全 文 ：文章编号 :100028551 (2007) 022128204
脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝生长速度的影响
严　涛1 　李　冠1 　曾宪贤2
(11 新疆大学生命科学与技术学院 ,新疆 乌鲁木齐　830046 ;21 新疆大学离子束生物工程中心 ,新疆 乌鲁木齐　830008)
摘　要 :利用低能离子束生物技术对猴头菌进行诱变选育 ,通过分析 N+ 离子注入后猴头菌丝体的生长
速度 ,研究脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝体的影响。结果表明 :脉冲时间从小到大的变化对 N+ 离
子注入猴头菌丝生长速度的整体影响呈先下降 ,后上升 ,再下降的“马鞍型”曲线。证明在注入剂量相同
的前提下脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝的生长速度有影响。
关键词 :N + 离子注入 ;猴头菌 ;生长速度 ;脉冲时间
EFFECT OF PULSE LASTING TIME OF ION IMPLANTATION ON THE GROWTH OF Hericium ernaceus
YAN Tao1 　LI Guan1 　ZENG Xian2xian2
(11 College of Life Science and Technology , Xinjiang University , Urumqi , Xinjiang 　830046 ;
21 Ion Beam Bio2Engineering Center , Xinjiang University , Urumqi , Xinjiang 　830008)
Abstract :Low energy ion implantation technology was used in mutation breeding of Hericium erinaceus . The growth speed of
the Hericium erinaceus hypha is as an index to study the influence of the pulse lasting time of N+ ion implantation. The result
shows that the growth speed of Hericium erinaceus hypha presents“saddle shape”curve ,which was descend first , then rising
up and descend again when the pulse time lasts for longer and longer. It is concluded that the pulse time obviously influence
N + ion implantation. When the dosage keeps the same.
Key words :N + ion implantation ; Hericium erinaceus ;growth speed ;pulse lasting time
收稿日期 :2006204229
基金项目 :国家发改委高技术产业化示范工程项目 ( [2004 ]2077)
作者简介 :严　涛 (19802) ,男 ,甘肃武威人 ,硕士 ,从事植物生物技术的研究。Tel :13109912007 ; E2mail : yantaoonline @163. com。
通讯简介 :李　冠(19492) ,男 ,湖北黄陂人 ,教授 ,博士生导师 ,研究方向为植物生理生化与分子生物学。Tel :099128585071 ;E2mail : guanli @xju. edu. cn　　近年来 ,低能离子束技术在植物、微生物等材料的诱变育种领域得到了广泛的应用 ,并取得许多成果[1～3 ] 。目前的报道中一般以 ionsΠcm2 表示离子注入的剂量 ,注入时将剂量换算成相应的注入时间 ,注入方式有连续式注入[4 ,5 ] 和脉冲式注入[6～10 ] 两种。连续式注入就是将注入时间一次性注入 ,中间没有停顿 ;脉冲式注入是将注入时间分割成若干单位时间 ,分多次注入总时间。这种由实验人员自行设定的单位时间叫做脉冲时间 ,常见的脉冲时间有 5s[6～9 ]和 10s[10 ] 。