全 文 ：　核 农 学 报　2010, 24 (1) : 0055～0061
Journal of N uclear Agricu ltura l Sciences
文章编号 : 100028551 (2010) 0120055207
紫花苜蓿转基因研究进展
郭慧琴 1 　任卫波 2 　徐　柱 2 　王　蜜 1 　陈立波 2
(1. 内蒙古农业大学生物工程学院 ,内蒙古 呼和浩特　010018; 2. 中国农业科学院草原研究所 ,内蒙古 呼和浩特　010010)
摘　要 :结合近 20年来国内外紫花苜蓿转基因研究动态 ,从紫花苜蓿再生体系、遗传转化、性状改良等多
方面阐述了紫花苜蓿在抗逆、抗生物胁迫、改良饲草品质及疫苗生产等方面的研究进展 ,尤其对目前存
在的诸如转基因遗传稳定性、转基因安全性等问题进行了探讨分析 ,并对今后的发展方向提出了建议。
关键词 :紫花苜蓿 ;转基因 ;性状改良
PRO GRESS O N RESEARCHES O F TRANSGEN IC AL FAL FA
GUO Hui2qin1 　REN W ei2bo2 　XU Zhu2 　WANG M i1 　CHEN L i2bo2
(1. Institu te of B ioengineer Science, InnerM ongolia A gricu ltural U niversity, Huhhot, InnerM ongolia　010018;
2. Grassland Research Institu te, Chinese A cadem y of Agriculture Science, Huhhot, Inner m ongolia　010010)
Abstract: In this paper, the p rogress on the researches of transgenic alfalfa in the past two decades had been reviewed in
the aspects of regeneration system, transformation, imp rovement of the important traits and so on. Moreover, such
p roblem s as variation of transgene exp ression and safety of transgenic p lant had also been discussed and p ropose had
been given for the future research work.
Key words: alfalfa; transgene; trait imp rovement
收稿日期 : 2009205208　接受日期 : 2009207222
基金项目 :“十一五”国家科技支撑计划重点项目 (2008BADB3B04) ,中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金 (中国农业科学院草原研
究所 ) (200721202)
作者简介 :郭慧琴 (19792) ,女 ,内蒙古呼和浩特人 ,讲师 ,主要研究方向动植物基因工程。
通讯作者 :任卫波 (19792) ,男 ,山西晋城人 ,助理研究员 ,苜蓿育种与分子生物学。E2mail: rppcaucau@163. com
　　紫花苜蓿 (M adicago sa tiva L1)是重要的豆科多年
生草本植物 ,已有两千多年的栽培历史。目前全世界
苜蓿种植面积达 3000万 hm2 ,我国种植面积约为 280
