全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 022235204
N + 离子注入法选育高产葡萄糖耐量因子 ( GTF)酵母菌株
高艳红1 ,2 吕加平1 刘 鹭1 李淑荣1
(11 中国农业科学院农产品加工研究所Π农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室 ,北京 100193 ;
21 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 ,内蒙古 ,呼和浩特 010018)
摘 要 :本研究通过铬耐量筛选的方式 ,从 12 株供试啤酒酵母中获得 1 株高耐铬性啤酒酵母菌株 ,并对
该菌株进行 N + 注入诱变 ,注入能量为 50keV ,注入剂量 1 ×216 ×1013 、2 ×216 ×1013 、3 ×216 ×1013 、4 ×216
×1013 、5 ×216 ×1013和 6 ×216 ×1013 ionΠcm2 。结果表明 ,最适诱变的注入剂量为 4 ×216 ×1013 ionΠcm2 ,得
到 1 株高产 GTF 的啤酒酵母菌株 M1121A11 ,其富铬能力较诱变前提高了 2214 %。经 5 次传代发酵培
养 ,突变株的富铬性能稳定。
关键词 :N + 离子注入 ; GTF ;富铬酵母菌 ;筛选
SCREENING OF HIGH2YIELD GTF YEAST BY N+2IMPLANTATION
GAO Yan2hong1 ,2 LV Jia2ping1 LIU Lu1 LI Shu2rong1
(11 Institute of Agro2Food Science and Technology , Chinese Academy of Agricultural SciencesΠKey Lab of Agricultural
Product Processing and Quality Control , Ministry of Agriculture , Beijing 100193 ;
21 College of Food Science and Engineering , Inner Mongolia Agricultural University , Mongolia , Huhhot 010018)
Abstract :In this study , one of the highest chromium2resistant strain was screened from 12 tested brewer’s yeast N+ ion
implantation was used to mutate this yeast and screened high2yield GTF yeast strains with Cromium tolerance method. The
mutagenesis was conducted by 50 KeV N+ ion implantation with the doses of 1 ×216 ×1013 ,2 ×216 ×1013 ,3 ×216 ×1013 ,4
×216 ×1013 ,5 ×216 ×1013 and 6 ×216 ×1013 ionΠcm2 . Results showed that the optimum dose was 4 ×216 ×1013 iconΠcm2 ,
and a strain M1121A11 of high2producing GTF was obtained. Its organic Cr content was increased by 2214 % than the original
strain. Its fermentation property was stable after 5 generation transfer inoculation.
Key words :N + 2implantation ; GTF ; yeast ; screening
收稿日期 :2008208207 接受日期 :2008201206
基金项目 :国家航天育种工程项目 (2006HP20013)子课题
作者简介 :高艳红 (19832) ,女 ,内蒙古呼伦贝尔人 ,硕士研究生 ,主要从事食品微生物方面研究。E2mail : gaoyanhong84 @1261com
通讯作者 :吕加平 (19632) ,男 ,山西朔州人 ,研究员 ,博士生导师 ,主要从事乳品及食品微生物学研究。Tel :010262810295 ; E2mail : lvjp586 @vip .