连续式注入只有一种注入方式 ,脉冲式注入则可根据脉冲时间选取的不同而有多种注入方式。目前已知的脉冲式注入的研究中 ,主要分析了不同的剂量 (即注入的总时间)对注入效果的影响 ,尚未见到不同的注 入方式 (即不同的脉冲时间) ,尤其是在注入剂量相同时 ,不同的注入方式对注入效果有何影响的报道。本文在用 N + 离子对猴头菌丝进行注入后 ,发现注入方式对 N + 离子注入猴头菌丝体的生长速度有影响。1 　材料与方法111 　材料猴头菌由新疆乌鲁木齐县食用菌研究所提供。综合马铃薯培养基 :马铃薯 200g ,葡萄糖 20g ,蛋白胨 10g , KH2 PO4 3g , MgSO4 3g , 琼脂 20g , 蒸馏水1000ml ,pH510。112 　方法
821　 核 农 学 报　2007 ,21 (2) :128～131Journal of Nuclear Agricultural Sciences
1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
11211 　菌块的制备 　猴头菌接种于综合马铃薯培养
基 ,25 ℃暗培养 15d 左右 ,用打孔器在均匀生长的新生
菌丝处打孔 ,取出菌块备用。
11212 　N + 离子注入与样品处理 　用西南物理研究院
研制的LCD21000 型低能离子注入机进行注入。注入
能量 15keV ,靶室的真空度 10 - 3 Pa ,脉冲时间为 5s、10s、
15s 和 20s ,以不注入为对照。处理和对照均设 5 个重
复。
将 N + 注入和对照的菌块在无菌操作下接入综合
马铃薯培养基 ,25 ℃暗培养。
11213 　生长速度的测量与计算 　待菌丝恢复生长后 ,
每隔 12h 左右测量一次直径。用菌落的直径差除以对应
的时间间隔 ,得到猴头菌丝的生长速度 ,单位 mmΠh。
2 　结果与分析
211 　不同脉冲时间对猴头菌丝生长速度的影响
以注入的次数为横坐标 ,菌丝的生长速度 (单位 :
mmΠh)为纵坐标 ,不同脉冲时间 (5s、10s、15s、20s) 得到
的数据分别作图 ,得图 1～图 4。
图 1 　5 秒脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝
生长速度的影响
Fig. 1 　Influence of 5second pulse time upon the growth
speed of hypha after N + ion implantation
图 2 　10 秒脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝
生长速度的影响
Fig. 2 　Influence of 10s pulse time upon the growth
speed of hypha after N + ion implantation
图 3 　15s 脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝
生长速度的影响
Fig. 3 　Influence of 15s pulse time upon the growth
speed of hypha after N + ion implantation
图 4 　20s 脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝
生长速度的影响
Fig. 4 　Influence of 20s pulse time upon the growth
speed of hypha after N + ion implantation
　　已有的研究[11 ,12 ] 发现 ,离子注入与其他诱变手段
有所不同 ,试验材料的某些生物学性状随剂量的增加
呈“马鞍型”曲线变化 ,推测这是由于注入的离子能对
实验材料产生刺激修复效应。当注入剂量较小时 ,注
入离子的直接作用和能量沉积所产生的自由基会导致
DNA和生物膜等其他生物大分子受损 ;随剂量的增
加 ,注入离子的电荷能积累和质量沉淀产物对细胞产
生了某种刺激修复效应 ;当剂量继续增大时 ,注入离子
对细胞的损伤效应超过了质量、电荷的保护和刺激效
应以及细胞自身的修复能力。但注入离子修复效应的
详细作用机理还需进一步研究。
由图 1～图 4 可以看出 ,采用不同的脉冲时间进
行注入 ,猴头菌丝的生长速度随剂量的增加都呈先上
升 ,后下降 ,再上升 ,再下降的变化曲线 ,合适的剂量对