万 hm2。因其具有营养丰富 ,品质好 ,蛋白质含量高
(占其干重的 17% ～20% )、能生物固氮等优点 ,被誉
为牧草之王。优良品种是苜蓿优质饲草高产的重要基
础。长期以来 ,各国科学家通过自然选择、杂交、回交
等传统育种技术 ,育成了很多优良品种 ,推动了苜蓿商
品化生产。然而 ,传统育种存在周期长、易受田间环境
影响、对种质资源依赖程度高等缺点 ,制约了苜蓿育种
工作的发展。目前我国审定注册的苜蓿品种仅 37个 ,
远远不能满足生产的需要 [ 1 ]。随着植物基因工程的
发展 ,转基因技术为苜蓿育种开辟了一条新的途径。
从 1986年首例苜蓿转基因成功以来 [ 2 ] ,苜蓿转基因技
术日益成熟。尤其是近些年来 ,苜蓿转基因研究呈愈
来愈热的趋势。
1　苜蓿再生体系
紫花苜蓿再生体系是苜蓿转基因的重要前提与基
础。该体系主要是通过器官形成与体胚愈伤组织发育
2 个途径 , 最终分化形成完整植株 [ 3 ]。 1972 年 ,
Saunders等首次利用子叶愈伤组织分化再生植株获得
成功 ,标志着苜蓿组培研究的开端 [ 4 ]。随后国内外学
者在基因型、外植体选择、培养基等方面进行了大量的
探索研究 ,使苜蓿再生体系方法日趋成熟。
111　基因型
基因型是对苜蓿再生能力影响最大的因素。李聪
等对 22个国内外不同基因型的紫花苜蓿做了再生性
试验 ,结果表明 ,不同基因型的苜蓿在苗的分化能力上
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核　农　学　报 24卷
存在较大的差异 ,其中武功苜蓿、和田苜蓿、拉达克苜
蓿、保定苜蓿和运城苜蓿是出愈率和分化率较高的品
种 [ 5 ]。Reisch等研究发现 ,苜蓿愈伤组织的植株再生
能力是高度遗传的 ,可以通过轮回选择的方法进一步
提高 [ 6 ]。
112　外植体类型
外植体是指从植物上分离出来用于培养的细胞、
组织或器官。研究表明 ,叶片、子叶、胚轴、根等 ,多种
外植体都可以通过组培技术得到再生植株 ,但分化率
因外植体不同有显著差异 [ 7 ]。目前 ,可用于再生的外
植体有子叶、下胚轴、根、叶片、叶柄、花粉等。因出愈
率最高 ,分化速度快等优点 ,子叶与下胚轴应用最为广
泛 ,其中下胚轴被普遍认为是首选材料。另外也有利
用原生质体为材料成功培养出体胚的报道 [ 8 ]。
113　培养基及其激素
培养基类型因组培组织和器官而异。一般来说 ,
外植体直接分化植株采用 MS或 SH培养基 ,利用愈伤
组织或胚状体分化成苗采用 MS或 B5培养基 ,花药、
花粉培养则采用 N6培养基。原生质体培养采用 UM
和 MS培养基。另外培养基中激素种类及其配比对再
生体系的建立有着重要影响。常用的激素分为 2类 ,
即植物细胞生长素类 (包括 2, 42D、NAA和 IAA )和细
胞分裂素类 ( KT、62BA等 )。另外还可能会用到 ABA
和 GA3 (赤霉素 )等。
尽管紫花苜蓿再生体系已趋于成熟 ,但是尚存在
转化效率不稳定、转化时间长、转化条件可重复性差等
问题 ,有待进一步解决。
2　转化方法
苜蓿遗传转化的方法主要包括 2类 ,即农杆菌介
导的遗传转化与 DNA直接转化法 (包括基因枪法、离
子注入法等 [ 9～11 ] )。这 2类方法在转化条件、转化成
本、转化效率等方面都有显著差异。相对来说农杆菌
介导的遗传转化在转化成本和效率上有一定优势 ,因
此在苜蓿转基因中得到广泛应用。
211　农杆菌介导遗传转化
1977年 , Chilton等研究发现根癌农杆菌 Ti质粒
能将某一片断的 DNA整合进植物基因组 ,并能得到高