sina. com
部分酵母菌体具有较高的铬耐受性 ,这种酵母菌
株能将其生存环境中一定量的无机铬离子吸收到体内
并转化为有机铬结合蛋白[1 ,2 ] 。有机铬结合蛋白可以
促进机体细胞对葡萄糖的吸收和利用 ,降低血糖、改善
机体营养 ,预防、控制糖尿病的发生与发展[3～5 ] ,因而
被称为葡萄糖耐量因子 ( Glucose Tolerance Factor ,
GTF) 。GTF 以三价铬为活性中心 ,每个 GTF 分子结构
中含有一个分子的三价铬[6 ] 。人们通过测定富铬酵母
中有机铬含量来间接评价 GTF 的含量[7 ] ,有机铬含量
是评价和筛选高产 GTF 富铬酵母菌株的一个主要指
标。
离子注入诱变育种是近年来发展起来的新型微生
物诱变育种方法 ,主要通过能量沉积、动量传递、质量
沉积、电荷中和与交换四种联合作用对生物体产生诱
变效应[8～11 ] 。余增亮等已证明注入细胞内低能离子束
对农作物和微生物能产生良好的诱变效应[12 ] 。宋安
东等用离子注入法对苹果酒酵母进行诱变 ,得到了产
酒率提高 2214 %的优良酵母菌株[13 ] 。本研究采用离
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子注入法对通过铬耐量筛选的富铬酵母菌株进行 N+
离子注入诱变 ,以期得到高产 GTF 的富铬酵母菌株 ,
为 GTF 的产业化生产寻找良好的菌种来源。
1 材料与方法
111 供试材料和仪器
出发菌种为啤酒酵母 ( Saccharomyces cerevisiae) ,分
别为 M1121、QH1522、QH3122 等 12 株 ,由内蒙古农业大
学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。
所用培养基有固体 YEPD 完全培养基、液体 YEPD
培养基[14 ] 。种子培养基采用普通 YEPD 液体培养基。
发酵培养基配方为葡萄糖 20g ,酵母浸粉 10g ,大豆蛋
白胨 20g ,调整 pH 为 516 ,蒸馏水 1000ml ,灭菌后加入
2105gΠL 微滤除菌的三氯化铬溶液。
微波消解所用浓硝酸和高氯酸为优级纯 ,
11000gΠL铬标准贮备液 (一级标准物质) 购自中国计量
科学院。试验所用其他试剂均为常用生化试剂和分析
纯。
温压双控密闭微波消解Π萃取仪 ,购自上海新仪微
波化学科技有限公司 ;火焰原子吸收分光光度计 ,日本
岛津公司产品 ;离子注入机为北京师范大学低能核物
理研究所 BNU2400 型离子注入机。
112 离子注入操作
将富铬酵母菌株制成菌数为 1116 ×108 的种子
液 ,取 50μl 均匀涂布于 9cm 无菌平皿中 ,无菌风吹干
成菌膜 ,镜检无细胞重叠再进行 N+ 离子注入。离子
注入在北京师范大学低能核物理研究所进行 ,注入能
量为 50 keV ,注入剂量分别为 1 ×216 ×1013 、2 ×216 ×
1013 、3 ×216 ×1013 、4 ×216 ×1013 、5 ×216 ×1013 和 6 ×
216 ×1013 ionΠcm2 ,同时做空白对照[15 ] 。注入相应剂量
后用 1ml 无菌生理盐水冲洗平板 ,将冲洗液涂布于固
体 YEPD 培养基中进行活菌计数 ,离子注入组活菌数
和计算真空对照组的比例即为存活率 ,选择恰当存活
率时的注入剂量再次制作菌膜进行注入。
113 突变菌株的耐铬性筛选
离子注入后用 1ml 生理盐水冲洗平板 ,将冲洗液
均匀涂布于含有 51125gΠL 三氯化铬的固体 YEPD 平板
中 ,28 ℃静止培养 2 - 3d ,挑取平皿中光滑圆润、形体
大的单菌落编号 ,并进行发酵试验。发酵培养基为
YEPD液体培养基 ,接种量为 10 % ,发酵液加铬量为
2105gΠL ,发酵时间 30h ,培养温度 28 ℃,摇床转速为
200rΠmin。比较诱变前后菌株的生物量和有机铬
含量。
114 突变菌株的传代稳定性试验
将经过筛选得到的突变菌株在 YEPD 斜面培养基
上连续转接 5 代 ,挑取各代菌体做发酵试验 ,测定其生
物量、有机铬含量。
115 测定
11511 富铬酵母生物量的测定 按照参考文献
[16 ,17 ]所述方法进行。在 30ml 的 YEPD 液体培养基
中加入 2105gΠL 的三氯化铬溶液。接种量为 10 % ,如
113 进行发酵。将发酵后的菌悬液移入离心管中 ,以
转速 5000rΠmin 离心 10min ,弃去上清液 ,去离子水洗涤
沉淀物 ,同前条件离心 ,重复洗涤离心 2 次 ,收集菌体 ,
80 ℃烘干至恒重 ,称重。
11512 样品的提取与消解 精确称取 011g 富铬酵母
粉 ,加入 NH3 ·H2O 提取 3h ,5000rΠmin 离心 ,取上清液