921　2 期 脉冲时间对 N + 离子注入猴头菌丝生长速度的影响
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
菌丝的生长速度有一定的促进作用 ,这与前人的研究
是相同的。
但不同的脉冲时间对菌丝生长速度的整体影响是
不同的。图 1～4 中 ,黑色 ,白色和条纹的条柱所代表
的剂量是相同或相近的 ,但采用不同的脉冲时间注入
后 ,猴头菌丝的生长速度有明显差异。可以看出 ,脉冲
时间由小到大的变化对菌丝生长速度的整体影响呈先
下降 ,后上升 ,再下降的“马鞍型”曲线变化。
根据已有的研究[11 ,12 ] 和本研究结果可以推断 ,以
5s 脉冲时间注入时 ,N + 离子的直接作用和能量沉积所
产生的大量自由基导致 DNA 和生物膜等其他生物大
分子的损伤 ,这可能是造成菌丝生长速度变慢的原因 ;
同时 ,在 5s 脉冲时间注入时 ,每次注入的 N+ 离子较
少 ,使得注入离子的电荷积累和质量沉淀产物相对较
少 ,对细胞损伤的修复效应也相对较小 ,所以采用 5s
脉冲时间注入时 ,没有出现对猴头菌丝生长速度有较
好促进作用的剂量 (图 1) 。但是 ,当注入次数增加到
20 和 40 次时 ,菌丝生长速度反而开始增加 ,接近对照
的生长速度 ,推测是少量多次的大剂量注入后 ,N+ 离
子的电荷积累和质量沉淀产物也得到某种程度的积
累 ,从而对损伤细胞起到了一定的修复作用 ,导致菌丝
的生长速度开始上升。但是 ,注入 20 和 40 次得到的
菌丝生长速度相近 ,可能是在此大剂量下 ,注入离子对
细胞的修复效应与其对细胞的损伤效应达到了某种平
衡 ,可以推断 ,如果继续增加注入的次数 ,注入的 N+
离子对细胞的修复效应将会小于对细胞的损伤效应 ,
导致菌丝生长速度的再次下降。
10s 脉冲时间注入时 ,有 6 个剂量对猴头菌丝的生
长速度有促进作用 ,其中注入 2 次和 6 次时生长速度
分别增加了 15. 8 %和 19. 3 %。但这两个处理采用 5s
和 20s 脉冲时间注入时 ,对生长速度没有产生明显的
促进作用 ,甚至抑制其生长速度 ,说明 10s 脉冲时间比
较合适。推测是采用 10s 脉冲时间进行注入时 ,每次
注入的 N + 离子的电荷能得到一定的积累 ,阻碍后续
注入离子对细胞的伤害 ,并形成弱电场 ,激活细胞内的
各种酶 ,尤其是修复酶 ,提高了损伤修复的效率 ;同时 ,
注入离子的质量沉淀产物能与细胞内的 DNA 和蛋白
等生物大分子竞争自由基 ,从而减轻自由基对细胞的
损伤作用 ,并对细胞产生了某种刺激效应 ,促进了猴头
菌丝的生长。所以 ,用 10s 脉冲时间注入时 ,对猴头菌
丝生长速度的整体影响呈促进作用。
15s 脉冲时间注入时 ,有 2 个剂量对猴头菌丝的生
长速度有促进作用 ,其中只有在注入次数为 1 次时才
对生长速度有较明显的促进作用 ,当注入次数超过 1
次后 ,生长速度总体呈下降趋势 ,说明 15s 脉冲时间的
注入方式对猴头菌丝生长速度的整体影响以抑制作用
为主。
而 20s 脉冲时间的注入 ,没有出现对生长速度有
明显促进作用的剂量 ,可能是连续 20s 的持续注入对
猴头菌丝的伤害过大 ,对细胞的损伤超过了质量、电荷
的保护和刺激效应以及细胞自身的修复能力。
212 　注入时的真空状态对猴头菌生长的影响
N + 离子注入猴头菌时 ,需要抽真空 ,真空是一种
特殊环境因素 ,有可能对猴头菌丝产生影响 ,因此需要
对可能存在的真空效应进行检测。
参照 11211 制样 ,取一个培养皿放入菌块 ,加盖放
于靶室内 ,作为真空对照皿 ;另取一个培养皿放入菌
块 ,去盖放于真空对照皿上 ,作为注入皿。这样 ,真空
对照皿与注入皿中菌块的真空效应是相同的 ,注入皿
中的菌块同时接受了 N + 离子的注入。未进行任何处
理的菌块作为对照。
以图 1～图 4 中生长速度最快的 3 个处理进行注
入 ,设为处理 1 (15sΠ次 ,注入 1 次) ;处理 2 (10sΠ次) ,注
入 2 次) ;和处理 3 (10sΠ次 ,注入 6 次) ,再次注入。注
入同 11212 ,生长速度计算同 11213。将注入后菌丝的
生长速度与对照菌丝的生长速度进行比较 ,详见表 1。
表 1 　真空状态对离子注入的猴头菌丝相对生长速度的影响
Table 1 　Influence of vacuum condition on the relative
growth speed of hypha treated by ion implantation
