离心 ５ｍｉｎ，收集
菌体，用无菌生理盐水洗涤菌体制成菌悬液（ＯＤ５６０ｎｍ
≈１􀆰 ０）。
将培养液置于 １００ｍＬ的细菌培养瓶中，添加一定
量的 Ｃｄ２ ＋ ，定量接入耐受高浓度 Ｃｄ２ ＋的地衣芽孢杆
菌，在 ３７℃、１２０ｒ·ｍｉｎ － １的恒温摇床中培养，以不添加
Ｃｄ２ ＋的培养液作为对照。 测定溶液中 Ｃｄ２ ＋浓度的变
化情况。
富集试验完成后，将液体培养基在型号为 ＴＧＬ －
１６Ｂ台式高速离心机上，以 ８０００ｒ·ｍｉｎ － １离心 １０ｍｉｎ 使
菌体分离开来，离心后培养液中残留 Ｃｄ２ ＋的浓度采用
ＴＡＳ － ９９０ＡＦＧ原子吸收分光光度计（北京普析通用仪
器有限责任公司）进行测定。 使用公式 Ｑ ＝ （Ｃ０ － Ｃ） ／
Ｃ０ × １００％计算 Ｃｄ２ ＋的吸附率 Ｑ，其中 Ｃ０和 Ｃ 分别为
富集前后溶液中的 Ｃｄ２ ＋浓度（ｍｇ·Ｌ － １）。
１􀆰 ２􀆰 ３　 菌体富集 Ｃｄ２ ＋前后的红外光谱分析　 菌株在
含一定浓度 Ｃｄ２ ＋的液体培养基中培养 ２４ ｈ 后，８０００
ｒ·ｍｉｎ － １离心 ５ｍｉｎ收集菌体，用去离子水清洗 ３ 次，真
空冷冻干燥后，将 １ｍｇ干燥样品与 １００ ｍｇ ＫＢｒ磨细混
匀，在 １０ ｔ·ｃｍ － ２下压成薄片并保持 ３０ ｓ，用 ＦＴＩＲ光谱
仪（ＴＥＮＳＯＲ － ２７，德国布鲁克光谱仪器公司）测定并
记录红外光谱。
１􀆰 ２􀆰 ４　 菌体富集 Ｃｄ２ ＋前后的圆二色光谱分析　 菌体
在含一定浓度 Ｃｄ２ ＋的液体培养基中培养 ２４ ｈ后，用无
菌生理盐水清洗 ３ 遍，然后用无菌生理盐水重悬，使其
紫外吸光值均为 １􀆰 ０ 左右，进行圆二色光谱（Ｊ － ８１５，
日本 ＪＡＳＣＯ 公司）测定。 光源系统用氮气保护（流量
为 ５Ｌ·ｍｉｎ － １）采用 １ｍｍ光径样品池，光谱扫描时均扣
除溶液空白的干扰，测量参数为：扫描波长范围设定为
１９０ ～ ２５０ｎｍ远紫外区域，用于研究不同蛋白样品的二
级结构，扫描速度为 １００ｎｍ·ｍｉｎ － １，分辨率 ０􀆰 ５ｎｍ，响
应时间为 １ｓ，狭缝宽度 ２ｎｍ，累计次数为 ３ 次。
１􀆰 ２􀆰 ５　 电镜观察分析　 分别取一定浓度 Ｃｄ２ ＋液体培
养基中培养 ２４ ｈ 的菌体，用去离子水清洗 ３ 遍，用
２􀆰 ５％戊二醛固定，经过乙醇梯度脱水、冷冻真空干燥
等操作后，利用扫描电镜（ＳＥＭ，Ｓ － ３４００Ｎ，日本日立
公司）观察菌体表面特征，根据能谱仪对菌体元素分
布进行定性定量分析。
菌体用去离子水清洗 ３ 遍，用 ２􀆰 ５％戊二醛固定，
锇酸再固定，乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片
等操作后，采用透射电镜（ＴＥＭ，Ｈ － ７６５０，日本日立公
司）观察菌体内部结构的变化。
取一定量的菌液置于新剥离的云母片表面使之成
膜，３０ｍｉｎ后用去离子水轻轻冲洗表面，以除去杂质盐
沉积物和弱吸附蛋白质，并用无水乙醇洗涤表面，脱去
水分，在无菌台上使其自然风干后，用原子力显微镜
（ＡＦＭ，ＢｉｏＳｃｏｐｅ，美国 Ｖｅｅｃｏ 精密仪器有限公司）观察
菌体的成像。
２　 结果与分析
２􀆰 １　 Ｃｄ２ ＋初始浓度对富集效果的影响
在液体培养基中添加一定量的 Ｃｄ２ ＋ ，使之达到预
设的浓度，接菌量为 ６％ （体积分数，下同），适宜 ｐＨ
条件下，在 ３７℃、１２０ｒ·ｍｉｎ － １的恒温培养箱中培养 ２４
ｈ。 不同 Ｃｄ２ ＋初始浓度下的吸附率和残留量如图 １ 所
示。 随着 Ｃｄ２ ＋初始质量浓度的增加，Ｃｄ２ ＋的吸附率降
低，但吸附量（Ｃ０ － Ｃ）增大。 当 Ｃｄ２ ＋初始质量浓度为
５００ｍｇ·Ｌ － １时，吸附率仅为 ４２􀆰 ５％ 。 吸附率降低的原
因可能是随着 Ｃｄ２ ＋ 初始浓度的逐渐增大，菌株对
Ｃｄ２ ＋的吸附接近饱和，同时高浓度的 Ｃｄ２ ＋会抑制地衣