效表达 ,这个 DNA片断被称为 T2DNA。农杆菌介导转
化的原理在于用外源基因替换掉 Ti质粒 T2DNA部分
片断 ,利用 Ti质粒的特性 ,将外源基因整合进植物核
基因组 ,并进行高效表达。根癌农杆菌转化法是目前
研究最多、技术最为成熟的苜蓿转化途径。根癌农杆
菌根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱种类不同可分为
3 种 类 型 , 即 胭 脂 碱 型 ( Nopaline )、章 鱼 碱 型
(Octop ine)及琥珀碱型 ( Succinamop ine)。胭脂碱型如
C58、A208SE、pGV3850; 章 鱼 碱 型 如 LBA4404、
GV2260、GV3111SE、K61 等 ; 琥 珀 碱 型 如 A281、
EHA101、EHA105等。目前在苜蓿的转基因工程中 ,
使用频率最高的为章鱼碱型的 LBA4404,其次为琥珀
碱型的 EHA105。
212　DNA直接转化法
DNA直接转化法是通过物理或化学方法直接将
外源基因导入原生质体 ,由此获得转基因植株的方法。
其主要包括粒子注入、电击、基因枪等方法。直接转化
法不需要组织培养和再生体系 ,转化时间较快 ,早期在
单子叶植物的转化和部分农杆菌侵染较困难的基因型
苜蓿转化中应用较为广泛。但由于存在转入的基因拷
贝数随机性高 ,外源基因沉默率高 ,加之农杆菌侵染技
术的进一步发展 , DNA直接转化法应用越来越少。
3　外源基因修饰及其高效表达
外源基因在成功整合进苜蓿基因组后 ,存在基因
沉默、表达量低、表达效果不理想等问题 ,严重影响了
转基因植株育种利用价值。因此 ,如何提高外源基因
的表达水平将成为苜蓿转基因关注的新热点。产生基
因表达差异的原因主要有基因插入位点差异、基因拷
贝数量差异和受体材料的 RNA沉默。
311　整合位点
基因导入到植物细胞后 ,通过重组过程整合到植
物核基因组中。一般认为 ,导入植物细胞中的外源基
因在寄主染色体内的整合位点是随机的 ,外源 DNA可
以插入植物基因组的任何一条染色体 ,也可以插入一
条染色体上的任何位点或者没有固定的插入位点。
Maqbool等用 PCR和 Southern印迹杂交方法来研究共
转化的 4个转基因在水稻染色体组上的整合情况 ,结
果表明外源基因的整合位点是随机的。在测试的 4个
转基因中 ,每一个都有一系列独特的、复杂的杂交
带 [ 12 ]。
外源 DNA整合有上述随机性的一面 ,同时也有规
律性的表现。外源 DNA的整合较多发生在转录活跃
区域、DNA同源序列区、植物 DNA的高度重复序列区
等。最近的研究表明 , T2DNA时常在相同遗传位点进
行整合 ,表现为用同一转化方法获得的各自独立的转
化体中 ,众多独立的整合同时出现在紧密连锁的某一
区域。
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　1期 紫花苜蓿转基因研究进展
312　整合拷贝数
外源 DNA的插入拷贝数有以下几种 :单拷贝单位
点插入 ,串联多拷贝单位点插入 ,多拷贝多位点插入。
在多数情况下外源基因是以单拷贝在单位点整合 ,但
在同一位点 ,也存在较多的多个拷贝串联整合的现象 ,
形式主要有头对尾式串联和头对头式串联。多拷贝多
位点插入的现象也普遍存在 ,这一现象也是造成基因
沉默的主要原因之一。Akama等在用农杆菌转化的拟
南芥上发现 ,对 124株独立转化植株进行基因组杂交 ,
结果发现单拷贝单位点插入占 44% , 2个位点的多拷
贝插入占 28% , 3个位点的插入占 10%。有 1株为 4
