全 文 ：文章编号 :100028551 (2005) 022088204
抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长与分化的影响
吴关庭1 ,2 　胡张华2 　郎春秀2 　陈笑芸2 　金　卫2
王伏林2 　陈锦清2 　夏英武1
(11 浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029 ;
21 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所 ,浙江 杭州　310021)
摘 　要 :研究了两种常用抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长和分化的影响 ,结果表明 ,头孢霉素
明显抑制愈伤组织生长 ,而浓度低于 500mgΠL 的羧苄青霉素能促进愈伤组织生长 ;两种抗生素
对愈伤组织分化均有抑制作用 ,但羧苄青霉素的抑制作用要比头孢霉素小。因此 ,在农杆菌介
导高羊茅遗传转化中 ,抑菌剂以选用羧苄青霉素较为合适。
关键词 :高羊茅 ;胚性愈伤组织 ;生长 ;分化 ;抗生素
THE EFFECTS OF ANTIBIOTICS ON GROWTH AND DIFFERENTIATION
OF EMBRYOGENIC CALLI OF TALL FESCUE
WU Guan2ting1 　HU Zhang2hua2 　LANG Chun2xiu2 　CHEN Xiao2yun2
J IN Wei2 　WANG Fu2lin2 　CHEN Jin2qing2 　XIA Ying2wu1
(11 Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang ,310029 ;
21 Institute of Virology and Biotechnology , Zhejiang Academy of Agricultural Sciences , Hangzhou , Zhejiang ,310021)
Abstract :The effects of two widely used antibiotics on growth and differentiation of embryogenic calli of tall fescue
were investigated. The results showed that callus growth was obviously suppressed by cefotaxime , but stimulated by
carbenicillin at the concentration less than 500mgΠL. Callus differentiation was inhibited by both the antibiotics with
greater inhibition produced by cefotaxime. Therefore , carbenicillin was the preferable choice of the two tested
antibiotics for Agrobacterium tumef aciens2mediated transformation of tall fescue.
Key words :tall fescue ( Festuca arundinacea Schreb. ) ; embryogenic callus ; growth ; differentiation ; antibiotics
收稿日期 :2004210211
作者简介 :吴关庭 (1963 - ) ,男 ,浙江萧山人 ,博士 ,研究员 ,从事植物基因工程研究。陈锦清为通讯作者 ,Email : yznszdz @zaas. org
在植物遗传转化研究中 ,农杆菌介导法以其转化频率高、转基因拷贝数低、导入片段确定性强、能够
转化大片段 DNA、操作简便、费用低廉等一系列优点[1～7 ]而深受植物基因工程研究者的青睐与重视。该
方法与其它转化方法的一个不同之处 ,是筛选转化体时培养基中需添加抗生素以杀灭农杆菌。由于不
同植物对同一抗生素的反应不尽相同 ,同一植物对不同抗生素的反应也存在差异[8 ] ,所以在进行农杆菌
介导转化时 ,研究确定适用抗生素种类及其适宜浓度是十分必要的。高羊茅是一种在世界温带地区广
泛应用的多年生冷季型牧草和草坪草[9 ,10 ] ,近年来农杆菌介导该草种遗传转化已获得初步成功[11 ] ,但其
技术还不够成熟和完善。本研究考察了两种常用抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长和分化的影响 ,旨
在为建立农杆菌介导高羊茅高效遗传转化体系奠定基础。
88　 核 农 学 报　2005 ,19 (2) :88～91Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
1 　材料和方法
111 　材料
供试高羊茅品种为凌志、猎狗 5 号、美洲虎 3 号和可奇思。这些品种的成熟种子由浙江绿洲生态股
份有限公司提供。抗生素羧苄青霉素产于德国 ,头孢霉素为苏州第一制药厂的产品。
