全 文 ：此文于 1999 年 3 月 26 日收到。
利用胚珠培养技术培育棉属
种间杂种植株的研究
时香玉　高国强　苏学合　朱斗北　陈　晓
(山东省农业科学院原子能农业应用研究所　济南　250100)
崔　萍
(山东省教育学院　济南　250013)
本研究利用陆地棉 ×中棉、陆地棉 ×海岛棉、独秆突变体 ×海岛棉、海岛棉 ×中
棉杂交 ,进行胚珠培养 ,获得种间杂种植株。结果表明 :这 4 个杂交组合均获得一定
频率的胚 (包括成熟胚和不成熟胚)及成熟胚萌发的苗 ;同一组合的杂种胚珠 ,在不同
培养基上获得的胚和成熟胚的频率不同 ;不同组合的杂交胚珠 ,在同一培养基上培养
的结果有明显差异 ;进行杂种胚珠培养的适宜时期为授粉后 4～6d ,2d 的胚珠培养易
产生愈伤组织 ,成胚率低 ,8d 后幼胚败育或落桃 ;适合杂种胚珠早期生理条件的培养
基为 : B T 基本培养基 + N H4Cl 1000mg/ l + IAA 115mg/ L + KT 012mg/ L + GA
0106mg/ l ;氨态氮能提高成胚率 ;单一的培养基不能满足杂种胚珠的培养需要。
关键词 :棉花 　远源杂交 　不亲和性 　胚珠离体培养 　杂种植株
多年来 ,棉花工作者一直想把具有抗逆、抗虫、抗病和耐盐等性状的野生种与具有高产、优
质等性状的栽培品种结合起来 ,但由于远源杂交的不亲和性难以成功。1935 年 ,Skovstel 曾将
剥去种皮的杂种胚放入人工培养基上进行培养 ,获得了戴维逊氏棉和斯笃克氏棉两个野生棉
种 F1 代杂种植株。J1O1Beasley[1 ,2 ]进一步把四倍体栽培棉种和二倍体栽培棉种不同组合的
种间杂交种子剥去种皮的胚培养成苗。Stewart 和 Hsu[3 ]把四倍体棉种与二倍体棉种杂交后
两天的许多组合的胚珠 ,在液体培养基上培养成杂种植株。以后 J1R1Mauney[4 ] ,Refaat M. [5 ]
和中国的科学家陈志贤、张献龙、胡绍安等[5～12 ]用棉属种间杂种胚珠进行离体培养也获得了
杂种植株。棉花胚珠培养的成功为克服棉属杂种胚的败育提供了一条极为有效的途径 ,并且
被应用到棉花远源杂交的育种工作中。本研究拟利用胚珠培养技术培养陆海杂交胚珠 ,创造
陆地型长绒棉新种质 ,加速育种进程。
1 　材料和方法
111 　杂种组合材料
陆地棉 (中棉 12) ×中棉、陆地棉 (中棉 12) ×海岛棉 (吉扎 69) 、独秆突变体 (90207 ×中棉
40kLad) ×海岛棉 (吉扎 69) 、海岛棉 (吉扎 69) ×中棉进行杂交组合 ,分别以 H1、H2、H3、H4 表
842 　核 农 学 报　1999 ,13 (4) :248～252Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
示。观察杂交铃的发育并定期取材料。
112 　材料处理
分别取杂交后 2、4、5、8d 的幼铃流水充分洗铃 ,011 %HgCl 表面消毒 ,无菌水冲洗 ,无菌条
件下剥出胚珠 ,分别接种在预先设计好的不同培养基上。
113 　培养基
采用 Beasley and Ting[2 ]设计的 B T 培养基为基本培养基 ,附加 IAA、KT、GA 和不同浓度
的 N H +4 离子、水解络蛋白 ,以适应不同阶段的杂种胚珠的营养需要。
114 　培养条件
接种与培养基的杂种胚暗培养 85～90d ,温度为 28 ±2 ℃,然后置光下培养 1 个月 ,光周期
16/ 8h ,一部分杂种胚萌发长成幼苗 ,将未萌发的全部胚无菌条件下解剖培养 ,观察胚发育情况
并进行统计。
2 　结果和分析
211 　杂交亲本不同对胚珠的数量和杂种胚的生长程度的影响
由表 1 看出 4 个杂交组合中 ,陆地棉为母本与中棉和海岛棉杂交 ,每 10 个棉桃的胚珠数
比 H1 和 H2 比 H3 和 H4 多 ,而且授粉后时间越长胚珠变少。另外在接种前还观察到陆地棉
为母本的组合具有 4 个或者 5 个心室 ,而另外两组合具有 3 个或 4 个心室。
表 1 　不同亲本组合和棉铃对杂种胚生长发育的影响
Table 1 　Effect of different cross making and periods of
cotton boll on development of hybrid embryos
杂交组合
Cross
making
2d
接种胚珠
数 (个)
Number
of plant
ovules
愈伤率
( %)
Rate
of
callus
发育胚
( %)
Rate of
matured
embryo
4d
接种胚珠
数 (个)
Number
of plant
ovules
愈伤率
( %)
Rate
of
callus
发育胚
( %)
Rate of
matured
embryo
5d
接种胚珠
数 (个)
Number
of plant
ovules
愈伤率
( %)
Rate
of
callus
发育胚
( %)
Rate of
matured
embryo
8d
接种胚珠
数 (个)
Number
of plant
ovules
愈伤率
( %)
Rate
of
callus
发育胚
( %)
Rate of
matured
embryo
H1 192 43 3 160 11 3915 172 617 4113 93 0 1315