个拷贝 [ 13 ]。整合位点拷贝数主要受转化方法 (农杆菌
介导转化或直接转化 )、农杆菌菌株、受体植物类型及
基因型受体植物的外植体类型等因素影响。
另外 ,启动子对转基因的整合拷贝数也有一定影
响。Sugita等 [ 14, 15 ]在 1999年和 2000年分别报道的 2
次试验中 ,发现在 CaMV35S启动子驱动下的无标记基
因的转基因植株中 ,整合进多个拷贝的转基因 ,而在
GST211227驱动下 ,只整合进 1～2个拷贝的转基因 ,
分析其原因 ,可能是强启动子 CaMV35S强烈地表达了
R重组酶 ,使得 T2DNA插入的拷贝数升高所致。
313　基因修饰
目前基因修饰主要包括非必须区段的缺失处理和
采用 5’2UTR (非编码区 )与 3’2UTR (非编码区 )序列 2
种措施。
31311　对非必须区段进行缺失处理 　Vaeck等用全
长的 C ryIA ( a)和前端缺失的 CryIA ( b)基因同时转化
烟草 ,结果表明 ,前端缺失、只具有编码毒性蛋白区域
的基因更利于抗虫基因的表达 [ 16 ]。
31312　采用 5’2UTR (非编码区 )和 3’2UTR (非编码
区 )序列 　在外源基因两侧插入 5’2UTR (非编码区 )
和 3’2UTR (非编码区 )序列能有效促进外源基因在转
基因植物中的表达。 Sandhu等发现 ,在 CaMV35S启
动子与 RSV F蛋白基因间插入 5’2UTR序列 ,可使蛋
白表达量增加 515倍 [ 17 ]。Rose等认为其机理可能是 :
115’2UTR序列存在直接通过稳定的二级结构或保护
RNA结合因子结合 ,使新转录的 mRNA稳定 ; 21促进
其与其他使 mRNA 稳定的蛋白结合 [ 18 ]。A li等发现
M e1基因 3’2UTR对 GUS基因的表达有显著影响 [ 19 ]。
314　基因改造
目前基因改造的主要方法有以下 3种 : ( 1)密码
子优化 ,即在不改变氨基酸序列的前提下 ,通过人工改
造或重新合成可以大大提高其在植物体的表达量。
Iannacone等将 B tC ry3基因进行改造 ,去除了影响表达
的不稳定元件 ,选用了植物偏爱的密码子 ,极大地提高
了毒蛋白的表达水平 ,获得了高抗鞘翅目甲虫的茄
子 [ 20 ]。董江丽将人 A组轮状病毒 V P6进行密码子优
化和全人工合成 ,合成后的基因 sVP6在转基因烟草
中的表达量比未优化 V P6增加 318～34倍 [ 21 ]。 ( 2 )
改进启动子 ,加入带有 SV40复制增强子区的 355启
动子或重复的强化表达区。Perlak等发现改建后的载
体表达量比原先提高了 5～10倍 [ 22 ]。 (3)核基质结合
序列 (MAR s) ,即能与核基质特异结合的 DNA 片断 ,
在外源基因两端加上 MAR s片断 ,能促进该基因在转
基因植株中的高效表达 ,同时最大限度降低基因沉默
的概率 [ 23 ]。A llen等以烟草为材料 ,发现烟草本身的
MAR s能使外源基因的平均表达水平提高 60倍 [ 24 ]。
4　改良目标性状
411　品质改良
目前苜蓿品质改良主要集中在通过降低木质素、
提高单宁和含硫氨基酸含量等途径 ,来达到提高苜蓿
饲草品质的目的。
降低苜蓿木质素含量有助于提高牧草消化率 ,提
高其营养价值。因此降低木质素成为转基因苜蓿品质
育种的热点之一。植物的木质素有 2种单体 , G单体
和 S单体。Baucher等将苯丙烯乙醇脱氢酶 (CAD )转
入苜蓿 ,转基因苜蓿木质素总量虽未发生变化 ,但 S单
体的量显著降低 ,从而导致牧草消化率有所提高 [ 25 ]。