芽孢杆菌的生长繁殖甚至导致死亡，减弱了菌株对
Ｃｄ２ ＋的吸附作用。 因此，说明经驯化后的地衣芽孢杆
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核　 农　 学　 报 ２７ 卷
图 １　 Ｃｄ２ ＋初始浓度对富集效果的影响
Ｆｉｇ． １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｄ２ ＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
菌对初始质量浓度为 ５０ ～ ５００ｍｇ·Ｌ － １的 Ｃｄ２ ＋都具有
一定的耐受性和富集能力。
２􀆰 ２　 时间对富集效果的影响
当液体培养基中 Ｃｄ２ ＋的初始浓度为 １００ｍｇ·Ｌ － １，
接种量设定为 ６％ ，适宜的 ｐＨ值条件下，在 ３７℃、１２０ｒ
·ｍｉｎ － １的恒温培养箱中培养 ６、１２、１８、２４、３６、４８ ｈ。 在
不同吸附时间下残留量和吸附率如图 ２。 在 Ｃｄ２ ＋浓度
一定的条件下，随着菌株培养时间的延长，溶液中残留
的 Ｃｄ２ ＋浓度由 ６ ｈ 的 ８６􀆰 ７３ｍｇ·Ｌ － １迅速降低至 ２４ ｈ
的 ３２􀆰 ０１ｍｇ·Ｌ － １，但当时间超过 ２４ ｈ 后，溶液中残留
Ｃｄ２ ＋的浓度有增加的趋势，出现了脱附现象，吸附率
开始降低。 这是由于细菌对重金属的吸附很大程度上
都是直接结合在细胞表面，此作用的特点是快速、可逆
而且不需要能量代谢［１４］。 细胞壁是细菌与重金属接
触的最早的部分，它富含羧基和磷酸阴离子，很容易和
重金属结合。 当培养 ２４ ｈ左右时，地衣芽孢杆菌处于
对数期或稳定期，菌体具有较大的活性以及较强的繁
殖能力，对重金属的吸附能力也就越强。 随后地衣芽
孢杆菌逐渐进入到衰亡期，此时细菌死亡率逐渐增加，
总的活菌数明显下降，形态显著改变，出现菌体自溶、
生理代谢活动趋于停滞［１５］，导致了重金属的脱附现
象。
２􀆰 ３　 通气量对富集效果的影响
微生物培养时需要适量的溶氧量来维持呼吸代谢
和某些代谢产物的合成，溶氧不足会造成代谢异常。
装瓶量是影响液体培养液溶氧量的重要因素，装瓶量
越大，溶氧量越少，这样就影响菌体的生长。 当液体培
养基中 Ｃｄ２ ＋的初始浓度为 １００ｍｇ·Ｌ － １，接种量设定为
图 ２　 时间对富集效果的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂｉｏｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
６％ ，装瓶量分别为 １０、２０、４０、６０、８０ｍＬ，适宜的 ｐＨ 条
件下，在 ３７℃、１２０ｒ·ｍｉｎ － １的恒温摇床中培养 ２４ ｈ。 不
同装瓶量（通气量）条件下菌体对重金属的吸附率与
残留量见图 ３。 随着装瓶量的增加，菌体生长和吸附
Ｃｄ２ ＋的能力越来越差。 结果表明菌体对 Ｃｄ２ ＋的吸附
率由装瓶量 １０ｍＬ 的 ６８􀆰 ７７％降低到装瓶量 ８０ｍＬ 的
３５􀆰 ８８％ 。 这就说明了氧气对菌株生长繁殖和吸附
Ｃｄ２ ＋的性能具有一定的影响。 但是总体来看，在
１００ｍＬ的细菌培养瓶中装 ６０ｍＬ 的液体培养基时，地
衣芽孢杆菌仍然表现出较好的生长水平和吸附 Ｃｄ２ ＋
的能力。 综合考虑成本和菌株生长情况，选用 １００ｍＬ
的细菌培养瓶中装 ４０ ～ ５０ｍＬ的液体培养基均可行。
图 ３　 通气量对富集效果的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
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　 １１ 期 地衣芽孢杆菌富集镉的特性及机理研究
２􀆰 ４　 接菌量对富集效果的影响
当液体培养基中 Ｃｄ２ ＋的初始浓度为 １００ｍｇ·Ｌ － １，
