全 文 ：摇 核 农 学 报摇 圆园员猿袁圆苑渊猿冤院园圆苑怨 耀 园圆愿缘允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员圆鄄员园鄄员圆摇 接受日期院圆园员猿鄄园员鄄员远
基金项目院国家自然科学基金渊猿员员苑员缘怨愿冤袁国家野愿远猿冶计划渊圆园员圆粤粤员园员员园愿冤
作者简介院霍雪寒渊员怨愿苑鄄冤袁女袁硕士研究生袁研究方向为发育生物学遥 栽藻造院园缘猿员鄄愿猿员苑愿圆愿远曰耘鄄皂葬蚤造院遭扎澡怎燥曾怎藻澡葬灶圆园园远员圆岳 员远猿援 糟燥皂
通讯作者院张军渊员怨远愿鄄冤袁男袁博士袁研究员袁研究方向为棉花生物技术与育种应用遥 栽藻造院园缘猿员鄄愿猿员苑愿圆愿远曰 耘鄄皂葬蚤造院泽糟则糟扎躁岳 泽葬葬泽援 葬糟援 糟灶
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员猿冤园猿鄄园圆苑怨鄄园苑
棉花 月葬曾 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则鄄员基因启动子的克隆及初步验证
霍雪寒员袁圆 摇 张景霞圆 摇 张传云圆 摇 王芙蓉圆 摇 张摇 军员袁圆
渊员山东师范大学生命科学学院袁山东 济南摇 圆缘园园员源曰 圆 国家棉花改良中心山东分中心 辕山东棉花研究中心袁 山东 济南摇 圆缘园员园园冤
摘摇 要院为研究克隆自陆地棉的 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月基因的表达差异及其响应不同物生和非生物胁迫的
分子机制袁利用 月阅 郧藻灶燥皂藻宰葬造噪藻则栽酝 哉灶蚤增藻则泽葬造 运蚤贼的染色体步移技术得到了 圆 个棉花 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄
员月基因 缘忆端上游的启动子序列袁长度分别为 员远缘园遭责 和 圆园园员遭责遥 生物信息学分析表明袁郧澡月陨鄄员粤 和
郧澡月陨鄄员月的启动子序列均存在 栽粤栽粤鄄遭燥曾和 悦粤粤栽鄄遭燥曾及多个与植物非生物胁迫相关的响应元件袁郧澡月陨鄄
员月启动子中还含有真菌诱导应答元件遥 以表达载体 责月陨员园员 为基础袁 用所克隆的 圆 个棉花 郧澡月陨鄄员 基因
启动子序列与 郧哉杂报告基因融合袁构建新的植物表达载体并转入农杆菌遥 用叶盘法侵染烟草进行瞬时
表达袁结果表明 圆 个启动子均能够驱动报告基因的表达遥
关键词院棉花曰郧澡月陨鄄员 基因启动子曰克隆曰瞬时表达
悦造燥灶蚤灶早 葬灶凿 栽藻泽贼 燥枣 月葬曾 陨灶澡蚤遭蚤贼燥则鄄员 郧藻灶藻 孕则燥皂燥贼藻则泽 枣则燥皂
哉责造葬灶凿 悦燥贼贼燥灶 渊郧燥泽泽赠责蚤怎皂 澡蚤则泽怎贼怎皂 蕴援 冤
匀哉韵 载怎藻鄄澡葬灶员袁圆 摇 在匀粤晕郧 允蚤灶早鄄曾蚤葬圆 摇 在匀粤晕郧 悦澡怎葬灶鄄赠怎灶圆 摇 宰粤晕郧 云怎鄄则燥灶早圆 摇 在匀粤晕郧 允怎灶员袁 圆
渊员 粤糟葬凿藻皂赠 燥枣 月蚤燥造燥早蚤糟葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁杂澡葬灶凿燥灶早 晕燥则皂葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁允蚤灶葬灶袁 杂澡葬灶凿燥灶早摇 圆缘园园员源曰
圆 杂澡葬灶凿燥灶早 杂怎遭糟藻灶贼藻则 燥枣 晕葬贼蚤燥灶葬造 悦燥贼贼燥灶 陨皂责则燥增藻皂藻灶贼 悦藻灶贼藻则 燥枣 悦澡蚤灶葬 辕 杂澡葬灶凿燥灶早 悦燥贼贼燥灶 砸藻泽藻葬则糟澡 悦藻灶贼藻则袁 允蚤灶葬灶袁 杂澡葬灶凿燥灶早摇 圆缘园员园园 冤
粤遭泽贼则葬糟贼院栽燥 蚤灶增藻泽贼蚤早葬贼藻 贼澡藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 泽糟藻灶泽则蚤燥 燥枣 月葬曾 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则鄄员 渊郧澡月陨鄄员粤 葬灶凿 郧澡月陨鄄员月冤 早藻灶藻泽 糟造燥灶藻凿 枣则燥皂 哉责造葬灶凿
