全 文 ：锦橙及山金柑胚性愈伤组织的
诱导和原生质体再生植株
邓秀新 邓 占鳌 章文才
哗中农业大学柑桔研究室 )
研究报告
提要 锦橙及山金柑胚性愈伤组织分别从花后 2一 8周的珠心组织和成熟种子试
管实生苗诱导产生 。 经继代选择得到 “ 适应 ” 型 。 这种愈伤组织经 0 .3 %的果胶酶
和 0 .3 %的纤维素酶处理 1 6小时 , 分离出原生质体 。 原生质体培养在无激素 M T 培
养基中 , 4 天时出现第 l 次细胞分裂 。 6 一B A 5 P m 有利 于原生质体恢复分裂 ,
但不利 于以后的分化 。 培养 15 一 20 天 时 , 转入摇床中培养 , 2 个月时再生 出胚状体 。
硫酸腺漂吟有助于胚状体的转绿和进一步发育 。 成 熟的子叶期胚状体转入加有赤霉
素和硫酸腺漂吟的培养基中 1 个月 , 再生出完整的植株 。 再生植株经锻炼后移入土
壤中 , 成活率达 90 % 。 时再生植株及胚状体检查 , 没有发现有染色体数 目变异 。
材料与方法
采用我国四川 、 湖J『 J 泛栽培的优良甜
橙品种锦橙 ( C i t r u s s i n e n s i s 侥比 e k )
为主要试材 , 同时也采用了我国原产的野生
矮化种山金柑 (凡 r ut n e z la 人i n d : 1 s -w
i n g l e )
。
锦橙开花后 6 一 8 周时取出其胚珠 , 接
种于 M T 培养基中 , 以诱导出胚性愈伤组织。
山金柑的成熟种子经表面消毒后 , 播种于上
述培养基中, 对不同来源和不同年份的种子
进行了对比。 播种后 50 天可从实生苗下胚轴
直接产生胚性愈伤组织 。
将胚性愈伤组织在摇床上悬浮培养 1周 ,
然后将培养物经 1 14 微米孔径的筛网过滤 ,
离心收集小细胞团 , 加入酶液 , 酶液组成与
以前相同。 静放 16小时后 , 经 3 0微米孔径的
尼龙网过滤 , 得到原生质体悬浮液 。 离心洗
涤之后 , 浅层培养在彭圣5厘米培养皿中 , 同
时也做了固体植板培养。 培养密度为 5 x 10 4 一
1 x 10 5
, 最后用 p a r a if l m 封口 , 置于 2 8 士
0
.
5℃ 、光照 150 o L x 的培养箱中。 培养基为
M T 基本培养基加入 0 . 65 M蔗糖 。 培养 l 周
时 , 加入新鲜培养基 , 降低渗透压 20 % , 随
后 , 再降 2 次。 原生质体分裂形成小细胞团
时 ( 20 天左右 ) 转入摇床上培养 , 转速为
10 0 『/ m i n
。 小细胞团再生出球形和心形期
胚状体时 , 培养基加入硫酸腺嗓吟 5 P m ,
使胚状体转绿和进一步发育。 最后 , 将发育
正常的子叶期胚状体转入到加有赤霉素
( G A ) 1 P m 及硫酸腺嗓吟 s p卿的固体
培养基中萌发成植株。
原生质体再生植株首先移在培养钵中 ,
置于 20 ℃ 、 光照 2 5 0 0 L x 的培养箱中 , 每 2
天浇 1 次M T 大量元素 , 并用烧杯罩上。 巧
天后再植入露地。
原生质体活性测定采用荧光方法 。 染色
体观察方法与以前报道的相同 , 观察 巧。 个
锦橙原生质体再生的胚状体和 7 棵植株 , 每
中国农学通报 3 / 19 89 · 13 ·
个体至少观察5 个中期可计数的细胞。
结果与分析
锦橙花后7 周 , 在解剖镜下观察不到有
胚的存在 , 珠心组织十分发达 , 接种后 2吠 ,就可从胚珠表面再生出愈伤组织或胚状体 ,
这类愈伤组织具有胚胎发生能力 。 胚状体如
继续停留在无激素培养基中 , 则可生出新的
胚状体或愈伤组织 。
山金柑试管苗生长到 50 天时 , 从下胚轴
直接产生胚性愈伤组织 , 发生位置平均为子
叶下 4 . 59 毫米处 。 极少数在离子叶 2厘米处
的根上也产生愈伤组织。 也观察到从种皮上
以及子叶上产生愈伤组织的现象。 这类愈伤
组织随进一步培养 , 将不断增殖和分化出胚
状体。
不同处理对山金柑 (大田 栽培树 )
实生苗产生愈伤组织的影响 ( 198 6)
处 理 苗数 产生愈伤组织的苗的频率 ( % )
M T 加 ( P P m )
l{ 口 8 0天 10 0 天
5 0天 } 6 5天
}一
G A 3
.
