全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 052778207
高羊茅春化基因 FaVRN1 的克隆与分析
王小利1 ,2 　陈　伟2 　李晚忱1 　吴佳海2 　刘晓霞2 　杨义成2
(11 四川农业大学玉米研究所 ,四川 雅安　625000 ; 21 贵州省草业研究所 ,贵州 独山　558200)
摘 　要 :以高羊茅茎基部组织的 mRNA 为模板 ,引用基于多年生黑麦草 VRN1 基因序列设计的引物 ,进行
RT2PCR 分析 ,同时结合 3’RACE和 5’RACE方法从高羊茅中扩增出 VRN1 基因的全长 cDNA 序列 ,命名
为 FaVRN1。该序列 cDNA 全长 1222bp ,具有完整的开放阅读框 (ORF ,152～889bp) ,编码蛋白为 245 个
氨基酸 ,具有典型的 MADS 盒和 K2盒结构域 ,有许多磷酸化位点。与其他禾本科植物的春化基因蛋白
产物比较 ,具有高度的保守性 ,氨基酸序列的同源性都在 90 %以上。
关键词 :高羊茅 ;春化基因 ;克隆 ;生物信息学
CLONING AND CHARACTERIZATION OF VERNALIZATIONAL GENE Fa VRN1 FROM TALL FESCUE
WANG Xiao2li1 ,2 　CHEN Wei2 　LI Wan2chen1 　WU Jia2hai2 　LIU Xiao2xia2 　YANG Yi2cheng2
(11Maize research institute , Sichuan Agricultural University , Ya’an Sichuan 625000 ; 21 Guizhou Institute of Prataculture , Dushan Guizhou 558200)
Abstract :A VRN1 of cDNA from tall fescue had been identified by RT2PCR ,3’RACE and 5’RACE methods , and designated
as FaVRN1. Sequence analysis showed that it was 1222bp long containing a single open reading frame (ORF ,152～889bp) ,
encoding a protein of 245 amino acids. It had two conserved domains of MADS box , K box and many phosphorylation sites. It
showed extensive similarities to the known VRN1 of gramineous plants , amino acids sequence of VRN1 was more than 90 %.
Key words : tall fescue ; vernalizational gene ; cloning ; bioinformatics
收稿日期 :2009202217 　接受日期 :2009203225
基金项目 :黔农科合 (人才) 08007 号 ,黔科合 J 字[2008 ]2094 号 ,黔科合 NY字[2008 ]3070 号
作者简介 :王小利 (19772) ,男 ,甘肃镇原人 ,在读博士 ,专业方向为生物化学与分子生物学。Tel : 085423231250 ; E2mail : wangxiaolizhenyuan @1261com
通讯作者 :李晚忱 (19582) ,男 ,四川自贡人 ,博士 ,教授 ,专业方向为作物遗传育种与生物技术。E2mail : aumdyms @sicau. edu. cn　　在植物的生命周期中 ,成花转变是产生后代和物种延续关键的一步。而植物开花由环境条件和自身的发育调节所控制 ,这种调控机制是由植物体内一个精细的信号调控网络所产生[1 ] ,对拟南芥的研究为植物成花的信号机制及成花转变的遗传控制网络提供了基础理论。植物成花转变由 4 个主要代谢途径组成 :即春化、光周期、自发及赤霉素途径[2～4 ] 。其中春化是植物暴露在寒冷的气候条件下所形成的开花诱导代谢途径。目前 ,对小麦等农作物的春化途径研究已取得了很大进展 ,Yan 等[5 ] 在六倍体小麦和二倍体小麦中通过图位克隆方法鉴定出小麦春化基因 VRN1 ,它对植物的开花诱导很重要 ,编码一个诱导植物开花的MADS 盒转录因子 , 与拟南芥的开花诱导基因 A PTALA1 ( A P1)具有序列相似性 ,在需要春化处理的二倍体小麦中 ,VRN1 基因是在春化处理后才开始表达 ;但在不需要春化处理的二倍体小麦中 ,VRN1 基因呈现组成性表达。