悦燥贼贼燥灶 渊郧燥泽泽赠责蚤怎皂 澡蚤则泽怎贼怎皂 蕴援 冤 葬灶凿 贼澡藻 皂燥造藻糟怎造葬则 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 贼澡藻蚤则 凿蚤增藻则泽藻 则藻泽责燥灶泽藻 贼燥 遭蚤燥贼蚤糟 葬灶凿 葬遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽袁 贼澡藻
责则燥皂燥贼藻则 枣则葬早皂藻灶贼泽 燥枣 员远缘园遭责 葬灶凿 圆园园员遭责 怎责泽贼则藻葬皂 贼澡藻 缘爷 藻灶凿 燥枣 郧澡月陨鄄员粤 葬灶凿 郧澡月陨鄄员月 憎藻则藻 蚤泽燥造葬贼藻凿 枣则燥皂 贼澡藻 早藻灶燥皂蚤糟
阅晕粤 燥枣 哉责造葬灶凿 悦燥贼贼燥灶 遭赠 月阅 郧藻灶燥皂藻宰葬造噪藻则栽酝 哉灶蚤增藻则泽葬造 运蚤贼 贼藻糟澡灶蚤择怎藻援 月蚤燥蚤灶枣燥则皂葬贼蚤糟泽 葬灶葬造赠泽蚤泽 则藻增藻葬造藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 贼憎燥
责则燥皂燥贼藻则 泽藻择怎藻灶糟藻泽 糟燥灶贼葬蚤灶藻凿 遭葬泽蚤糟 糟蚤泽鄄藻造藻皂藻灶贼泽袁 泽怎糟澡 葬泽 栽粤栽粤鄄遭燥曾 葬灶凿 悦粤粤栽鄄遭燥曾 葬灶凿 皂葬灶赠 藻造藻皂藻灶贼泽 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 贼澡藻
责造葬灶贼 葬遭蚤燥贼蚤糟 泽贼则藻泽泽 则藻泽责燥灶泽藻援 郧澡月陨鄄员月 葬造泽燥 蚤灶糟造怎凿藻凿 葬 月燥曾鄄宰员袁 憎澡蚤糟澡 蚤泽 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 枣怎灶早葬造 则藻泽责燥灶泽藻援 孕造葬灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶
增藻糟贼燥则泽 憎藻则藻 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿 遭赠 蚤灶泽藻则贼蚤灶早 贼澡藻 贼憎燥 郧澡月陨鄄员 责则燥皂燥贼藻则 泽藻择怎藻灶糟藻泽 蚤灶贼燥 贼澡藻 怎责泽贼则藻葬皂 燥枣 贼澡藻 郧哉杂 早藻灶藻 燥枣 贼澡藻 遭蚤灶葬则赠
增藻糟贼燥则 责月陨员园员袁 葬灶凿袁 贼则葬灶泽枣藻则则藻凿 蚤灶贼燥 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽援 栽澡藻 则藻泽怎造贼 燥枣 贼则葬灶泽蚤藻灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡葬贼 遭燥贼澡
泽藻择怎藻灶糟藻泽 澡葬凿 贼澡藻 枣怎灶糟贼蚤燥灶 贼燥 凿则蚤增藻 则藻责燥则贼藻则 早藻灶藻 郧哉杂 蚤灶 贼燥遭葬糟糟燥援
运藻赠 憎燥则凿泽院郧燥泽泽赠责蚤怎皂 澡蚤则泽怎贼怎皂曰 郧澡月陨鄄员 责则燥皂燥贼藻则泽曰 悦造燥灶藻曰 栽则葬灶泽蚤藻灶贼 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶
摇 摇 诱导型启动子在受到生物或非生物胁迫后能够适
时地驱动外源基因的高效表达袁因此在植物抗逆基因
工程中袁比组成型启动子更具有优势袁是启动子研究的
热点问题咱员暂 遥 目前袁植物中研究的最为广泛的诱导型
启动子是拟南芥 则凿圆怨粤启动子咱员 原 怨暂 遥 运葬泽怎早葬等咱远暂利用
拟南芥 则凿圆怨粤启动子驱动胁迫诱导转录因子 阅砸耘月员粤
在烟草中表达袁提高了烟草对干旱和低温胁迫的耐受
性曰孕藻造造藻早则蚤灶藻泽糟澡蚤等咱怨暂和 孕燥造蚤扎藻造 等咱愿暂将该融合基因分
怨苑圆
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
别转化小麦和大豆袁提高了小麦和大豆对干旱胁迫的
耐受性遥 有关生物病原菌胁迫诱导型启动子的研究也
有一些报道遥 天麻的 郧粤云孕鄄圆 基因启动子与 郧哉杂 基因
融合后转化烟草袁结果显示 郧粤云孕鄄圆鄄郧哉杂 基因受真菌