Guo等将咖啡酸 32氧甲基转移酶基因 COMT转入苜
蓿 ,使转基因植株的木质素含量显著降低 [ 26 ]。萨如拉
等利用基因枪法将 42香豆酸辅酶 A链接酶 (4CL)基因
导入紫花苜蓿品种三得利 ,成功获得转基因植株。
Jackson等将反义基因导入紫花苜蓿 ,通过降低木质素
单体合成途径的 2 个终端酶 CCR ( cinnamoyl CoA
reductase)与 CAD ( cinnamyl alcohol dehydrogenase)的
活性 ,显著降低了叶片中木质素含量 ,提高了干物质消
化率 [ 27 ]。
紫花苜蓿虽然是优质豆科牧草 ,但是单独饲喂鲜
草会导致家畜患臌胀病。臌胀的产生与苜蓿体内单宁
含量过低有关。Gruber等将玉米 L c基因 (与花青素类
化合物合成相关 ,包括浓缩单宁 )转入紫花苜蓿 ,转基
因苜蓿叶片和茎杆的花青素含量有所提高 [ 28 ]。尽管
已有将参与单宁合成的基因转入紫花苜蓿的尝试 ,但
到目前为止 ,尚无抗臌胀的转基因苜蓿品种推出。
苜蓿中蛋白质含量高 ,但是其含硫氨基酸含量低 ,
含硫氨基酸能提高羊毛产量和增加牲畜重量的独特作
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核　农　学　报 24卷
用是别的氨基酸不具备的 ,因此提高苜蓿含硫氨基酸
含量成为苜蓿品质改良的另一重点。Tabe等将向日
葵种子清蛋白基因 (SFA8)转入苜蓿 ,转基因植株叶片
含硫氨基酸含量占到叶片可溶性蛋白的 011% [ 29 ]。
Avraham等将拟南芥胱硫酸合成酶基因 (A tCGS )转入
紫花苜蓿 ,转基因植株中游离蛋氨酸及结合型蛋氨酸
含量比野生型分别提高 51倍和 212倍 [ 30 ]。我国吕德
杨等将富硫氨基酸的 HN P基因转入苜蓿 ,尽管转基因
苜蓿的含硫氨基酸含量显著提高 ,但是此类氨基酸的
表达量仍有待提高 [ 31 ]。
412　抗非生物胁迫
提高苜蓿植株抗逆能力 ,培育具有某个或几个抗
逆性的苜蓿品种 ,对扩大苜蓿的种植面积、保障优质饲
草供给具有重要作用。目前转基因苜蓿抗逆性研究主
要包括耐盐性、抗旱性、抗寒性、耐酸耐铝、耐重金属等
5个方面。
41211　耐盐 　近些年来 ,土壤盐碱化已成为制约农业
可持续发展和生态环境恢复的主要问题。苜蓿虽为中
等耐盐植物 ,但在盐胁迫条件下 ,苜蓿的出苗、生长及
饲草产量均受到抑制。为了提高苜蓿耐盐碱能力 ,
W inicov等将盐诱导表达基因 M sPRP2转录因子的编码
基因 A lfin1在苜蓿中过量表达 ,从而提高了 M sPRP2在
苜蓿根茎中的表达量 ,在植株的生长过程中提高其抗盐
性能够加快植株的生长速度 [ 32 ]。我国学者先后将
A tNHX1、M sNHX1、CgNHX1等基因转入紫花苜蓿 ,转基
因植株均表现出不同程度的耐盐性。但有关转基因植
株的田间耐盐表现有待进一步深入研究。
41212　抗寒 　在高纬度寒冷地区 ,低温、干旱等逆境
胁迫导致苜蓿减产 ,甚至不能安全越冬 ,从而影响苜蓿
的分布和生产。因此利用转基因技术提高苜蓿抗寒越
冬能力是十分必要的。Mckersie等将拟南芥的 Fe2
SOD [ 33 ] ,烟草中的 M n2SOD 基因转入紫花苜蓿植株体
内 ,转基因苜蓿植株体内 2种酶的活性显著增强 ,同时
其越冬存活率平均比对照高出 25% ,但是该酶的增强
表达并没有有效降低低温对植株造成的直接伤害 (如
对叶片和须根 ) ,可能是 Fe2SOD的高度表达能减轻由
冻害引起的次级损伤 ,从而间接加强苜蓿的越冬能
力 [ 34 ]。我国学者先后将拟南芥转录因子 DR EB 1C、