112 　方法
4 个供试品种的成熟种子人工去壳 ,经 70 %酒精漂洗 30s 后 ,在 30 %左右的花王漂白水 (2Π3 体积的
无菌水加 1Π3 体积的花王漂白水) 中灭菌 40min ,然后用无菌水漂洗 4～5 遍。灭菌种子逐一纵切 ,接种
于含 2 ,42D 8mgΠL、ABA 2mgΠL、水解酪蛋白和谷氨酰胺各 015gΠL 的 MS 诱导培养基上 ,在 25 ±1 ℃的条件
下暗培养 4 周左右 ,诱导获得初始愈伤组织。将初始愈伤组织转移到含 2 ,42D 2mgΠL、BAP 011mgΠL、水
解酪蛋白和谷氨酰胺各 015gΠL 的 MS 继代培养基上 ,在同样条件下进行继代培养 ,每 3～4 周转继一次 ,
连续转继多次 ,诱导和繁殖足够数量的胚性愈伤组织。
在 MS 继代培养基中添加 0、50、100、200、300、400 和 500mgΠL 头孢霉素与羧苄青霉素。将上述胚性
愈伤组织接种于这些含不同浓度抗生素的培养基上 ,根据接种前后培养基的重量 ,计算出所接种的愈伤
组织重量 W1 (mg) 。愈伤组织在 25 ±1 ℃的条件下暗培养 ,3 周后称重 ,获得愈伤组织重量 W2 (mg) 。由
(W2 - W1 )ΠW1 计算出愈伤组织鲜重的净增倍数 ,并乘上系数 41762 (100Π21)折算成每 100mg 接种愈伤组
织的日增鲜重 (mg) 。试验设 3 次重复。
在分化试验中 ,先将胚性愈伤组织接种于含 BAP 2mgΠL、KT 015mgΠL、NAA 015mgΠL、水解酪蛋白
015gΠL、蔗糖 60gΠL、琼脂 8gΠL 的 MS 分化培养基上进行高渗预分化 ,预分化条件为 28 ±2 ℃,暗培养。约
7～10d 后 ,再挑选乳白色、结构致密、有颗粒状突起的胚性愈伤组织转移到蔗糖浓度为 30gΠL、琼脂浓度
为 10gΠL 并添加有 0、50、100、200、300、400 和 500mgΠL 头孢霉素与羧苄青霉素的 MS 分化培养基上进行
植株再生。每处理接种胚性愈伤组织 50 块左右 ,分化条件为 10h 光照、25 ±1 ℃与 14h 黑暗、21 ±1 ℃交
替 ,光照强度 3000～4000lx。分化开始后 3～4 周 ,调查统计再生愈伤组织数并计算其频率。
2 　结果与分析
211 　抗生素对高羊茅胚性愈伤组织生长的影响
将 4 个供试高羊茅品种的胚性愈伤组织接种于含不同浓度头孢霉素和羧苄青霉素的继代培养基上
进行继代培养 ,结果表明 ,头孢霉素对愈伤组织生长具有抑制作用 ,接种愈伤组织在 3 周内净增鲜重的
倍数和日增鲜重均随头孢霉素浓度的提高而下降 ,4个品种表现一致 (表1) 。羧苄青霉素刚好相反 ,对
表 1 　头孢霉素对高羊茅胚性愈伤组织生长的影响
Table 1 　Effects of cefotaxime on growth of embryogenic calli of tall fescue
品种
cultivar
项目
item
头孢霉素 cefotaxime (mgΠL)
0 50 100 200 300 400 500
凌志
Barlexas
猎狗 5 号
Houndog 5
美洲虎 3 号
Jaguar 3
可奇思
Cochise
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 5196 5178 5142 5117 4174 4135 3181
日增鲜重 DIFW (mg) 2814 2715 2518 2416 2216 2017 1811
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 6153 6118 5190 5165 5136 5107 4172
日增鲜重 DIFW (mg) 3111 2914 2811 2619 2515 2411 2215
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 4162 4153 4138 4114 4100 3179 3161
日增鲜重 DIFW (mg) 2210 2116 2019 1917 1910 1810 1712
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 5148 5126 4188 4119 3195 3144 3108
日增鲜重 DIFW (mg) 2611 2510 2312 2010 1818 1614 1417
注 :表中数据系 3 次重复的平均值 ;净增鲜重 (倍)表示接种 21d 后愈伤组织鲜重的净增倍数 ;日增鲜重指每 100mg 接种愈伤组织的日增
鲜重。下表同。
Note : Each value is the average of three replicates ; NIFW indicates net increment in fresh weight of inoculated calli after 21 days ; DIFW refers to daily
increment in fresh weight of 100mg inoculated calli . The same as the following tables.