诱导具有较强的表达活性咱员园暂 遥 棉花生育期较长袁在生
长发育过程中经常遭受多种生物和非生物的胁迫袁例
如干旱尧盐碱尧低温以及各种病原菌的危害袁利用诱导
性启动子进行棉花抗逆基因工程改良袁使外源基因适
时高效表达袁一方面增强棉花的耐旱尧耐盐碱尧耐受低
温胁迫咱员员暂及抗病能力曰另一方面袁避免了外源基因表
达所导致的棉花体内资源的浪费袁对当前棉花生产具
有重要意义遥
月葬曾 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则鄄员渊简称 月陨鄄员冤是 员怨怨愿 年被克隆鉴定
的凋亡抑制基因咱员圆袁员猿暂 袁其蛋白产物可抑制由 月葬曾 引起
的细胞凋亡遥 月陨鄄员 是一个保守的膜蛋白袁具有多个跨
膜结构咱员源袁员缘暂 袁与 月糟造类似袁主要定位在细胞内膜上咱员缘暂 遥
研究表明袁月陨鄄员 能增强植物对干旱尧高盐与病原体侵染
等胁迫的耐受性咱员远暂 袁这可能与 月陨 基因抑制各种生物
和非生物胁迫介导的植物细胞程序化死亡有关遥 拟南
芥尧辣椒咱猿缘 原 猿苑暂等植物中有关 月陨鄄员 基因功能的研究已
有报道袁而棉花尚未对该基因进行深入研究遥 本实验
室在前期研究中从陆地棉渊郧援 澡蚤则泽怎贼怎皂 蕴援 冤基因组中
克隆得到了 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 两个基因袁序列分析
表明 圆 个基因的核酸序列同源性达到 愿远豫 袁氨基酸序
列同源性达到 愿苑豫 咱员苑暂 曰进一步研究表明袁郧澡月陨鄄员粤 和
郧澡月陨鄄员月在受到生物和非生物胁迫后表达量均表现上
调袁并且两个基因在应答不同的胁迫信号时存在表达
差异咱员愿暂 遥 其中 郧澡月陨鄄员粤 在衣霉素处理的内质网胁迫
下袁表达量显著上调袁而 郧澡月陨鄄员月则在接种黄萎菌后表
达量上调遥 为了研究 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月的表达差异
及该基因在棉花中对生物和非生物胁迫响应的作用机
制袁本研究克隆了棉花 郧澡月陨鄄员 两个基因的启动子序
列袁分析了 圆 个基因启动子区调控元件的异同袁并与
郧哉杂报告基因融合在烟草中进行瞬时表达袁为研究两
个基因的功能以及利用诱导型启动子进行棉花抗逆性
基因工程改良奠定基础遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月启动子序列的克隆
陆地棉渊郧援 澡蚤则泽怎贼怎皂 蕴援 冤品系 悦燥噪藻则猿员圆 在温室栽
培遥 悦栽粤月法咱员怨暂提取叶片基因组 阅晕粤袁并用适合的限
制性内切酶进行酶切处理遥 用染色体步移法 渊 月阅
郧藻灶燥皂藻宰鄄葬造噪藻则栽酝 哉灶蚤增藻则泽葬造 运蚤贼袁悦造燥灶贼藻糟澡冤克隆目标启
动子序列袁限制性内切酶渊产生平端的酶冤酶解 阅晕粤
产生不同的片段袁然后将这些 阅晕粤片段连接已知的接
头袁形成带有接头的基因组文库袁以含有接头的基因组
阅晕粤 文库作为模板袁用外侧接头引物 渊 粤孕员袁 缘忆鄄
郧栽粤粤栽粤粤悦栽悦粤悦栽粤栽粤郧郧郧悦鄄猿忆冤 和 外 侧 基 因 引 物
渊 郧杂孕粤员袁 缘忆鄄粤悦粤粤郧悦郧悦粤悦粤粤粤粤栽粤郧郧郧栽悦粤栽粤鄄猿忆曰
郧杂孕月员袁 缘忆鄄郧粤粤粤栽悦栽郧粤悦郧郧粤粤粤栽栽悦栽栽郧粤郧栽郧鄄猿忆冤 分
别进行第一轮 孕悦砸 扩增遥 接着用内侧接头引物
渊粤孕圆袁缘忆鄄粤悦栽粤栽粤郧郧郧悦粤悦郧悦郧栽郧郧栽鄄猿忆冤尧内侧基因特
异引物渊郧杂孕粤圆袁缘忆鄄郧栽郧栽栽郧栽粤粤栽栽悦悦粤悦栽郧郧悦栽栽悦栽悦鄄
猿忆曰郧杂孕月圆袁缘忆鄄栽粤栽悦郧栽粤粤悦栽悦悦粤郧栽栽郧悦栽栽悦栽悦郧鄄猿忆冤分
别进行第二轮 孕悦砸 扩增遥 基因片段用琼脂糖凝胶回
收试剂盒渊天根袁北京冤进行回收袁然后纯化的 阅晕粤 片
段连接至 责郧耘酝鄄栽 耘葬泽赠载体渊孕则燥皂藻早葬袁哉杂粤冤遥 重组质
粒由重组质粒经抗生素尧琢鄄互补筛选和 孕悦砸 方法检测
后袁送往上海博尚生物技术有限公司测序遥
员郾 圆摇 载体构建
为了验证 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 基因启动子的功