DR EB 2A转入我国地方品种保定苜蓿、肇东苜蓿、敖汉
苜蓿和公农 1号 ,进一步提高了苜蓿植株的抗寒能力。
41213　耐旱 　Zhang等将来自截形苜蓿的 W XP1基因
转入紫花苜蓿 ,该基因的高度表达可以提高转基因紫花
苜蓿叶片表皮蜡质物的累积 ,转基因苜蓿叶表皮蜡质物
增加 2916%～3717% ,叶片蜡质物的增加 ,降低了水分
和叶绿素的损失 ,从而提高了抗旱耐寒能力 [ 35 ]。
41214　耐酸耐铝 　目前苜蓿的主产区主要集中在我
国北方。长江以南的广大区域 ,苜蓿的分布非常少。
其中铝毒害是制约苜蓿南种成败的关键问题。苜蓿对
铝毒性敏感 ,铝能使苜蓿根短小并使产量降低 ,有机酸
的产生与铝耐受性密切相关。我国学者先后将棉花铝
诱导蛋白 GhA lin、镁离子转运蛋白 A tMGT1、苹果酸脱
氢酶、柠檬酸合成酶等基因转入苜蓿 ,使转基因植株体
内的苹果酸、柠檬酸等有机酸浓度提高了 412倍 ,植株
对铝和酸性土壤的耐受性得到显著提高 [ 36, 37 ]。Barone
等将铜绿假单胞菌 ( Pseudom onas aerug inosa)的柠檬酸
合成酶基因转入苜蓿 ,结果表明转基因苜蓿比对照有
更好的铝耐受性 [ 38 ]。
41215　耐重金属 　利用苜蓿再生性好 ,地上生物量大
等特性 ,任小换等将重金属富集基因 A tPCS1转入苜
蓿 [ 39 ] ,从而提高苜蓿对含高浓度重金属土壤的耐受
性 ,并通过植物富集作用 ,来降低或清除土壤中的重金
属污染。
413　抗生物胁迫
迄今发现并应用于提高植物抗虫性的基因主要有
3类 :一类是从微生物中分离出来的抗虫基因 ,如苏云
金芽孢杆菌毒蛋白基因 (B t基因 )、异戊基转移酶基因
( IPT) ;二是从植物中分离出来的抗虫基因 ,如蛋白酶
抑制剂基因 ( P I基因 )、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集
素基因等 ;三是来源于动物毒素基因 ,如蝎毒基因。
(1) B t基因编码具有高度特异性杀虫活性的结晶
蛋白 (Cry) ,它使鳞翅类昆虫消化道损失 ,引起昆虫停
止进食最终死亡 [ 40 ]。熊恒硕等将含有 CryIA ( a ) /
CryIA ( c)、半夏凝集素 (p ta)的双价抗虫载体转入紫花
苜蓿品种中苜 1号 ,以期获得兼抗同翅目及鳞翅目害
虫的新种质。目前已初步获得阳性转化植株 ,有关抗
虫性的鉴定正在进行 [ 41 ]。
(2)蛋白酶抑制剂 ( Protease inhibitor)分为 4种 ,
即丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白
酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂 ,其中丝氨酸蛋白酶抑
制剂的抗虫效果较好。在丝氨酸蛋白酶抑制剂中 ,豇
豆胰蛋白酶抑制剂 ( cow peatryp sin inhibtor, CpTI)和番
茄蛋白酶抑制剂 ( Tomato p roteinase inhibitor, TI)应用
较为广泛 ,对鳞翅目、双翅目、直翅目的多种昆虫均有
很好的效果。Thomas等将 M anduca sex ta Pl基因导入
苜蓿后 ,通过电镜观察发现 ,在转基因植物叶细胞的液
泡中央积累了大量 P I蛋白 ,使得植物对咀嚼式口器昆
虫具有明显的毒杀作用 [ 42 ]。
(3)目前研究较多的几种重要凝集素有 :豌豆外
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　1期 紫花苜蓿转基因研究进展