加入 HNO3 ,于电热板上驱烟 ;再加入 HNO3 和 HClO4 ,
装罐 ,消解 ,消解后加 HNO3 及 (NH4 ) 2 S2O8 ,于电热板
上氧化。倒入含有 NH4 Cl 的容量瓶中 ,用去离子水定
容。用原子吸收法测定有机铬的含量 ,方法同铬标准
曲线的测定。
11513 铬原子标准曲线的制作 按参考文献[18 ] 所述
方法配制含铬系列标准液。原子吸收条件为 :灯电流
10mA ,狭缝宽 017nm ,燃烧器高度 9mm ,波长 35719nm ,
空气流量 1510 LΠmin ,乙炔流量 218LΠmin。以铬含量为
横坐标 ,吸光值为纵坐标绘制标准曲线。
2 结果与分析
211 离子注入剂量的选择
采用能量为 50keV ,对经过铬耐量筛选 ,从 12 株菌
中筛选得到富铬酵母菌株M1121 进行 N+ 离子注入时 ,
注入剂量对菌株的致死率有着显著的影响。如图 1 所
示 ,N + 离子注入后富铬酵母菌株的存活率迅速下降并
维持在一定水平 (20 %以下) ,但是当剂量增加到 4 ×
216 ×1013 ionΠcm2 时存活率又有所升高 ,此后存活率又
开始下降并继续维持在一定水平。呈典型的“马鞍型”
剂量2效应曲线。宋道军[19 ] 等对此类存活曲线的发生
机制进行了探讨 ,初步认为 ,低剂量注入时 ,能量沉积
效应和动量转移效应的综合作用导致的 DNA 损伤和
生物膜等大分子的损伤造成了存活率的急剧降低 ;中
高剂量注入时存活率升高则可能是离子注入后电荷积
累发挥了作用 ,激活了细胞的修复机制和修复酶 ,产生
了不同程度的修复 ;高剂量注入时 ,通过不断的刻蚀 ,
细胞损伤程度大于其修复能力 ,电荷效应也由于达到
了临界值而产生库伦爆炸 ,保护屏蔽消失。因此存活
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曲线峰值区域所对应的注入剂量为诱变的最适注入剂
量 ,结合图 1 ,本试验选择 4 ×216 ×1013 ionΠcm2 作为富
铬酵母菌株诱变的最适注入剂量 ,此时的存活率为
27 %。
图 1 N + 注入对 M1121 存活率的影响
Fig. 1 The effect of N + implantation on
the survival rate of M1121
212 耐铬突变菌株的筛选
通过对诱变后菌株的铬平板涂布培养物的初筛及
复筛 ,得到生长良好的单菌落共 14 个 ,对其进行发酵
试验 ,比较诱变前后菌株的生物量和有机铬含量变化
情况 ,结果如表 1 所示。
表 1 突变菌株有机铬含量的变化
Table 1 The change of organic Cr content of
mutant strains (mean ±SD , n = 3)
突变菌株
mutant
生物量
biomass
(gΠ100ml) 有机铬含量organic Crcontent (μgΠg) 有机铬含量的变化change ratio oforganic Cr content ( %)
M1121A1 0193 2064156 ±1129jJ 0165 %
M1121A2 0193 2052126 ±1102kK 0 %
M1121A3 0193 2013102 ±0198mM - 1186 %
M1121A4 0191 2310158 ±1156dD 1216 %
M1121A5 0192 2196127 ±1143gG 7107 %
M1121A6 0191 2356159 ±2101cC 14189 %
M1121A7 0194 2206125 ±0196fF 7156 %
M1121A8 0192 2403123 ±1123bB 17116 %
M1121A9 0192 2115126 ±1143hH 3112 %
M1121A10 0195 2029115 ±2112lL - 1108
M1121A11 0193 2510178 ±3100aA 2214 %
M1121A12 0193 2113198 ±0196hH 3106 %
M1121A13 0193 2109126 ±0198iI 2183 %
M1121A14 0193 2249153 ±0177eE 9167 %
CK 0193 2051123 ±0192kK
注 : 3 表中数据后不同大小写字母分别代表 0101 ,0105 水平的显
著性差异。
Note : 3 The data followed by different capital and small letters indicated
significant difference at 0101 and 0105 level .