能袁分别构建以下质粒院在正向引物内加入一个
匀蚤灶凿陨陨陨限制性酶切位点渊以下划线表示袁郧杂孕粤枣院缘忆鄄
悦悦悦粤粤郧悦栽栽悦粤栽郧栽栽郧栽栽栽栽粤栽栽粤郧郧粤栽郧粤栽栽郧粤鄄猿忆曰
郧杂孕月枣院 缘忆鄄悦悦粤粤郧悦栽栽郧粤郧栽栽郧悦栽郧悦栽栽悦栽悦悦栽郧郧粤粤鄄
粤粤郧栽鄄猿忆冤袁而在反向引物内加入一个 月葬皂匀 陨位点渊以
下 划 线 表 示袁 郧杂孕粤则院 缘忆鄄悦郧郧郧粤栽悦悦郧栽悦郧粤粤郧郧鄄
粤郧郧粤粤粤粤粤郧粤粤粤悦粤郧粤粤鄄猿忆曰 郧杂孕月则院 缘忆鄄郧悦郧郧郧粤鄄
栽悦悦粤郧粤郧粤粤粤粤栽粤粤悦粤郧粤粤粤粤栽栽郧悦栽悦粤鄄猿忆冤遥 启 动
子序列长度分别为 员远缘园遭责 和 圆园园员遭责袁连接到 责月陨员园员
中 郧哉杂 报告基因的上游袁分别构建 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员粤院院
郧哉杂 和 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员月院院 郧哉杂曰含有花椰菜叶病毒
渊悦葬酝灾冤 猿缘杂 启动子加 郧哉杂 基因 渊 猿缘杂院院 郧哉杂冤 的
责月陨员圆员 载 体 作 阳 性 对 照曰 仅 含 报 告 基 因
渊责则燥皂燥贼藻则造藻泽泽院院郧哉杂冤的载体 责月陨员园员 作阴性对照遥
员郾 猿摇 农杆菌介导的烟草转化及启动子瞬时活性检测
将 载 体 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员粤院院 郧哉杂尧 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员月院院
郧哉杂尧 责月陨员圆员 和 责月陨员园员 通过冻融法转化农杆菌
郧增猿员园员袁并用叶盘法转化烟草进行瞬时表达分析遥 将
烟草组培苗叶片切成 员 糟皂 伊员 糟皂的叶块袁在农杆菌菌
液浓度 韵阅为 园郾 缘 的菌液中侵染 员园 皂蚤灶后咱圆园暂 袁用无菌
滤纸吸干叶片表面的菌液袁置于共培养基上 圆缘益暗培
养 猿凿 后进行 郧哉杂 染色分析遥 郧哉杂 活性检测按
允藻枣枣藻则泽燥灶咱圆员暂的方法进行袁将待检测植物组织置于青霉
素小瓶中袁加入 郧哉杂染色液浸没组织袁抽真空袁猿苑益下
温育 员远 耀 圆源 澡袁其后袁用 苑园豫乙醇和 猿园豫乙酸的混合
液脱色后取出观察染色结果袁并用数码相机拍照遥
园愿圆
摇 猿 期 棉花 月葬曾 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则鄄员 基因启动子的克隆及初步验证
表 员摇 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月基因启动子调控元件分析
栽葬遭造藻 员摇 悦蚤泽鄄 葬糟贼蚤灶早 则藻早怎造葬贼燥则赠 藻造藻皂藻灶贼泽 燥枣 郧澡月陨鄄员粤 葬灶凿 郧澡月陨鄄员月 责则燥皂燥贼藻则 泽藻择怎藻灶糟藻泽
调控元件
耘造藻皂藻灶贼
数量 粤皂燥怎灶贼
郧澡月陨鄄员粤责则燥 郧澡月陨鄄员月责则燥
序列
杂藻择怎藻灶糟藻
位点功能
云怎灶糟贼蚤燥灶
栽粤栽粤鄄遭燥曾 员圆愿 圆怨 栽粤栽粤 悦燥则藻 责则燥皂燥贼藻则 藻造藻皂藻灶贼 葬则燥怎灶凿 鄄猿园 燥枣 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 泽贼葬则贼
悦粤粤栽鄄遭燥曾 猿猿 猿缘 悦粤粤粤栽尧悦粤粤栽尧悦粤粤栽栽尧悦粤粤栽 悦燥皂皂燥灶糟蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶 责则燥皂燥贼藻则 葬灶凿 藻灶澡葬灶糟藻则则藻早蚤燥灶泽
匀杂耘 猿 源
粤郧粤粤粤粤栽栽悦郧尧
悦晕晕郧粤粤晕晕栽栽悦晕晕郧尧
粤粤粤粤粤粤栽栽栽悦
悦蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 澡藻葬贼 泽贼则藻泽泽