剂量 dose 15s ×1 10s ×2 10s ×6
注入 treated 111. 14 % 113. 86 % 118. 07 %
真空对照 vacuum CK 96. 53 % 95. 05 % 103. 22 %
对照 CK 100 % 100 % 100 %
　　处理 1、2 和 3 再次注入后的猴头菌丝体的生长速
度与第一次注入时得到的数据差异不显著。处理 1 和
2 真空对照得到的生长速度均小于对照菌丝的平均生
长速度 ,处理 3 真空对照得到的生长速度只比 N+ 菌丝
的平均生长速度大 3. 22 % ,而 3 个处理的猴头菌丝体
的生长速度比对照高出 10 %以上 ,最高接近 20 %。可
以认为在这 3 个剂量下注入 ,猴头菌丝生长速度的增
加 ,主要原因是 N + 离子的注入对猴头菌丝的影响。
3 　结论
离子束注入生物材料后 ,注入的离子对试验材料
有损伤效 ,而生物材料自身又有修复效应[11 ,12 ] 。本研
究的数据显示 ,在培养环境 ,菌丝生长速度的测量方式
和注入剂量相同的前提下 ,采用合适的脉冲时间进行
031 核　农　学　报 21 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
注入 ,则对菌丝的生长速度有较好的促进作用 ;反之 ,
脉冲时间不合适 ,则使菌丝的生长速度有大幅度的下
降。并且 ,采用合适的脉冲时间进行注入 ,可以在较大
的剂量范围对猴头菌丝的生长速度有促进作用 ;采用
不合适的脉冲时间进行注入 ,则对猴头菌丝的生长速
度以抑制作用为主。说明脉冲时间对 N + 离子注入猴
头菌丝的效果有影响。
因此 ,我们在分析 N + 离子注入猴头菌丝的效果
时 ,可以将离子注入分为损伤和生物体修复两个过程。
其中 ,注入剂量与细胞的最终损伤程度有关 ,脉冲时间
(即注入的方式) 则与注入离子的修复刺激效应有关。
在确定猴头菌丝生长速度的最佳剂量时 ,需要综合考
虑注入总时间与脉冲时间 ,才能使最终损伤程度和累
积的修复效应达到较好的平衡。
由已有的研究[11～15 ] 可知 ,多种试验材料的存活
率 ,发芽率和酶的含量等生物学性状随低能离子束的
剂量呈“马鞍型”曲线变化。本研究数据表明 ,脉冲时
间由小到大的变化 ,对猴头菌丝生长速度的整体影响
也呈先下降 ,后上升 ,再下降的“马鞍型”曲线变化。因
为脉冲时间由小到大的变化 ,代表注入剂量的相应变
化 ,所以 ,脉冲时间对猴头菌丝生长速度的整体影响呈
“马鞍型”曲线的机理应与已有的研究[11 ,12 ]相同。因此
推断 ,脉冲时间对离子注入其他生物材料可能也有类
似的影响 ,这将是我们下一步研究的内容。
参考文献 :
[ 1 ] 　吴丽芳 ,李　红. 离子束生物工程应用研究进展. 物理 ,1999. 28
(12) :708～712
[ 2 ] 　虞　龙 ,余增亮. 离子束生物工程及其应用研究. 中国兽药杂
志 ,2001. 35 (1) :55～59
[ 3 ] 　宋道军 ,余增亮. 离子束生物工程学. 中国科学基金 ,2001. 2 :102
～105
[ 4 ] 　赵　鑫 ,赵良启 ,刘春卉 ,等. 离子注入L - 乳酸产生菌诱变选育
研究. 生物技术 ,2004. 14 (6) :24～26
[ 5 ] 　杨　辉 ,梁海秋 ,廖　威 ,等. 离子束注入法诱变选育耐高糖衣康
酸高产菌株. 工业微生物 ,2003 ,33 (3) :30～32
[ 6 ] 　杜严华 ,丘冠英 ,李 　国等. 低能离子束及 X 辐照对小菜蛾颗粒
体病毒的影响及剂量效应关系的拟合分析. 生物物理学报 ,
1997 ,13 (2) :267～272
[ 7 ] 　甄卫军 ,李 　茜 ,张石峰 ,等. 低能 N + 离子注入谷氨酸产生菌诱
变选育及其发酵的研究. 中国科学院研究生院学报 , 2002 ,19
(4) :428～432
[ 8 ] 　吕树娟. 王　军. 姚建铭 ,等. 离子注入氧化葡萄糖酸杆菌的诱变
效应. 激光生物学报 ,2003 ,12 (5) :382～385
[ 9 ] 　程茂基 ,陈丽娟 ,蔡克周 ,等. N + 注入选育产蛋白酶益生菌及其
生物学效应研究. 激光生物学报 ,2005 ,14 (3) :161～167
[10 ] 　宋道军 ,李　红 ,余增亮. N + 离子注入对不同辐射敏感性微生物
超氧化物歧化酶 (SOD) 、过氧化氢酶 ( CAT) 和过氧化物酶 ( POD)
活性的影响. 生物物理学报 ,1998 ,14 (2) :325～330