0 12 8 0 0 0 14
。
6
K T 1
.
0 16 5 9
。
7 19
。
5 19
。
5 19
。
5
硫酸腺嗦吟 14 7 3。 4 13 . 0 16 。 4 16 . 4
无 激 素 14 5 4 。 8 1 2 。 2 16 。 7 16 . 7
总计平均 58 5 4 . 8 11 。 8 13 。 8 17 . 0
从上表看出 . 培养 50 天后的 l 个月内 ,
除G A 处理外 , 随培养时间增长 , 产生胚性
愈伤组织的苗的比例不断增加 , 当达到一定
值后 , 不再增加 。 G A 处理推迟了这一现象
的发生达 50天 , 这与施用 G A 后 , 幼苗变得
纤细有关 , 当幼苗逐渐充实后 , 这一现象才
出现 。 K T ( 6 se 一糖基嚓吟 ) 则相反 , 促进
了这一现象的较早发生。 各处理最终的频率
无显著差异 , 平均为 17 . 0% 。 这说明山金柑
实生苗本身就具有产生胚性愈伤组织的能力 ,
·
1 4
·
C h i n e s e A g r i e “ l t u r a l S e i e n e e
不需外源激素的诱导也可表现出来 。
不同年份的试验表明 , 这一结果能得到
重复 , 1 988年播种得苗 132 棵 , 20 棵产生了这
种现象 , 占1 5 . 1% , 与 1 9 8 6年一6 . 7 %相比 ,
差异不显著 。 温室盆栽树所结种子 , 其实生
苗产生愈伤组织的频率显著高于大田树 ,
19 5 5年为 3 9 . 1% , 1 9 5 6年为 3 5 . 1% , 这可能
与树的生理状态有关系。
柑桔胚性愈伤组织的原生质体 , 其胞质
较稠密 , 许多细胞含有淀粉粒 。 酶解时 , 原
生质体容易破裂 , 随酶浓度的提高 , 破裂越
严重。 采用 0 . 3%果胶酶和 0 . 3 %纤维素酶处
理 5小时 , 开始释放出原生质体 , 1叼、 时可
得到大量原生质体 , 此时 , 破裂较少 , 随时
间延长 , 破裂增多 , 摇床的振动将加剧原生
质体的破裂 。 经测定表明 , 分离出的原生质
体 91 . 2 %具有活性 。 锦橙原生质体培养 4 天 ,
观察到第 1次细胞分裂 。 在无教素培养基中培
养 7 天 , 4 . 4 %能恢复分裂 , 其中有 12 . 7%
已分裂了 2 次。 加入 6 一 B A 5 P m , 恢复
分裂的原生质体显著增多 , 达到 59 . 了% , 但
加入 6一 B A 后影响了细胞团的分化 。 原生
质体培养 10天时可见到 8 个细月欧殉小细胞团 ,
20 天时 , 细胞团增殖到 肉眼可见的大小。 转
入摇床后 l 个月 , 再生出球形或心形胚状体 ,
对 l 瓶 ( 10 ~ 15 毫升 ) 的计数表明有 30 余
颗胚状体 。 二 此时 , 加入 5 A D (硫酸腺嗓吟 )
5 即m , 可促进 胚状体转绿和进一步发育。
如继续停留在无激素培养基中 , 将产生大量
白色和畸形胚状体。 加入 5 A D 后 , 胚状体
转绿 , 进一步分化成鱼雷期和子叶期胚状体 。
山金柑原生质体的分裂频率较锦橙低
(约 10 % ) , 按锦橙的培养程序也获得了胚
状体。
将子叶期胚状体转入萌发培养基中 1个
月 , 萌发成完整的植概 未发育到子叶期的
胚状体生根困难 , 容易形成莲座状结构。
再生植株经过培养箱的过渡后 , 移入露
地中 , 累计移栽3 株 , 成活32 株 , 成活率在
B u l l e t i n 3八 98 9
9 0 %以上 。
对锦橙原生质体再生出的 1 5 0个胚状体
和7 棵植株进行检查 , 没有发现染色体数目