H2 166 38 517 182 916 43 136 315 5310 138 0 1617
H3 116 56 0 130 33 215 85 1214 311 105 111 116
H4 113 18 0 117 20 111 159 913 118 78 0 111
注 :1) H1 :陆地棉 (中棉 12) ×中棉 G1 hi rsutum ×G. arboreum ; H2 :陆地棉 (中棉 12) ×海岛棉 (吉扎 69) G. hi rsutum ×G. B arbadense ; H3 :独
秆突变体 (90207 ×中棉 40kLad) ×海岛棉 (吉扎 69) G1 M utant of single stem ×; G. barbadense; H4 :海岛棉 (吉扎 69) ×中棉
G1 barbadense ×G. arboreum
2)每处理取 10 个棉桃的胚珠 . Ovules from 10 cotton bolls were taken for each treatment.
　　授粉 2d 的胚珠培养易产生愈伤组织 ,发生频率高达 56 % ,完全胚发育频率极低 ,棉胚珠
生长到早 2 叶期停止发育。培养 5～6d 龄胚珠取得较高频率的完全胚发育 ,达 53 % ,并产生
正常幼苗。8d 后的杂种胚在培养过程中 ,逐步褐化死亡 ,空胚和死胚较多 ,成胚率很低。
由此可见胚培养虽然能抢救杂种胚 ,但胚体很小时易产生愈伤组织 ,要求的培养条件比较
严格 ,不易获取完全胚。如果取材时间过晚 ,杂交胚珠得不到营养 ,发生败育死亡 ,造成胚抢救
无效 ,所以胚珠培养的时机极为重要。
942　4 期 利用胚珠培养技术培育棉属种间杂种植株的研究
212 　4 个遗传型杂交组合在不同培养基上的成胚情况
试验结果表明 ,杂交胚培养在不同的培养基上获得胚的频率不同 ,开始培养在 B T2Ⅱ培养
基上成胚率在 4 种组合中都比开始培养在B T2Ⅰ培养基上高 (见表 2) 。从遗传型上看 ,同一杂
交组合的胚珠在不同的培养基上获得胚的频率有明显差异 ,在成胚率高的培养基上 ,萌发胚也
高。而且不同的组合 ,在同一培养基上获得胚的频率差别更大。
表 2 　4 种遗传型在不同培养基上成胚频率(授粉 5d)
Table 2 　Rate of embryo2bearing ovules of different genotypes on
different media (5 days after pollination)
培养基
Medium
考察项目
Investigated item
H1 H2 H3 H4
I 3b
　
　
　
　
　
　
　
　
　
Ⅱ I2b
　
　
　
　
　
　
　
　
考察胚珠个数
Tested embryos 59 90 43 79
成胚率 ( %)
Matured embryos
4113 53 1216 118
死胚率 ( %)
Dead embryos 1119 918 5216 99
萌发率 ( %)
Germinated embryos 1817 2715 118 0
考察胚珠个数
Tested embryos 113 46 42 80
成胚率 ( %)
Matured embryos
4812 6111 18 216
死胚率 ( %)
Dead embryos
914 6 6915 9317
萌发率 ( %)
Germinated embryos 2116 3218 315 111
　注 : Ⅰ:BT 基本培养基 + NH4Cl800 + CH 100 + IAA1 + KT011 + GA0103 (第一种培养基)
Ⅱ:BT 基本培养基 + NH4Cl 1000 + CH 100 + IAA115 + KT012 + GA0106 (第二种培养基)
b :1/ 2BT 基本培养基 + NH4Cl300 + CH 500 + IAA018 + KT011 + GA0101 (单位 :mg/ L)
Ⅰ3b :为在Ⅰ培养基继代培养 3 次 ,转入 b 培养基 ; ⅡI2b 为在 Ⅱ培养基继代培养 1 次 ,转入 I 培养基继代培养 2 次 ,然
后转入 b 培养基。
　Note : Ⅰ:BT medium + NH4Cl 800 + CH100 + IAAI + KT011 + GA0103 (medium No. 1)
Ⅱ:BT medium + NH4Cl 1000 + CH100 + IAA115 + KT012 + GA0106 (medium No. 2)
b :1/ 2BT medium + NH4Cl 300 + CH 500 + IAA 018 + KT 011 + GA 0101 (mg/ L)
Ⅰ 3b :Cultured on medium Ⅰfor 3 times of succeeding , then transferred to medium b. Ⅱ Ⅰ2b :Cultured on medium Ⅱ
for 1 time of succeeding , then transferred to the medium for 2 times of succeeding , finally transferred to medium b.