Jensen[6 ] 等在序列同源性的基础上从多年生黑麦草中克隆出 VRN1 基因 ,命名为 LpVRN1 ,它的表达模式与小麦中的 VRN1 表达模式相似[7 , 8 ] 。高羊茅是一种优良的多年生冷季型草种 ,在世界温带地区广泛分布 ,既可作为牧草种植 ,也可用作草坪草。因此 ,高羊茅遗传改良对发展草坪业和畜牧业具有十分重要的意义。由于它是一个异缘六倍体 ,基因组组成很复杂 ,所以国内外对其分子生物学的研究报道很少[9～12 ] 。本研究利用黔草 1 号高羊茅品种进行了高羊茅春化基因 FaVRN1 克隆 ( GenBank 登录号 :
877　 核 农 学 报　2009 ,23 (5) :778～784Journal of Nuclear Agricultural Sciences
FJ793194) ,旨在通过对该基因的克隆及序列分析 ,为
通过基因工程手段延迟或抑制高羊茅开花转变 ,拓展
高羊茅的营养生长期 ,培育新的牧用型或坪用型高羊
茅新品种提供物质基础。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　牧草 　牧草材料取自贵州省草业研究所独山
试验基地牧草资源圃内 ,为贵州省草业研究所 2005 年
育成的国家牧草新品种 (登记号 :299) 。
11112 　宿主菌和质粒 　大肠杆菌 DH5α感受态细胞购
自天根生化 (北京 ) 有限公司 , 克隆载体 pMD192T
Vector 购自宝生物工程 (大连)有限公司。
11113 　酶和主要试剂 　RNA 提取试剂盒 ( TaKaRa
RNAiso Reagent ) 、RNA 反 转 录 试 剂 盒 ( TaKaRa
PrimeScriptTM RT2PCR Kit ) 、3’RACE 试剂盒 ( 3’2Full
RACE Core Set Ver. 210) 、5’RACE 试剂盒 ( TaKaRa 5’2 Full RACE Kit) 、DNA Marker DL2000、LA Taq 酶均购自宝生物工程 (大连)有限公司 ;琼脂糖 DNA 回收试剂盒购自Omega Bio2Tek Inc ;酵母提取物、蛋白胨、琼脂糖购自 Oxoid Inc ;X2gal、IPTG、Ampicillin 购自北京索莱宝科技有限公司。11114 　引物 　引物由宝生物工程 (大连) 有限公司合成。使用 Jensen[6 ]等基于黑麦草 VRN1 基因序列设计的引物 ,Ergon 等[13 ]成功地从草地羊茅中克隆出 VRN1基因序列 ,本文命名为 FaVRN12fwd1、FaVRN12rev1 ,本试验将此引物作为特异引物进行 RT2PCR ,根据扩增得到的特异序列 ,使用引物设计软件 Primer Premier 5100设计一对内引物 , 在文中命名为 FaVRN12fwd2、FaVRN12rev2 ,然后将 FaVRN12fwd1 、FaVRN12fwd2 和FaVRN12rev1、FaVRN12rev2 作为上下游的内外引物与3’RACE 和 5’RACE 试剂盒中的引物相结合进行套式PCR。引物序列及在各个扩增反应中相互之间的组合见表 1。
表 1 　扩增 FaVRN1 基因 cDNA序列所用的引物及引物之间在各扩增反应中的组合
Table 1 　PCR primers for amplification of cDNA sequence of FaVRN1 gene and combination of primers
in amplification reaction
扩增类别
amplification sort
引物
primer
引物序列
primer sequence (5′23′) 长度length
特异扩增
specific amplification
FaVRN12fwd1
FaVRN12rev1 5′2TCTCCTCTTCTTCCCCACTG23′5′2AGTCGGTTGCGAACTCGTAG23′ 319bp
3′RACE
FaVRN12fwd1
3′RACE Out Primer
FaVRN12fwd2
3′RACE Inner Primer
5′2TCTCCTCTTCTTCCCCACTG23′
5′2TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT23′
5′2GGCTGGATTAGGGTTTGGGCTGCT23′