变异 , 均为二倍体 , Z n = 1 80
原生质体培养如采用植板培养方式 , 其
恢复分裂与浅层培养无什么差异 , 但降低等
渗液浓度比较困难。 形成小细胞后 , 生长明
显慢于悬浮培养。 在固体植板情况下 , 一般
要培养 4个月才能再生成球形胚状体 。 细胞
团的生长也没有悬浮培养那样旺盛整齐 , 这
与悬浮培养改善了通气和营养条件是分不
开的 。
讨 论
柑桔的胚性愈伤组织大多由珠心组织诱
导产生。 因为珠心组织中存在着一种胚原基
细胞 , 活体条件下它们发育成珠心胚 , 在离
体条件下 , 这些细胞将得到更多的再生机会 ,
所以这一方法成为一条获得胚性愈伤组织的
重要途径。 然而这一方法 , 受时间的限制 ,
花后 2 一 8 周为好。 本研究的结果表明 , 山
金柑实生苗具有直接产生胚性愈伤组织的能
力 , 在温州蜜柑 ( C . u n s h i u M a r e ) 等
种中也发现这种特性。 由于这一方法操作较
简便 , 季节性不强 , 是获得胚性愈伤组织较
为理想的途径 。 杨乃博在金弹 ( F . cr a : 卜
i f
o l i a s 俪 n g l e ) 以及 M a t s u mo t o在 积
( p
o ” c i r u s tr i f o ila t a aR f ) 中也观察
到类似现象 , 但其发生频率没有山金柑高 。
采用山金柑为试材 , 进一步研究愈伤组织的
发生机理 , 对于弄清柑桔无性胚的发生机理
以及控制方法 , 达到克服杂交育种过程的珠
心胚干扰问题将是十分有益的 。
柑桔胚性愈伤组织再生较容易 , 并且是
走胚状体成株途径 , 变异小 , 这对于利用原
生质体技术进行柑桔育种研究是十分有利的 。
本研究采用浅层 - 悬浮一固体培养方式 , 在
锦橙、 山金柑以及桃叶橙中均得到重复 。 在
进行原生质体培养时应注意下列几点: 江准
择旺盛的愈伤组织为启始材料 ; ②注意培养
过程中的渗透压的调整 ; ③改善通气条件 ,
及时更换培养基 ; 再生植株首先移在比培养
温度较低的环境中 ( 20 ℃ ) 加强光照 , 保持
湿度 , 有利于幼苗的木质化 , 提高移栽成活
率。 胚状体萌发成的植株 , 其输导组织是连
通的 , 移栽不成活往往是由萎蔫造成 , 很重
要的原因是植株地上地下部分的水分不平衡
造成的 , 在试管条件下叶片的角质层不发达 ,
移出试管后 , 容易散失水分 , 而异养条件下
的根系 , 其吸水能力较差 , 使得这两者处于
不平衡状态。 本试验采用降低移栽温度的方
法 , 移栽成活率在 90 %以上 , 这可能是降温
后 , 叶片蒸腾的水分随温度下降而减少 , 而
根系在 20 ℃条件下 , 吸收功能并不受很大影
响 , 使水分收支处于一个相对的平衡中。
(参考文献 18篇略 )
科学测土施肥系统研制成功
长期以来 , 我国县级土壤分析室由于缺少土壤、 肥料 、 植株分析仪器 , 只能以老式光电比色计、 火焰
光度计等常用实验仪器代用 , 普遍存在分析项目过少 、 土样前处理手段落后 、 土壤分析精度差等问题 , 远
远不能满足各地因土施肥、 测土施肥 、 改良土壤及开展植株微量元素分析测试的需要。 为了改变这一状况 ,
南京土壤仪器研究所承担了研制科学测土施肥系统的攻关课题 , 并获得成功。 实现了测试土样的机械化和
小型电脑化 , 从土样风干 、 磨碎 、 过筛 , 到浸提 、 上机测试、 数据处理 , 形成了一个完整、 迅速的测试过
程 , 其效率比以前的常用仪器提高 1时音以上 。
(江 苏农业科技报 李德新 )
中国农学通报 3 / 19 89 。 15 。