接菌量分别为 ２％ 、４％ 、６％ 、８％ 、１０％ ，适宜的 ｐＨ 值
条件下，在 ３７℃、１２０ｒ·ｍｉｎＬ － １的恒温培养箱中培养
２４ｈ。 不同接菌量条件下的残留量和吸附率如图 ４ 所
示。 在 Ｃｄ２ ＋浓度一定的条件下，随着接种量的增加，
溶液中残留 Ｃｄ２ ＋的量逐渐减少，吸附率逐渐增大。 当
接菌量为 ２％时，地衣芽孢杆菌对 Ｃｄ２ ＋ 的吸附率为
４５􀆰 ０５％ ；而当接菌量达到 １０％ 时， 吸附率高达
７４􀆰 ６６％ ，趋于平衡。 在低浓度的 Ｃｄ２ ＋溶液中，微生物
细胞经过一段停滞后能够适应并继续生长，此时的微
生物细胞处于 Ｃｄ －介导胞内损害的修复和细胞生理
调整以限制细胞内毒性离子分布的时期［１６］。 当接菌
量小时，初期生长缓慢，需要经历较长的停滞期后才能
适应和继续生长；而当增加接菌量时，它们能明显地缩
短停滞期，抵抗恶劣的环境。 随着溶液中菌数量的增
加，吸附表面积增大，相应的活性位点增多，使菌株与
Ｃｄ２ ＋的接触机会增多［１７］。
图 ５　 在 ０ｍｇ·Ｌ －１（ａ）和 １０００ｍｇ·Ｌ －１（ｂ）Ｃｄ２ ＋条件下培养的地衣芽孢杆菌红外光谱图
Ｆｉｇ． ５　 ＦＴＩＲ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ０ｍｇ·Ｌ －１（ａ） ａｎｄ １０００ｍｇ·Ｌ －１（ｂ） Ｃｄ２ ＋
２􀆰 ５　 红外图谱分析
样品 ａ、ｂ的红外谱图相比，地衣芽孢杆菌细胞壁
含有大量多糖及蛋白质等物质相关峰， 在吸附 Ｃｄ２ ＋
后羟基峰、羰基峰均有紫移，且吸附后有新的谱带出
现。 １５４２、１６４９、１７３４ｃｍ － １处的谱峰来自典型的蛋白质
酰胺 Ｉ带（Ｎ⁃Ｈ的弯曲振动与 Ｃ—Ｎ 伸展振动的叠加）
和酰胺 Ｉ 带（ＣＯ 的伸展振动） ［１８］。 菌体积累 Ｃｄ２ ＋之
后，新增了一个波数为 １７３４ｃｍ － １的吸收峰，呈现出羰
基 和 酰 胺 基 （ － ＣＯ—，—ＣＯ—ＮＨ—） 的 变 化。
１３９３ｃｍ － １左右的吸收峰说明菌体中—ＣＨ２ 和—ＣＨ３ 的
存在，也可能存在 ＣＯＯ—基团；１２３８ｃｍ － １为 Ｐ Ｏ 和
Ｃ—Ｓ的伸缩振动以及 Ｃ—Ｏ 与 Ｏ—Ｈ 的叠加吸收峰；
１０６５ｃｍ － １为—ＰＯ４ ３ － 、胺基中的 Ｃ—Ｎ 伸缩振动吸收
峰［８， １９］。 这表明菌体对 Ｃｄ２ ＋的吸附以表面吸附为主，
图 ４　 接种量对富集效果的影响
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ
ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
吸附位点主要是菌体蛋白质、多糖的羟基、羰基和酰胺
基等。
２􀆰 ６　 圆二色光谱分析
菌体蛋白质在溶液中存在多种二级结构，如 α －
螺旋、β －折叠、 β －转角以及无规卷曲等［２０］。 当菌体
在含有重金属离子的培养基中培养，金属离子和蛋白
质发生相互作用，因此可导致蛋白质的二级结构发生
改变。 远紫外区的圆二色光谱反映了蛋白质或多肽的
规则二级结构中肽键排列的方向和能级跃迁情况，具
有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生的 ＣＤ 谱带的
位置、吸收的强弱都不相同。 因此 ＣＤ 光谱可以灵敏
地检测蛋白质分子二级结构的变化［２１］。
由图 ６ 可以看出，随着 Ｃｄ２ ＋浓度的增加，ＣＤ光谱
的正峰和负峰的强度略有减少，形状跟峰位也发生了
明显的改变。 菌体样品 ａ在 ２１０ ～ ２４０ ｎｍ处有一较大
的负峰，而 ｂ样品在此处的负峰强度明显减弱。 Ｂ 样
品的 ＣＤ 波谱相对于样品 ａ 有明显的蓝移现象，表明
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核　 农　 学　 报 ２７ 卷