5′2CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG23′ 1159bp
5′RACE
FaVRN12rev1
5′RACE Out Primer
FaVRN12rev2
5′RACE Inner Primer
5′2AGTCGGTTGCGAACTCGTAG23′
5′2CATGGCTACATGCTGACAGCCTA23′
5′2GGAGAAGGTGA CCTGGCGGTTGAT23′
5′2CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG23′ 255bp
112 　方法
11211 　高羊茅总 RNA 提取及纯度测定与完整性检测
　2008 年 3 月 12 日 ,在贵州省草业研究所牧草资源圃
内 ,剪取高羊茅茎基部 1～2 cm ,液氮速冻后用总 RNA
提取试剂盒进行提取。取 RNA 5μl ,加入 1995μl TE ,
分别在 260、280 和 320 nm 测定 OD 值。计算 OD260 与
OD280的比值与 RNA 浓度。用 112 %的琼脂糖凝胶电泳
检测 RNA 的完整性。操作步骤如下 :用 1 ×TAE 缓冲
液制备 112 %的琼脂糖凝胶。然后取 2μg 的 RNA ,加
DEPC水稀释至 10μl。在 65 ℃加热 5 min。短暂离心
将样品聚集在管的底部。添加 1μl 的 10 ×上样缓冲
液 (50 %甘油 ,1 mmolΠL EDTA ,0125 %溴酚兰 ,0125 %二 甲苯腈蓝乙酸) ,然后将样品加到样品槽中。在 90V电压下电泳 115 h ,将电泳结束的凝胶在 EB (015μgΠml的水溶液)溶液中染色 20 min。在凝胶成像系统上拍照 ,检查 RNA 降解的迹象或者 DNA 污染。11212 　高羊茅 FaVRN1 基因全长的 cDNA 克隆 　以Oligo (dT)为引物 ,取总 RNA 3μg ,按照 cDNA 合成试剂盒的操作说明合成 cDNA 第一链 ,再按照以下 PCR 反应体系与反应程序进行 PCR 扩增 ,反应体系 :反转录反应液 2 μl ; 10 ×PCR Buffer (Mg2 + ) 5 μl ; MgCl2 ( 25mmolΠl) 3μl ;dNTP Mixture (215 mmolΠl each) 4μl ; TaKaRaTaq 酶 (5UΠμl ) 0125μl ;上游引物 ( FaVRN12fwd1) (20μmolΠL) 1μl ;下游引物 ( FaVRN12rev1) (20μmolΠL) 1μl ;
977　5 期 高羊茅春化基因 FaVRN1 的克隆与分析
ddH2O 33175μl , PCR 反应的总体积为 50μl。扩增程
序 :95 ℃预变性 2 min ,然后 94 ℃变性 30 s ; 55 ℃退火
30 s ;72 ℃延伸 30 s ,30 个循环。使用琼脂糖 DNA 回收
试剂盒回收目的片段 ,以 T 载体法克隆 PCR 产物 ,将
阳性克隆送宝生物工程有限公司测序 ,测序结果经
BLAST检索序列数据库 ,确定所克隆的序列为高羊茅
VRN1 基因的编码序列。根据对 RT2PCR 片段的序列
测定结果 ,设计并合成 FaVRN12fwd2 和 FaVRN12rev2 ,
分别用于克隆 cDNA 的 5′和 3′端的序列。3′RACE 与
5′RACE具体步骤均按照其说明书进行 ,PCR 产物回收
后经 T载体克隆、测序、并与已克隆的 VRN1 基因序列
使用DNAMAN 软件进行拼接 ,得到全长的 cDNA 序列。
11213 　高羊茅 FaVRN1 基因编码蛋白质 FaVRN1 功能
分析 　利用 DNAMAN 分析软件进行序列拼接 ,使用
Clustal W ( http :ΠΠwww. ebi . ac. ukΠToolsΠclustalw2Πindex.
html)进行氨基酸序列同源性分析 ,构建植物 VRN1 系
统进化树 ;联网 (http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. govΠgorfΠgorf .
html) 寻找开放阅读框 ,利用网站 ( http :ΠΠcn. expasy.
orgΠtoolsΠprotparam. html) 预测其相对分子量和等电点 ;
通过 ExPASy ( http :ΠΠwww. expasy. orgΠcgi2binΠprotscale.
pl) 进行蛋白质的疏水性分析 ,输入 http :ΠΠwolfpsort .