则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽咱圆猿暂
粤月砸耘 员 员 粤悦郧栽郧郧悦尧栽粤悦郧栽郧 悦蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 贼澡藻 葬遭泽糟蚤泽蚤糟 葬糟蚤凿则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽咱圆源暂
月燥曾鄄宰员 要 员 栽栽郧粤悦悦 云怎灶早葬造 藻造蚤糟蚤贼燥则 则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼咱圆缘暂
栽郧粤鄄藻造藻皂藻灶贼 要 员 粤粤悦郧粤悦 粤怎曾蚤灶鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼咱圆远 袁圆苑暂
蕴栽砸 要 员 悦悦郧粤粤粤 悦蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 造燥憎鄄贼藻皂责藻则葬贼怎则藻则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽咱圆愿暂
酝月杂 员 员 悦粤粤悦栽郧尧栽粤粤悦栽郧 酝再月 遭蚤灶凿蚤灶早 泽蚤贼藻 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶凿则燥怎早澡贼鄄蚤灶凿怎糟蚤遭蚤造蚤贼赠咱圆怨暂
粤砸耘 员 要 栽郧郧栽栽栽 悦蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 则藻早怎造葬贼燥则赠 藻造藻皂藻灶贼 藻泽泽藻灶贼蚤葬造 枣燥则 贼澡藻 葬灶葬藻则燥遭蚤糟蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶咱猿园暂
栽郧粤悦郧鄄皂燥贼蚤枣 圆 要 栽郧粤悦郧 悦蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 则藻早怎造葬贼燥则赠 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 贼澡藻 酝藻允粤鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽咱猿员暂
悦郧栽悦粤鄄皂燥贼蚤枣 圆 要 悦郧栽悦粤 悦蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 则藻早怎造葬贼燥则赠 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 贼澡藻 酝藻允粤鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽咱猿员暂
郧粤砸耘鄄皂燥贼蚤枣 员 要 粤粤粤悦粤郧粤 郧蚤遭遭藻则藻造造蚤灶鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼咱猿圆暂
栽悦鄄则蚤糟澡 圆 要 郧栽栽栽栽悦栽栽粤悦尧粤栽栽栽栽悦栽悦悦粤 砸藻责藻葬贼泽糟蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 凿藻枣藻灶泽藻 葬灶凿 泽贼则藻泽泽则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽咱猿猿暂
栽郧粤鄄遭燥曾 员 要 栽郧粤悦郧栽郧郧悦 孕葬则贼 燥枣 葬灶葬怎曾蚤灶鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 藻造藻皂藻灶贼咱圆远 袁圆苑暂
栽悦粤鄄藻造藻皂藻灶贼 要 员 悦悦粤栽悦栽栽栽栽栽 悦蚤泽鄄葬糟贼蚤灶早 藻造藻皂藻灶贼 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 泽葬造蚤糟赠造蚤糟 葬糟蚤凿则藻泽责燥灶泽蚤增藻灶藻泽泽咱猿源暂