[11 ] 　宋道军 ,余增亮. 三种辐射源对耐辐射微球菌作用机理的比较研
究. 生物物理学报 ,1998 ,14 (1) :185～188
[12 ] 　宋道军 ,姚建铭 ,邵春林 ,等. 离子注入微生物产生“马鞍型”存活
曲线的可能作用机制. 核技术 ,1999 ,22 (3) :129～132
[13 ] 　覃怀莉 ,薛建明 ,赖江南 ,等. MeV 离子辐照拟南芥的萌发规律研
究. 核技术 ,2005 ,28 (9) :675～677
[14 ] 　李玉峰 ,梁运章 ,吕剑刚. 低能N + 注入对紫花苜蓿生理生化的影
响. 内蒙古大学学报 (自然然科学版) . 2003 ,34 (2) :192～195
[15 ] 　卞　坡 ,苏明杰 ,陈林海 ,等. 不同离子剂量介导外源薄荷全 DNA
转化对拟南芥菜生长发育的影响. 激光生物学报. 2003 ,12 (5) :
332～336
(上接第 127 页)
参考文献 :
[ 1 ] 　Hess D , Dressler K, Nimmrichter R , et al . Transformation experiments
by pipetting agrobacterium tumefaciens into the Spikelets of wheat . Plant
Sci ,1990 ,72 :233～244
[ 2 ] 　Cheng M , Joyce E F , Pang S Z ,et al . Genetic transformation of wheat
mediated by agrobacterium tumefaciens . Plant Physiol ,1997 ,115 :971～
980
[ 3 ] 　吴关庭 ,胡张华 ,等. 农杆菌介导高羊茅遗体转化体系的建立. 核
农学报 ,2005 ,19 (6) :340～346
[ 4 ] 　潘事君 ,戴良英 ,等. 农杆菌介导籼稻转化体系的优化. 核农学
报 ,2006 ,20 (4) :263～268
[ 5 ] 　张桂芳. 稗草 C4 关键酶基因的克隆及其对水稻和烟草的遗传转
化. 中国农业大学博士学位论文 ,2005
[ 6 ] 　Mtuashige T ,Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays
with tobacco tissue cultures. Physiol Plant ,1962 ,21 :473～479
[ 7 ] 　王永勤 ,肖兴国 ,张爱民. 农杆菌介导的小麦遗传转化几个影响
因素的研究. 遗传学报 ,2002 ,29 (3) :260～265
[ 8 ] 　王翠亭 ,卫志明. 根癌农杆菌介导小麦幼胚遗传转化的影响因
素. 植物生物化学与分子生物学 ,2003 ,29 (6) :521～529
[ 9 ] 　Xia G M , Li Z Y, He C X ,et al . transgenic Plant Regeneration from
wheat ( Triticum aestivum L. ) mediated by Agrobacterium tumefaciens.
Acta phytophysiologica Sinica ,1999 ,25 (1) 22～28
[10 ] 　王关林 ,方宏筠. 植物基因工程. 北京 :科学出版社 ,1998. 585～
586 ,598
[11 ] 　杨成丽 ,刘树楠 ,周吉源 ,刘德立. 高效烟草遗传转化体系的建立
及甜蛋白基因的导入. 生物技术 ,2004 ,14 :9～11
[12 ] 　李尚中 ,李　唯 ,李 　胜 ,等. 小麦胚性愈伤组织诱导研究. 甘肃
农业大学学报 ,2004 ,39 (2) :136～140
[13 ] 　周潺水 ,黄益洪 ,朱作为 ,等. 低浓度 2 ,42D 及外源激素诱导小麦
体细胞快速成苗. 江苏农业学报 ,2002 ,16 (3) :139～142
[14 ] 　王爱萍 ,董　琦 ,尹　钧. 小麦幼胚离体培养条件的优化研究. 山
西农业大学学报 ,2004 ,24 (1) :18～24
131Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2007 ,21 (2) :128～131
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net