seq. cbrc. jpΠ进行亚细胞定位分析 ;通过蛋白质结构功
能域分析网站 (http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. gov ΠstructureΠ
cddΠwrpsb. cgi)进行蛋白质结构功能域的分析 ,运用丹
麦科技大学在线分析软件 NetPhos 210 Server 和
NetPhos 110 ( Serverhttp :ΠΠwww. cbs. dtu. dkΠservicesΠ) 预
测磷酸化位点。申请 GenBank 新基因登录号。
2 　结果与分析
211 　RNA 纯度与完整性检测
经OD 值检测发现 ,提取的总 RNA 样品 OD260 与
OD280的比值均在 1180 左右。琼脂糖凝胶电泳检测发
现 ,28S 与 18S 两条带清晰可见 (图 1) ,无 DNA 污染的
迹象 ,说明提取的 RNA 样品纯度高 ,完整性好 ,没有发
生降解与 DNA 污染。
212 　高羊茅 FaVRN1 基因的克隆和分析
使用引物 FaVRN12fwd1、FaVRN12rev1 进行 RT2
PCR ,扩增后获得了 1 条长 319 bp 的产物 (图 2) ,进行
T2Vector 克隆测序。测序结果经 BLAST 检索序列数据
库发现 ,该序列与小麦、毒麦、多年生黑麦草 VRN1 基
因的同源性为 90 % 以上 , 确定该片段为高羊茅
FaVRN1 基因的序列片段 ,利用该序列设计 1 对内引
物 ,与 3′RACE和 5′RACE试剂盒中的引物相结合进行
图 1 　RNA 完整性检测
Fig. 1 　Identification of RNA integrality
M:DL2000 Marker ; 1 : 28S与 18S条带
M:DL2000 Marker ; 1 : 28S and 18S fragments
图 2 　FaVRN1 基因的 cDNA RT2PCR 扩增产物
Fig. 2 　The RT2PCR amplification product
of FaVRN1 gene
M:DL2000 Marker ; 1 :PCR 扩增片段
M:DL2000 Marker ; 1 : fragments of PCR amplification
套式 PCR ,用于克隆该基因的 5′和 3′端序列。经 3′
RACE与 5′RACE分别获得了大小为 1159 和 255 bp 的
PCR产物 (图 3 ,图 4) 。克隆测序后发现 ,5′和 3′端序
列与已测序的高羊茅 FaVRN1 基因扩增片段有重叠 ,
为 FaVRN1 基因 mRNA 的 5′和 3′端序列 ,3 个序列经
DNAMAN 软件拼接后得到了高羊茅 FaVRN1 基因完整
的 cDNA 序列 (图 5) ,全长 1222bp。GenBank 登录号为
FJ793194。
213 　高羊茅 FaVRN1 基因编码蛋白质的分析
通过网站 ( http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. govΠgorfΠgorf .
html)分析高羊茅 FaVRN1 基因 cDNA 全序列 ,发现 1
个完整的开放阅读框 ,起始密码子在 152 位 ,终止密码
子在 889 位 ,推测编码蛋白含有 245 个氨基酸 (图 5 ,图
6) 。在网站 ( http :ΠΠcn. expasy. orgΠtoolsΠprotparam. html)
预测其相对分子量为 28112kD ,等电点 pI = 9106。经网
站 (http :ΠΠwolfpsort . seq. cbrc. jp) 进行亚细胞定位分析 ,
087 核　农　学　报 23 卷
　　　
图 3 　FaVRN1 基因 3′RACE扩增产物
Fig. 3 　The 3′RACE product of FaVRN1 gene
图 4 　FaVRN1 基因 5’RACE扩增产物
Fig. 4 　The 5′RACE product of FaVRN1 gene
图 5 　高羊茅 FaVRN1 基因的 mRNA 组织结构
Fig. 5 　The structure of mRNA of tall fescue FaVRN1 gene
发现该蛋白定位于细胞核 ,这与 FaVRN1 基因编码 1
个诱导植物开花的 MADS 盒转录因子相符合。利用
ExPASy 的 ProtScale 软件和对 FaVRN1 蛋白进行疏水性
分析显示 :该基因表达的蛋白在第 35 位、第 50 位氨基
酸属于疏水区 ,富含疏水性氨基酸 (图 7) 。
214 　高羊茅 FaVRN1 基因编码的蛋白质功能分析
通过网站 ( http :ΠΠwww. ncbi . nlm. nih. govΠstructureΠ