源凝集素 ( pea2lectin )、麦胚凝集素 ( wheat germ
Agglutinin, W GA )、雪花莲凝集素 ( galanthus nivalis
Agglutinin, GNA )和半夏外源凝集素 ( p inellia ternata
agglutinin, PTA )。我国卢广等将半夏凝集素、雪花凝
集素基因转入紫花苜蓿 ,以提高紫花苜蓿的抗虫
性 [ 43 ]。Yang等将截形苜蓿 RCT1基因转入紫花苜蓿 ,
显著提高了紫花苜蓿对炭疽病的广谱抗性 [ 44 ]。
414　抗除草剂
目前 , 作为抗除草剂广泛使用的是 B ar基因
( bialaphos resistance gene) ,该基因编码 PPT乙酰转移
酶 ( PAT) , PAT催化乙酰辅酶 A的乙酰基转移到 PPT
的氨基上 ,形成乙酰 PPT而使 PPT失活。利用农杆菌
介导法 ,将 2种不同的 chimeric bar基因导入苜蓿 ,田
间试验发现 , 转基因植株对除草剂 g1ufosinate2
ammonium具有明显抗性 ,对照植株喷洒除草剂后均生
长不良 [ 45 ]。
415　生物反应器
近些年来 ,紫花苜蓿作为生物反应器生产酶制剂、
药用蛋白、植物疫苗等方面已取得一定进展。Khoudi
等将人类免疫球蛋白 IgG基因转入紫花苜蓿来生产医
用单克隆抗体 ,结果表明 ,转基因苜蓿中可以合成有活
性的免疫蛋白 ,而且经反复收割和烘干后仍具有稳定
的抗体产量 [ 46 ]。 Santos等将口蹄疫病毒 ( FMDV )的
VP1蛋白的编码基因整合到苜蓿基因组中并使其在苜
蓿体内表达 ,牲畜采食了苜蓿植株后 ,体内产生抗体 ,
从而取得对口蹄疫的免疫能力 [ 47 ]。Purev Saruul等将
来自真养雷氏菌的 PHB 合成酶基因 ( phbA、phbB 和
phbC)转入苜蓿中 ,转基因植株叶片中多羟基丁酸酯
( PHB)含量为 01025～118g/kg。同时转基因植株与
优良苜蓿种质的杂交中获得的 F1 杂种后代展示了与
转基因亲本品系相似的叶 PHB水平 ,证实了苜蓿中的
PHB可以稳定遗传 [ 48 ]。由于多羟基丁酸酯 ( PHB )可
用于生物降解塑料 ,在环境保护方面将有巨大的应用
前景。Raymond等将 gs60542gfp (荧光蛋白 )融合基因
导入紫花苜蓿 Regen SY2,转基因植株能稳定地生产
Gs60抗体 Gs6054 ,将含有该抗体的苜蓿饲喂兔子后 ,
能显著提高兔子对巴氏德杆菌性肺炎 ( pneumonic
pasteurellosis)的免疫力 [ 49 ]。
5　存在的问题及其潜在对策
511　遗传稳定性问题
关于苜蓿的研究多集中在组培体系、载体构建、转
化与再生、目的基因检测及表达效果的初步分析 ,有关
外源基因遗传稳定性的研究相对较少。
转基因苜蓿育种仍然需要以传统方法筛选性状稳
定的后代 ,目前的技术水平下更多是作为传统方法的
补充。但由于紫花苜蓿是同源四倍体 ,异花授粉 ,存在
自交衰退等问题 ,转基因遗传稳定性研究比较困难 ,这
也是多年来转基因苜蓿研究一直停滞在转基因植株的
单株检测而未能走向田间测试和遗传稳定性分析的原
因所在。
512　转基因安全性问题
51211　外源基因产物的安全性 　在植物遗传改良中 ,
有时会使用一些产生生物毒素的基因如 B T、PA 等。
这些基因被家畜摄入后 ,是否会对家畜产生不利影响 ,
或者这些蛋白无法降解 ,残留到畜产品中 ,是否存在食
品安全等问题日益引起人们的关注。例如豌豆清蛋白
前体通过翻译后剪切加工 ,形成 2个成熟的肽链 ,分别