　　陆地棉和中棉 ( H1) 、海岛棉 ( H2)杂交组合在两种培养基中成胚率分别为 :4113 % ,4812 %
和 53 % ,6111 % ,萌发胚率分别为 :1817 % ,2116 %和 2715 % ,3218 %。陆地棉与海岛棉的杂交
( H2)高于与中棉的杂交 ( H1) 。H3、H4 两种组合成胚率则极低 ,分别为 : 1216 % , 18 %和
118 % ,216 % ,萌发胚几乎为零 ,多为死亡胚。对于胚发育 ,除与培养基的成分有关外 ,与杂交
亲本的生理特性有更大的关系。陆地棉与中棉 ( H1) 、与海岛棉 ( H2)的组合成胚率明显高于独
秆突变品系与海岛棉 ( H3) 、海岛棉与中棉 ( H4) 组合。4 种遗传型的成胚率难易程度为 : H2 >
H1 > H3 > H4。这一点对生产有很大的利用价值 ,栽培品种多为陆地棉 ,具有较多的优良特
052 核　农　学　报 13 卷
性 ,可以吸收海岛棉以及棉属其它种的抗病、抗旱、抗虫等优良特性 ,创造生产上可利用的优良
品种和种质 ,加速育种进程 ,建立良好的育种新体系。
213 　激素浓度对成胚的影响
研究表明 ,激素是影响杂种胚发育、成熟和萌发的重要因素。单独使用生长素 IAA 不如
与 GA、KT 配合使用好 ,有较高的成胚率。IAA 对杂种胚的生长发育有较好的促进作用 ,但畸
形胚率高。激动素 KT 在适宜的浓度下 ,对于胚的发育也有一定的作用。GA 对纤维的生长
发育具有良好的促进作用 ,然而对于胚的发育并无明显作用。过高的 KT、IAA 浓度能使胚珠
产生愈伤组织 ,造成胚抢救失败。但可利用此愈伤组织进行体细胞培养 ,再生植株。
B T 培养基是进行棉花胚珠培养的良好培养基 ,如不加任何生长激素类物质 ,对于胚的发
育就有良好的作用 ,但是所获得的胚或胚萌发的幼苗 ,一般比较瘦弱 ,适当加入生长激素类物
质 ,情况会大大改善。
214 　培养条件对胚和胚萌发频率的影响
研究中发现 ,无单一培养基能满意地保证杂种胚完全发育并再生植株 ,必须采用不同培养
基附加不同浓度铵态氮和水解络蛋白 (CH) ,多次继代。胚珠培养需要长时间的暗培养 ,大约
85～90d。胚珠在 Ⅰ、Ⅱ培养基中暗培养 85～90d ,然后把增大的胚珠转入含 1/ 2 的铵态氮的 b
培养基中培养 20～30d。由表 2 可知 ⅡI2b 处理为 3 种培养基 ,成胚率和萌发率都较高。小部
分胚珠发育完善 ,开始萌发 ,胚根从胚珠内伸出 ,长出两片子叶并展开 ,将这些萌发的胚及时转
入无激素的 SH 生根培养基中培养长成健壮的苗。将所有的未在 b 培养基中萌发的胚无菌条
件下解剖 ,观察胚胎发育情况 ,统计胚发育的比率。并把发育完善的胚转入新的培养基中继续
培养 ,使萌发成苗。
215 　苗移栽
胚在生根培养基上萌发并展开子叶 ,待长出 3～4 片小叶 ,同时有较强的根系时移栽至装
有腐殖土的花盆中 ,罩上塑料袋 ,注意管理 ,保持温度和湿度 ,一星期后去掉塑料袋 ,小苗长出
新叶而成活。
3 　小 　结
胚珠培养在克服棉花种间杂交不亲和性是个有效的办法 ,但是胚培养虽然能抢救杂种胚 ,
但胚体很小 ,难以取出 ,易产生愈伤组织 ,成胚率低 ,难以培养成功。选择 4～6d 胚龄最好 ,这
与别的研究者 2d 胚龄[3 ,7 ,8 ]结果不同。
在杂种胚的培养过程中需不断改善条件和方式 ,调整培养基的附加成分 ,其中氮的浓度和
激素的配比是获得较高频率的成熟胚及促进成熟胚萌发的关键[6 ] 。
陆地棉与其它棉属种杂交培养所获较高的成熟、正常胚 ,这是育种工作者寻求的目标 ,可
以把生产应用的优良品种和具有抗病、抗盐、抗旱及抗逆等特性的野生种杂交 ,转移其有用基
因 ,创造优良新品种和种质 ,加速育种进程。
尽管利用胚珠培养技术在培育棉花种间杂种方面取得较大进展 ,但仍有许多问题存在。
并不是所有的种间杂种都可培养成苗 ,并且成胚率较低 ,所以要不断探讨培养基的成分及激素
的种类和浓度配比 ,以寻找出一种适合多种杂种组合的培养基供棉花胚珠培养。更重要的是
杂种植株的后期工程 ,杂种植株不易开花结果 ,应加强管理。棉花的种间杂种是宝贵的遗传资
152　4 期 利用胚珠培养技术培育棉属种间杂种植株的研究
源和育种材料 ,应及时应用于常规育种 ,发挥棉花基因库的作用。
参 考 文 献
1 　Beasley C A. In vitro culture of fertilized cotton ovules. Bioscience , 1971 , 21 :906～907
2 　Beasley C A and Ting I P. The effects of plant growth substances on i n vit ro fiber development from fertilized cotton ovules.