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月启动子的克隆
采用基于 孕悦砸 的染色体步移克隆 郧澡月陨鄄员粤 和
郧澡月陨鄄员月的启动子序列袁经过两轮 孕悦砸 扩增袁出现明
显的条带袁回收测序遥 通过比较 缘忆非编码序列袁郧澡月陨鄄
员粤和 郧澡月陨鄄员月 分别得到 粤栽郧 上游 员远缘园遭责 和 圆园园员遭责
的序列渊图 员冤袁并且分别含有相应 糟阅晕粤 的 愿源遭责 和
员员圆遭责袁说明所克隆到的 员远缘园遭责和 圆园园员遭责片段分别是
郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月的启动子序列遥
圆郾 圆摇 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月启动子的序列分析
将起始密码子 粤栽郧 的第一个碱基定义为 垣 员袁用
孕造葬灶贼悦粤砸耘咱圆圆暂分别对 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 基因 粤栽郧
上游的序列进行分析遥 发现两个启动子中含有众多已
知真核生物的顺式元件的同源序列袁并且多处都含有
图 员摇 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月基因启动子的扩增
云蚤早援 员摇 粤皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 郧澡月陨鄄员粤 葬灶凿
郧澡月陨鄄员月 责则燥皂燥贼藻则
酝院 阅蕴圆园园园 酝葬噪藻则 渊栽葬噪葬砸葬冤袁 粤院 郧澡月陨鄄员粤 启动子袁
月院郧澡月陨鄄员月 启动子
酝院 阅蕴圆园园园 酝葬噪藻则 渊栽葬噪葬砸葬冤袁 粤院 郧澡月陨鄄员粤 责则燥皂燥贼藻则袁
月院 郧澡月陨鄄员月 责则燥皂燥贼藻则
员愿圆
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
图 圆摇 棉花 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月基因启动子的序列分析
云蚤早援 圆摇 晕怎糟造藻燥贼蚤凿藻 泽藻择怎藻灶糟藻 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 郧澡月陨鄄员粤
葬灶凿 郧澡月陨鄄员月 责则燥皂燥贼藻则
栽粤栽粤框和 悦粤粤栽盒用粗体表示袁诱导性启
动子元件用阴影或方框表示
栽粤栽粤鄄遭燥曾 葬灶凿 悦粤粤栽鄄遭燥曾 泽澡燥憎 蚤灶 枣造藻曾糟责云燥灶贼月燥造凿袁
蚤灶凿怎糟贼蚤增蚤贼赠 藻造藻皂藻灶贼泽 责则燥皂燥贼藻则 泽澡葬凿燥憎 燥则 责葬泽泽责澡则葬泽藻
栽粤栽粤鄄遭燥曾和 悦粤粤栽鄄遭燥曾遥 其中有多种与诱导相关的元
件袁例如袁两个启动子都含有参与脱落酸反应途径的顺
式作用元件 粤月砸耘尧能够结合 酝再月 参与干旱调节的
酝月杂作用元件遥 另外两者也有区别袁郧澡月陨鄄员粤 启动子
中含有厌氧诱导有关的 粤砸耘 作用元件袁郧澡月陨鄄员月 启动
子中含有真菌诱导反应元件 月燥曾鄄宰员遥 两个启动子中
预测到的与诱导有关的反应元件见表 员遥
圆郾 猿摇 植物表达载体 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员粤院院郧哉杂 和 责月陨鄄
责郧澡月陨鄄员月院院郧哉杂的构建
植物表达载体 责月陨员园员 只含有 郧哉杂 基因袁本研究
将克隆到的 圆 个启动子插入到表达载体 责月陨员园员 郧哉杂
基因的上游袁构建表达载体 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员粤院院郧哉杂 和
责月陨鄄责郧澡月陨鄄员月院院郧哉杂袁对重组质粒进行酶切鉴定袁如图
所示得到了约 员远园园遭责和 圆园园园遭责的预期目的片段遥 证
明了 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月基因的 圆 个启动子片段均插