命名为 PA la和 PA lb。其中 PA1b由 37个氨基酸组
成 ,拥有 6个半胱氨酸 ,涉及 3个二硫键。正是这些二
硫键赋予了该毒素的稳定性。即使被煮沸 ,它的生物
活性仍可维持在较高的水平。该蛋白不仅对多种昆虫
具有显著的毒性作用 ,而且对胰岛素降解和反刍动物
瘤胃胃液都有相当的抗性。尽管使用转 BT基因的作
物饲喂家畜 ,到目前为止 ,尚未发现对家畜健康及肉、
奶、蛋等产品产生影响。但是外源基因产物的安全性
问题的解决还有待进一步深入研究。
51212　选择性标记的去除　目前 ,在植物的遗传转化
中通常使用选择标记从非转化细胞中选择转化体 ,这
样可节省大量时间和精力。然而 ,当获得一个真正的
转基因植株后 ,选择标记基因就失去其存在的价值 ,而
且标记基因表达的产物也会带来一些不良后果。因
此 ,转基因植株中选择标记的去除已成为现在研究的
热点 ,并建立了多种消除方法 ,今后应扩大其在植物遗
传转化中的应用。
51213　基因漂移问题 　近几年 ,随着转基因苜蓿的商
业化 ,其对环境及生态安全可能造成的危害尤其是基
因漂移问题受到越来越多的关注。基因漂移是指基因
从转基因作物漂移导致不是所需要的外源基因的传
播。外源基因从转基因苜蓿中流出后可能转入 4种类
型的受体 : (1)田间的非转基因栽培种 ; (2)同种作物
的野生群体 ; (3)同一物种的野生群体 ; (4)近缘杂草
或不同物种中。外源基因从农业环境中漂移并最终导
致生态环境发生变化 ,是一个涉及到多因素的复杂过
程。
要想对这一过程中的每一因素做出明晰的评估显
然是不太可能的。因此 ,早期基因漂移问题的研究目
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核　农　学　报 24卷
标应在于确定特定的转基因苜蓿与潜在受体群体组合
是否会导致生态环境变化。具体可分为 3步 : ( 1)实
验室评价植物与潜在受体群体间是否可形成杂种 ;
(2)评价田间形成杂种的可行性并实际检测出杂种的
存在 ; (3)在一定时空条件下量化自然杂种的形成频
率。
6　结语
在过去的 20多年里 ,苜蓿转基因研究已取得显著
成就 ,利用农杆菌转化紫花苜蓿体系已趋于成熟 ,一大
批优质基因如耐盐、抗旱、抗虫等已被成功导入紫花苜
蓿 ,显著提高了转基因植株的相应性状 ,对苜蓿育种的
发展起了重要的推动作用。
然而 ,与作物基因工程相比 ,苜蓿转基因研究起步
较晚 ,尤其是我国 ,多数研究开始于 2002年以后 ,大多
处于阳性转化植株筛选与初步检测阶段 ,有关转化基
因表达及其对性状的影响相对较少。至今尚无转基因
苜蓿品种推向商品化。因此 ,在今后的工作中 ,应注重
以下几个方面 : (1)继续加强苜蓿优质基因资源的挖
掘与克隆 ,开展苜蓿抗逆、抗病等重要性状的分子生物
学机理研究 ; ( 2)开展影响苜蓿转基因表达水平差异
的分子机理研究和高效通用启动子与特异启动子研
究 ; (3)目前转化方法以农杆菌介导为主 ,但农杆菌介
导转基因存在外源基因沉默、表达量低等问题。因此
今后的工作中可以尝试多转化方法的创新。比如采用
基因枪直接转化结合 MAR s修饰基因方法来降低基因
沉默概率 ; (3) 在注重前期转化工作的同时 ,注重开展
苜蓿转化性状田间评价、遗传稳定性及安全性评估研
究 ,为今后转基因苜蓿的上市推广奠定基础。
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(责任编辑 　王媛媛 )
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