Amer J Bot . , 1973 ,60 (2) :130～139
3 　Stewart J , McD & Cecilia Lee Hsu. Hybridization of diploid and tetraploid cotton through in ovule embryo culture. J Here.
1978 , 69 :404～408
4 　Mauney J R. The culture i n vit ro of immature cotton embryo. Bot Gaz. 1961 , 122 :205～209
5 　Refaat M , Rossignol L , Demarly Y. Interspecific hybrid Gossypium hi rsut um L . ×G. barbadenseL . Via i n vit ro fertiliza2
tion and ovule culture. Z. Pflanzenzu¨chtg , 1984 , 93 :137～146
6 　陈志贤 ,张淑娥 ,等 1 棉属种间杂种胚珠培养成苗技术改进研究 1 棉花学报 (试刊) ,1985 ,1 :27～23
7 　胡绍安 ,李秀兰 1 棉属二倍体野生棉与四倍体栽培种间杂交的胚珠培养 1 遗传学报 ,1982 ,9 (1) :57～62
8 　张献龙 ,等 1 棉属远源杂交胚珠离体培养研究 1 中国农业科学 ,1988 ,21 (6) :53～58
9 　张献龙 ,等 1 陆地棉×亚洲棉胚胎在培养条件下的发育研究 1 华中农业大学学报 ,1988 ,7 (3) :211～215
10 　张宝红 ,赵宝升 1 棉花生物技术极其应用 1 北京 :中国农业出版社 ,1997 ,103～113
11 　张宝红 ,李秀兰 ,等 1 棉花组织培养研究的现状和前景 1 植物生理学通讯 ,1995 ,31 (1) :56～61
12 　丰嵘 1 胚珠 (内胚)培养和杂种胚败育的抢救 1 陕西农业科学 ,1994 (2) :46～48
STUDIES IN GETTING HYBRIDS PLANTS OF INTERSPECIFIC
HYBRIDIZATION THROUGH OVUL E CULTURE IN VI TRO
Shi Xiangyu 　Gao Guoqiang 　Su Xuehe 　Zhu Doubei 　Chen Xiao
( Instit ute f or A pplication of A tomic Energy , S handong Academy of A gricult ure Sciences , Jinan 　250100)
Cui Ping
( S handong Education College , Jinan 　250013)
ABSTRACT
Ovule culture was made on Gossypium hi rsutum ×G. a rboreum , G. hi rsutum ×G. bar2
badense , G. vc singal stem mutant ×G. barbadense , G. ba rbadense ×G. a rboreum. After 85～
90 days of culture embryos ( including matured and unmatured ones) as well as seedl ing from
matured embryo were obtained from these 4 crosses with a certain frequency. The results of ex2
periment showed that the differences were signif icant bet ween embryo frequency and germina2
tion percentage of embryos with ovule culture on different media and the culture with ovules
from different crosses , and on the same medium the difference was great.
The ovules from hybrids having developed for different days after poll ination were cultured
on BT2Ⅰ, BT2Ⅱmedium in the darkness. Embryo development with a high frequency was ob2
tained with ovules from G. hi rsutum ×G. barbadense and G. hi rsutum ×G. a rboreum 4～6
days after poll ination.
Key words : Incompatibility of interspecific hybridization of cotton , ovule culture i n vit ro ,
hybrid plants
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1999 ,13 (4) :248～252