从表 1 中可以看出 ,诱变前后菌体的生物量变化
较小 ,其中 M1121A4、M1121A5、M1121A6、M1121A8 和
M1121A9 有一定程度的下降 ,M1121A7 和 M1121A10 的
生物量有所升高 ,达到 0194 和 0195gΠ100ml ;诱变后
M1121A3 和 M1121A10 的有机铬含量分别下降了
1186 %和 1108 % ,其他菌株的有机铬含量均有不同程
度的提高 ,其中 M1121A11 有机铬含量较对照提高了
2214 %。诱变目的菌株的选择要考虑两方面因素 :一
是突变菌株有较高的生物量 ;二是突变菌体能够富集
较多的铬 ,即有机铬含量 ( GTF 的产量) 要高。如果某
个菌株具有极高的有机铬含量 ,然而其生物量却很低 ,
从经济性角度考虑该菌株就不适合用于 GTF 的高效
生产。因此要同时考察生物量和有机铬含量 2 个指标
来筛选优良突变菌株。而表 1 显示 ,M1121A11 等各个
突变菌株生物量较诱变前没有明显的变化 ,故只根据
有机铬含量来选择优良菌株 ,而M1121A11 具有较高的
有机铬含量 ( GTF 产量) ,因此将菌株 M1121A11 初步确
定为离子注入诱变筛选的目的菌株。
213 突变菌株的遗传稳定性试验
对M1121A11 进行传代发酵稳定性试验 ,结果见表
2。从表 2 可以看出 ,经过 5 次传代发酵后 M1121A11
菌株的生物量、有机铬含量没有明显变化 ,初步说明该
菌株具有较好的遗传稳定性。
表 2 M1121A11 的遗传稳定性结果( mean ±SD , n = 3)
Table 2 The results of heredity stability
of M1121A11 (mean ±SD , n = 3)
突变菌株
mutant strains
生物量
biomass(gΠ100ml) 有机铬含量organic Cr content (μgΠg)
1 代 the first generation 0191 2436125 ±2145
2 代 the second generation 0190 2430123 ±3101
3 代 the third generation 0192 2429145 ±3159
4 代 the forth generation 0190 2435101 ±2103
5 代 the fifth generation 0192 2432153 ±2156
0 代 the original strain 0191 2431172 ±2151
3 讨论与结论
N + 离子注入对富铬酵母菌体产生了一定的生物
效应 ,其注入剂量与富铬酵母存活率之间的关系遵循
“马鞍型”剂量2效应曲线 ,本试验在 50keV 注入诱变能
量下 , 筛选出最适 N + 注入剂量为 4 ×216 ×1013
ionΠcm2 ,对啤酒酵母菌株进行注入诱变。并采用铬耐
受量分离培养法筛选 GTF 高产菌株 ,最终筛选得到了
1 株有机铬含量提高了 2214 %的富铬酵母菌株 ,且菌
732 2 期 N + 离子注入法选育高产葡萄糖耐量因子 ( GTF)酵母菌株
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体具有较好的遗传稳定性。
不同菌株在离子注入条件下细胞的损伤修复能力
不一样 ,存活率也不同。筛选优良突变菌株时应考虑
菌体生物量及其富铬量 ,即优良菌株应同时具有较高
的生物量和有机铬富集量 ,否则任何单一性状都不能
应用于 GTF 的高效生产。
本试验证明离子注入诱变育种可用于富铬酵母菌
株的诱变 ,并能够在一定程度上提高菌株 GTF 的产生
能力 ,获得的优良菌株 M1121A11 为 GTF 的产业化生
产制备提供了良好的菌种资源。
致谢 :感谢北京师范大学夏稷老师提供了离子注入条
件并给予指导和帮助。
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