重金属 Ｃｄ２ ＋改变了菌体蛋白的空间构象。
图 ６　 在 ０ｍｇ·Ｌ －１（ａ）和 １０００ｍｇ·Ｌ －１（ｂ）Ｃｄ２ ＋
条件下培养的地衣芽孢杆菌圆二色光谱图
Ｆｉｇ． ６　 ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ
０ｍｇ·Ｌ －１（ａ） ａｎｄ １０００ｍｇ·Ｌ －１（ｂ） Ｃｄ２ ＋
图 ７　 在 ０ｍｇ·Ｌ －１（Ａ）和 １０００ｍｇ·Ｌ －１（Ｂ）Ｃｄ２ ＋条件下培养的地衣芽孢杆菌扫描电镜照片
Ｆｉｇ． ７　 ＳＥＭ ｏｆ Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ０ｍｇ·Ｌ －１（Ａ） ａｎｄ １０００ｍｇ·Ｌ －１（Ｂ） Ｃｄ２ ＋
２􀆰 ７　 超微结构分析结果
利用扫描电镜对生长在 ０、１０００ｍｇ·Ｌ － １ Ｃｄ２ ＋中的
地衣芽孢杆菌进行细胞外观察，扫描的图片见图 ７。 从
图中可以看出，２ 种条件下菌体的存在形式和形态均
不同，在无 Ｃｄ２ ＋存在的条件下菌体呈松散的杆状或者
单个细胞，细胞的平均大小为 １􀆰 ５ － ３􀆰 ０ μｍ × ０􀆰 ７５ －
１􀆰 ０ μｍ，表面光滑；当地衣芽孢杆菌在高浓度 Ｃｄ２ ＋条
件下培养，菌体仍然呈现杆状，细胞的平均大小为 １􀆰 ５
－ ５􀆰 ０ μｍ ×０􀆰 ５ － ０􀆰 ７５ μｍ，表面粗糙，有聚集物存在，
菌体间存在较多的杂质，而且还有较大的颗粒附着，可
能是 Ｃｄ２ ＋对细胞产生毒害作用，菌体在液体培养时表
面吸附 Ｃｄ２ ＋或使 Ｃｄ２ ＋在细胞表面形成沉淀而达到富
集镉与降低毒性，以增加其在高浓度 Ｃｄ２ ＋存在环境下
生存能力。
从菌体富集 Ｃｄ２ ＋前后能谱分析图谱 （图 ８）可以
看出，在含有 Ｃｄ２ ＋的培养液中生长的菌体细胞壁检测
出镉元素的存在，占总元素的 １􀆰 ７２％ （原子百分比），
而且谱图中可以看出 Ｃ、Ｏ、Ｐ元素的含量较高，说明菌
体可能通过细胞壁上的一些基团如羧基、羰基、磷酰
基、羟基等与金属结合来实现对 Ｃｄ２ ＋的富集。
对菌体富集前后表面观察显示，０ｍｇ·Ｌ － １条件下
的菌体饱满且均为杆状，表面光滑；１０００ｍｇ·Ｌ － １ Ｃｄ２ ＋
条件下培养 ２４ｈ后，菌体表面变得凹凸不平，有物质在
菌体表面沉积（图 ９）。
进一步研究 Ｃｄ 在地衣芽孢杆菌内部的沉积作
用，将无镉和高镉浓度（１０００ｍｇ·Ｌ － １）培养的菌体，进
行透射电镜观察（图 １０）。 无镉存在时，菌体表面光
滑，胞内充实，细胞壁与细胞膜紧密结合；在高浓度镉
存在时，菌体表面凹凸不平，细胞壁与膜分离，体内疏
松，可能是由于大量的 Ｃｄ２ ＋存在于细胞壁上导致边缘
的壁物质松散［２２］。 结合原子力显微镜可知，颗粒物质
的大小的 ５０ ｎｍ左右，推测为含 Ｃｄ的沉淀物。 这与报
道的有些菌可在细胞内外形成超微可见的重金属沉积
物相一致［１２， ２２］。
３　 结论
本研究驯化获得的地衣芽孢杆菌是用于净化
Ｃｄ２ ＋污染土壤的优良菌株，具有良好的应用前景。 地
衣芽 孢 杆 菌 依 靠 细 胞 壁 具 有 的 各 种 功 能 团
（—ＣＯ—，—ＯＨ，—ＣＯ—ＮＨ—等）、表面分泌物聚集和
富集 Ｃｄ２ ＋ 。 菌株具有很强的富集 Ｃｄ２ ＋的能力，不仅
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　 １１ 期 地衣芽孢杆菌富集镉的特性及机理研究
　 　 　 　
图 ８　 在 ０ｍｇ·Ｌ －１（Ａ）和 １０００ｍｇ·Ｌ －１（Ｂ）Ｃｄ２ ＋条件下培养的地衣芽孢杆菌 ＥＭＡＸ能谱分析图
Ｆｉｇ． ８　 ＥＭＡＸ ｏｆ Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ０ｍｇ·Ｌ －１（Ａ） ａｎｄ １０００ｍｇ·Ｌ －１（Ｂ） Ｃｄ２ ＋