cddΠwrpsb. cgi)进行保守结构域功能分析 ,发现该蛋白
具有 MADS 盒和 K盒结构域 (图 8) ,分别位于第 1～75
和 76～175 位 ,MADS 盒结构属于类型 ⅡMADS 盒蛋
白 ,与 DNA 结合 ,以异源和同源二聚体的形式存在 ,在
MADS盒结构域中 ,存在着 DNA 结合位点 ,其 N2末端
和α1 螺旋与 DNA 的大沟和小沟相互作用 ;还有磷酸
化位点 ,增强了转活化潜力和与 DNA 的亲合力 ;也有
二聚体作用界面 ,在形成的二聚体中 ,α2 螺旋垂直于β
片层 ,β片层为两个α1 螺旋之间提供了大量的相互作
用力 (图 9) 。K盒结构域位于 MADS 盒结构域的下游 ,
可能形成一种卷曲螺旋结构 ,对多聚体的形成具有可
能的作用。NetPhos 210 Server 预测 FaVRN1 编码蛋白
有以下的基序 :13 个丝氨酸磷酸化位点 (位于氨基酸
残基 22、26、74、82、135、141、144、160、193、195、197、
198、218) ,1 个苏氨酸磷酸化位点 (位于氨基酸残基
188) (图 10) 。NetPhosK 110 Server 预测特异性蛋白激 酶的磷酸化位点 : PKA 位于氨基酸残基 22 位 (0193) ,这可能与 FaVRN1 基因在春化诱导的成花转变中应答环境条件有关系 ,因为蛋白质的磷酸化与脱磷酸化反应在细胞信号的传递过程中占有及其重要的作用 ,对外界环境信号具有级联放大的作用 ,同时也保证了外界环境对细胞的持续作用[14 ] 。215 　植物 VRN1 基因的同源性分析将高羊茅 FaVRN1 蛋白与其他植物进行同源性比较发现 ,它与多年生黑麦草、毒麦、大麦、六倍体小麦、二倍体小麦、圆锥小麦 VRN1 氨基酸序列的一致性水平及同源水平均在 90 %以上 ,从 DNAMAN 软件构建的系统进化树可以看出 (见图 11) ,高羊茅在亲缘关系上与多年生黑麦草、毒麦的进化关系最近 ,并且分化较晚 ,而草地羊茅分化较早 ,与高羊茅进化关系较远。研究表明[15 ] :高羊茅是由 3 个染色体组组成的异缘六倍体 (PPG1G1G2G2 ,2n = 6x = 42) ,起源于栽培物种草地羊茅与另一个产于阿尔卑斯山区的四倍体野生物种蓝羊茅杂交。它的 P 染色体组被认为来自草地羊茅[16 ] 。但在以植物 VRN1 蛋白构建的系统发育树中 ,它们的进化关系却较远 ,这可能是羊茅属内种系发展演化剧烈 ,并且高羊茅是异花授粉植物和高度的自交不亲和 ,使得高羊茅在进化过程中产生了广泛的遗传变异 ,与
草地羊茅的进化关系越来越远。
187　5 期 高羊茅春化基因 FaVRN1 的克隆与分析
图 6 　FaVRN1 基因的 cDNA 序列及由其推测的蛋白质序列
Fig. 6 　The cDNA sequence of FaVRN1 gene and its deduced protein sequence
方框中序列为引物结合序列
The sequences in frames combined by primers
图 7 　FaVRN1 蛋白的疏水性分析
Fig. 7 　The hydrophobic cluster analysis of FaVRN1 protein
图 8 　FaVRN1 蛋白的功能结构域分析
Fig. 8 　The analysis of functional domains of FaVRN1 protein
287 核　农　学　报 23 卷
图 9 　MADS盒结构域三级结构
Fig. 9 　Tertiary structure of the MADS2box
图 10 　FaVRN1 蛋白的磷酸化位点预测
Fig. 10 　Prediction of phosphorylation sites of FaVRN1
图 11 　植物 VRN1 系统进化树
Fig. 11 　Phyloenetic tree of plant VRN1
3 　讨论
MADS盒基因编码的转录因子具有 1 个相同的
DNA 结合结构域 (MADS 盒) ,识别相似的目标 DNA 序
列 ,为蛋白质中与 DNA 结合的基元 ,具有结合 DNA 和
形成二聚体的作用 ,它们是植物发育和进化过程中重
要的优良基因[17 ] 。
MADS 盒 基 因 的 名 字 取 自 酵 母 中 的
Minichromosome maintenance1 ( MCM1 ) , 拟 南 芥 中 的
AGAMOUS ( AG) ,金鱼草中的 DEFICIENS ( DEF) 和人类
血清应答因子 ( SRF) [18 ] 。拟南芥是目前了解的最清楚
的植物模式系统 ,已从其体内分离出大多数形态建成
基因 ,并且作了相关的研究 ,具有 40 多个 MADS 盒基