入到 责月陨员园员 载体中遥
图 猿摇 植物表达载体 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员粤院院郧哉杂
和 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员月院院郧哉杂的酶切鉴定
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员粤院院郧哉杂 葬灶凿
责月陨鄄责郧澡月陨鄄员月院院郧哉杂 遭赠 凿蚤早藻泽贼蚤灶早 憎蚤贼澡 月葬皂匀陨驭匀蚤灶凿 陨陨陨
酝院 阅蕴圆园园园 酝葬噪藻则 渊栽葬噪葬砸葬冤曰 粤院 郧澡月陨鄄员粤 启动子袁
月院 郧澡月陨鄄员月 启动子
酝院 阅蕴圆园园园 酝葬噪藻则 渊栽葬噪葬砸葬冤曰 粤院 郧澡月陨鄄员粤 责则燥皂燥贼藻则袁
月院 郧澡月陨鄄员月 责则燥皂燥贼藻则
圆郾 源摇 瞬时表达技术检测启动子的活性
重组表达载体转入农杆菌后袁以含 责月陨员园员 载体为
阴性对照袁植物表达载体 责月陨员圆员 为阳性对照袁对含棉
花 郧澡月陨鄄员 基因启动子的重组载体进行瞬时表达分析遥
从图 源 可以看出袁携带 责月陨鄄责郧澡月陨鄄员粤院院郧哉杂 和 责月陨鄄
责郧澡月陨鄄员月院院郧哉杂 载体的农杆菌侵染后的烟草叶片中
均检测到 郧哉杂基因产物袁表明克隆得到的 郧澡月陨鄄员粤 和
郧澡月陨鄄员月基因的启动子均能驱动下游报告基因的表
达袁均具有启动子功能遥
圆愿圆
摇 猿 期 棉花 月葬曾 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则鄄员 基因启动子的克隆及初步验证
图 源摇 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月启动子的瞬时活性检测
云蚤早援 源摇 阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 贼则葬灶泽蚤藻灶贼 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 郧澡月陨鄄员粤 葬灶凿 郧澡月陨鄄员月 责则燥皂燥贼藻则泽
猿摇 讨论
月陨鄄员 是一类广泛存在于动尧植物体内的细胞凋亡
抑制因子袁在植物中过表达 月陨鄄员 基因能够提高植物抵
御病原体侵害和抗非生物胁迫的能力遥 西红柿感染黄
瓜花叶病病毒尧匀圆韵圆及其他化合物累积诱导的细胞凋
亡均导致 月陨鄄员 基因的高表达袁特别是在感染或损伤部
位咱猿缘暂 曰运葬憎葬蚤鄄再葬皂葬凿葬 等咱猿远暂 证明在拟南芥中过表达
月葬曾出现的细胞凋亡症状袁可以通过转入 粤贼月陨鄄员 基因
得到改善袁这种转基因拟南芥可以正常生长曰宰葬贼葬灶葬遭藻
和 蕴葬皂咱猿苑暂通过拟南芥的突变体证明了 月陨鄄员 是细胞凋
亡的衰减器曰陨泽遭葬贼 等咱猿愿暂将辣椒的 悦葬月陨鄄员 基因转入烟
草后袁转基因烟草对高温尧干旱尧高盐等非生物胁迫耐
受性提高遥 本课题在前期研究中从棉花基因组中克隆
得到了 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月 两个基因袁实时定量 孕悦砸
分析表明袁郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 在生物和非生物胁迫
后表达量均上调袁且 郧澡月陨鄄员粤 在衣霉素处理的内质网
胁迫下优势表达袁而 郧澡月陨鄄员月 则在接种黄萎病菌后表
达量显著上调袁说明棉花 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 基因受
生物和非生物胁迫信号诱导而高效表达袁且两个基因
在应答不同的胁迫信号时存在差异咱员愿暂 遥
诱导型启动子由于能够适时地启动基因的高效表
达袁因此在植物抗逆基因工程育种中有着广阔的应用
前景遥 近年来袁为了更好地利用基因工程进行植物抗
病抗逆改良袁研究人员高度重视从植物本身克隆内源
性诱导型启动子袁以更好地调控植物基因的表达咱猿怨暂 遥
拟南芥 则凿圆怨粤基因受高盐尧干旱及低温胁迫诱导袁利用