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4 个供试品种的愈伤组织生长都有促进作用 ,当其浓度为 100～300mgΠL 时 ,愈伤组织重量的增幅较大 ,
增幅最大的浓度则因品种而异 ,浓度超过 300mgΠL 后 ,对愈伤组织生长的促进作用逐渐减弱 (表 2) 。
表 2 　羧苄青霉素对高羊茅胚性愈伤组织生长的影响
Table 2 　Effects of carbenicillin on growth of embryogenic calli of tall fescue
品种
cultivar
项目
item
羧苄青霉素 carbenicillin (mgΠL)
0 50 100 200 300 400 500
凌志
Barlexas
猎狗 5 号
Houndog 5
美洲虎 3 号
Jaguar 3
可奇思
Cochise
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 5175 6148 7169 7156 6181 6137 5194
日增鲜重 DIFW (mg) 2714 3019 3616 3610 3214 3013 2813
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 6114 6157 7143 8150 8131 6197 6127
日增鲜重 DIFW (mg) 2912 3113 3514 4015 3916 3312 2919
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 4131 4163 5116 5108 5139 4195 4138
日增鲜重 DIFW (mg) 2015 2210 2416 2412 2517 2316 2019
净增鲜重 (倍) NIFW (fold) 5152 6136 7164 8117 7139 6152 5183
日增鲜重 DIFW (mg) 2613 3013 3614 3819 3512 3110 2718
212 　抗生素对高羊茅胚性愈伤组织分化的影响
在分化培养基中添加头孢霉素和羧苄青霉素 ,对 4 个供试品种的胚性愈伤组织分化都表现出明显
的抑制作用 (表 3) 。随着两种抗生素浓度的提高 ,愈伤组织再生频率逐渐降低 ,许多愈伤组织只能生根
而不能长芽。当头孢霉素浓度达到 400mgΠL、羧苄青霉素浓度达到 500mgΠL 时 ,凌志和可奇思的胚性愈
伤组织已完全不能分化 ,猎狗 5 号和美洲虎 3 号还有少量愈伤组织能够再生。这说明 ,两种抗生素对高
羊茅胚性愈伤组织分化的抑制作用有一定差异 ,以头孢霉素的抑制作用较强 ,而在同一抗生素浓度下 ,
品种之间愈伤组织分化受抑制的程度亦有所不同。
3 　讨论
表 3 　抗生素对高羊茅胚性愈伤组织再生频率的影响
Table 3 　Effects of antibiotics on regeneration frequency of
embryogenic calli of tall fescue ( %)
抗生素
antibiotics
浓度
concentration
(mgΠL) 品种 cultivar凌志Barlexas 猎狗 5 号Houndog 5 美洲虎 3 号Jaguar 3 可奇思Cochise
头孢霉素
cefotaxime
羧苄青霉素
carbenicillin
0 6417 8018 5410 6215
50 5310 6610 5119 5410
100 4610 5712 4311 3313
200 2519 4112 3016 1819
300 914 2510 1210 611
400 0 210 412 0
500 0 0 0 0
0 7016 7510 5010 6713
50 6616 6410 4810 4910
100 5810 6112 4413 3810
200 4811 4510 3712 3018
300 3210 2416 3211 1610
400 811 1717 2113 716
500 0 413 613 0
　注 :胚性愈伤组织再生频率 ( %) = (再生愈伤组织数Π接种愈伤组织数) ×100 %。
Note : Regeneration frequency of embryogenic calli ( %) = No. of regenerated calli ΠNo. of
inoculated calli ×100 %.
　　在农杆菌介导植物遗传转化
中 ,外植体与农杆菌共培养后 ,尽管
经过清洗 ,其表面及浅层组织中仍
会附着或共生有一些农杆菌。为抑
制这些农杆菌的继续繁殖 ,以便使
受体细胞能正常生长 ,必须在培养
基中加入抗生素。但抗生素在对农
杆菌生长起抑制作用的同时 ,也会
对植物受体材料的生长和分化产生
影响 ,因此针对新的受体植物和材
料 ,很有必要进行适用抗生素的筛
选 ,找出抑菌效果好而对受体材料
生长与分化的影响最小的抗生素并
确定其适宜浓度。头孢霉素和羧苄
青霉素是农杆菌介导植物遗传转化
研究中两种常用的抗生素 ,本研究
结果表明 ,头孢霉素对高羊茅胚性
愈伤组织的生长和分化都有明显的
抑制作用 ,而浓度在 500mgΠL 以下
的羧苄青霉素对高羊茅胚性愈伤组织生长具有促进作用。虽然它也会抑制愈伤组织的分化 ,但抑制作
用比头孢霉素要小。所以 ,在农杆菌介导高羊茅遗传转化中 ,宜选用羧苄青霉素作为抑菌剂 ,其适宜浓
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度应为能阻止农杆菌复发的最低浓度 ,根据笔者实验室的实践经验 ,该浓度在 250～300mgΠL 左右。
致谢 :本研究由浙江绿洲生态股份有限公司资助。
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核农学会‘十一五’发展战略研讨会
暨《核农学报》编委会召开
　　由中国原子能农学会牵头 ,安徽省农业科学院协办的“核农学会‘十一五’发展战略研讨会暨《核农
学报》编委会”于 2005 年 4 月 7 日至 9 日在安徽省合肥市举行。为继续巩固和推动核农学的发展进步 ,
根据我会与科技部高新技术司、中国同位素与辐射行业协会的信息沟通情况 ,本次会议重点研讨了“十
一五”期间 ,我国核农学领域科技创新的主要任务、目标、和思路。参加的有关单位领导结合调研工作 ,
做了口头和书面报告 ,各专业委员会在充分讨论的基础上 ,汇总各领域的内容并定稿。
“研讨会”之后 ,4 月 9 日召开了《核农学报》编委会 ,与会编委讨论了在目前情况下 ,从稿源、审稿和
编辑加工等方面提高稿件质量 ,从而提高学报的水平 ,并讨论了扩大发行和增加消息类内容等问题。
19Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2005 ,19 (2) :88～91
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