图 ９　 在 １０００ｍｇ·Ｌ －１Ｃｄ２ ＋条件下培养的地衣芽孢杆菌的原子力显微镜图
Ｆｉｇ． ９　 ＡＦＭ ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｓ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ １０００ｍｇ·Ｌ －１Ｃｄ２ ＋
图 １０　 在 ０ｍｇ·Ｌ －１（Ａ）和 １０００ｍｇ·Ｌ －１（Ｂ）Ｃｄ２ ＋条件下培养的地衣芽孢杆菌透射电镜照片
Ｆｉｇ． １０　 ＴＥＭ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ０ｍｇ·Ｌ －１（Ａ） ａｎｄ １０００ｍｇ·Ｌ －１（Ｂ） Ｃｄ２ ＋
９４６１
核　 农　 学　 报 ２７ 卷
在菌体表面存在大量含 Ｃｄ２ ＋的颗粒，而且在体内也大
量存在。 在有 Ｃｄ２ ＋存在时，菌体蛋白发生了变化。
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ＳＵＮ Ｊｉｎｇ　 ＬＩ Ｙｅ　 ＬＩＵ Ｌｉａｎ⁃ｇｕｏ　 ＺＨＡＮ Ｐｉｎｇ⁃ｐｉｎｇ　 ＺＨＡＮＧ Ｃｈｕｎ⁃ｄａｎ　 ＳＵ Ｘｉｕ⁃ｒｏｎｇ
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Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｃａｄｍｉｕｍ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ
ｆｏｒ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｏ ｃａｄｍｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｄ２ ＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ， ｖｅｎｔｉｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｎ ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ． Ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆ ｃａｄｍｉｕｍ ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｓｔａｉｎ Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｉｎｆｒａｒｅｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （ ＦＴＩＲ）， ｃｉｒｃｕｌａｒ
ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ （ＣＤ）， ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ⁃ｅｎｅｒｇｙ ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ Ｘ⁃ｒａｙ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ （ ＳＥＭ⁃ＥＤＸ） ａｎｄ ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ
ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ （ＡＦＭ）． Ｉｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ ａ ｂａｌａｎｃｅ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ａｍｏｕｎｔ ｗｅｒｅ ２４ ｈ ａｎｄ ６％ ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ， ｔｈｅ ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
ｒａｔｅ ｗａｓ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ４０ｍＬ ｔｏ ５０ｍＬ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ １００ｍＬ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｌａｓｋ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｅ ｂｅｓｔ
ｃｈｏｉｃｅ； ｔｈｅ ｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃａｎ ｒｅｓｉｓｔ ａｎｄ ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ Ｃｄ２ ＋ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｍａｓｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ５０ ～ ５００ｍｇ·Ｌ － １ ．
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｍｕｃｈ ｇｒａｎｕｌａｒ ｃａｄｍｉｕｍ ｗａｓ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｗａｌｌ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐｓ ｓｕｃｈ ａｓ ⁃ＯＨ， － ＣＯ － ， － ＣＯ⁃ＮＨ － ， ａｎｄ ⁃ＰＯ４ ３ － ． Ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ Ｃｄ２ ＋ ｈａｄ ｃｈａｎｇｅｄ ｔｈｅ
ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｐａｃｅ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ａｌｌ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｓｏｍｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｄａｔａ ｆｏｒ Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ
ｃａｄｍｉｕｍ ａｎｄ ｂｉｏｓｏｒｐｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐｓ， ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｄ２ ＋ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ； Ｃａｄｍｉｕｍ； Ｂｉｏａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ； Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ
１５６１