则凿圆怨粤启动子驱动抗逆相关基因的表达提高抗逆性已
在土豆尧小麦尧大豆等作物中得到验证咱圆 原 怨暂 遥 研究表
明袁许多抗逆基因能够同时被多种胁迫信号诱导表达袁
是因为这些基因的启动子序列中存在一些与逆境诱导
相关尧参与基因转录调控的顺式作用元件咱圆源暂 遥 为了更
深入了解棉花 郧澡月陨鄄员粤和 郧澡月陨鄄员月基因应答不同胁迫
信号的分子机制袁克隆得到了棉花 郧澡月陨鄄员 两条基因的
启动子序列袁序列分析发现袁两个启动子均存在
栽粤栽粤尧悦粤粤栽基本的元件袁还有热激响应元件渊匀杂耘冤尧
脱落酸响应元件渊粤月砸耘冤和干旱响应元件渊酝月杂冤等与
诱导相关的作用元件袁从启动子结构上进一步解释了
圆 个基因受胁迫信号诱导后表达量上调的原因遥 此
外袁两启动子的调控元件也存在明显差异袁郧澡月陨鄄员粤 启
动子中含有厌氧响应元件渊粤砸耘冤尧机械损伤响应元件
渊栽郧粤悦郧鄄皂燥贼蚤枣冤袁抵御压力的响应元件渊 栽悦鄄则蚤糟澡冤袁而
郧澡月陨鄄员月基因的启动子中含有真菌诱导响应元件
渊月燥曾鄄宰员冤尧低温响应元件渊 蕴栽砸冤尧水杨酸响应元件
渊栽悦粤鄄藻造藻皂藻灶贼冤袁这些调控元件的差异说明棉花 郧澡月陨鄄
员粤和 郧澡月陨鄄员月 基因的启动子虽然能同时受生物和非
生物胁迫所诱导袁但在应答不同的胁迫信号时功能上
有分化袁这与 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 基因在受衣霉素和
黄萎病菌诱导后的差异表达结果相符合遥
棉花遗传转化技术虽已日臻成熟袁但获得转基因
材料仍需较长的周期遥 为了验证克隆得到的启动子序
列是否具有活性袁本研究将 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 的启
动子序列与 郧哉杂报告基因融合构建表达载体袁在烟草
中进行瞬时表达遥 结果表明克隆得到的 圆 个启动子均
能驱动 郧哉杂基因的表达袁为下一步研究两启动子的诱
导活性并应用于棉花的抗逆基因工程奠定了基础遥
源摇 结论
本研究从陆地棉渊郧援 澡蚤则泽怎贼怎皂 蕴援 冤基因组中克隆
得到了 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 基因的启动子序列袁两条
启动子序列中均存在多个与植物非生物胁迫相关的响
应元件袁郧澡月陨鄄员月启动子中还存在真菌诱导应答元件遥
利用 郧澡月陨鄄员粤 和 郧澡月陨鄄员月 基因启动子序列与 郧哉杂 报
告基因融合袁构建植物表达载体并在烟草中进行瞬时
猿愿圆
核摇 农摇 学摇 报 圆苑 卷
表达袁结果表明袁克隆得到的两条启动子序列均具有启
动子活性遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 万小荣袁莫爱琼袁刘 帅袁梁建华袁李 玲袁余土元袁郑奕雄援 粤油 苑
号花生 粤澡晕悦耘阅员 基因启动子克隆及其活性分析咱允暂 援核农学报袁
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咱员员暂摇 李晓荣袁王冬梅袁李建平袁李 静袁张帅袁陈国华袁黄乐平援 小麦
宰糟燥则苑员怨 基因的原核表达及转化烟草和棉花提高抗冷性研究
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咱员圆暂摇 李 蒙袁刘珊珊袁李 钰援 月陨 原 员 基因的功能研究进展咱 允暂 援 国外医
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咱员缘暂 摇 张美红袁周克元援 进化中保守的凋亡抑制因子 月葬曾 蚤灶澡蚤遭蚤贼燥则 原 员
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咱圆园暂摇 朱海生袁潘东明袁林义章袁张志忠袁温庆放援 根癌农杆菌介导草莓
遗传转化研究咱允暂 援 核农学报袁圆园园愿袁圆圆渊员冤院猿远 原 源园
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