因。这些基因的重要性是通过它们的功能缺失表型及
多样性表达模式来体现的[19 ] 。在开花植物中 ,MADS
盒基因具有很宽范围的功能 ,例如花的形成 (包括生殖
结构的发育) 、控制开花时间及营养生长[20 ] 。这些结
果都引导生物学家去研究在被子植物中控制开花时间
及花形态建成的进化中的 MADS 盒基因的功能 ,从研
究植物 MADS 盒基因中获得的信息可以指导植物育种
学家通过基因工程改变植物的发育进程来为生产服
务。
本研究以高羊茅为材料 ,引用基于多年生黑麦草
VRN1 基因序列设计的引物 ,并利用 3′RACE 与 5′
387　5 期 高羊茅春化基因 FaVRN1 的克隆与分析
RACE 方法获得了高羊茅 FaVRN1 基因的全长 cDNA
序列 ,编码含有保守 MADS 盒结构域的蛋白。至于高
羊茅在春化条件下 ,在由营养生长向生殖生长转变的
过程中 , FaVRN1 基因如何受春化条件的表达调控 ,还
需更进一步的研究。
参考文献 :
[ 1 ] 　Aidyn Mouradov , Frederic Cremer , George Coupland. Control of
flowering time : Interacting pathways as a basis for diversity[J ] . 2002 ,
The Plant Cell (supplement) , S111 - S130
[ 2 ] 　Levy Y Y, Mesnage S , Mylne J S , Gendall , A R , Dean C. Multiple
roles of Arabidopsis VRN1 in vernalization and flowering time control
[J ] . 2002 , Science , 297 : 243 - 246
[ 3 ] 　Mouradov A , Cremer F , Coupland G. Control of flowering time :
Interacting pathways as a basis for diversity[J ] . Plant Cell , 2002 ,14 :
S111 - S130
[ 4 ] 　Putterill J , Laurie R , Macknight R. It’s time to flower : the genetic
control of flowering time[J ] . Bioessays , 2004 ,26 : 363 - 373
[ 5 ] 　Yan L , Loukoianov A , Tranquilli G, Helguera M , Fahima T ,
Dubcovsky J . Positional cloning of the wheat vernalisation gene VRN1
[J ] . 2003 , PANS , 100 : 6263 - 6268
[ 6 ] 　Jensen L B , Andersen J R , Frei U , Xing Y, Taylor C , Holm P B ,
Lubberstedt T. QTL mapping of vernalization response in perennial
ryegrass( Lolium perenne L. ) reveals co2location with an orthology of
wheat VRN1[J ] . Theor Appl Genet ,2005 , 110 :527 - 536
[ 7 ] 　Petersen K, Didion T , Andersern C H , Nielsen K K. MADS2box genes
from Perennial ryegrass differentially expressed during transition from
vegetative to reproductive growth[J ] . J Plant Physiology ,2004 ,161 :439
- 447
[ 8 ] 　Andersen J R , Jensen L B , Asp T , Lubberstedt T. Vernalization
response in perennial ryegrass ( Lolium perenne L. ) involves orthologues
of diploid wheat ( Triticum monococcum) VRN1 and rice ( Oryza sativa)
Hd1[J ] . Plant Molecular Biology ,2006 ,60 :481 - 494
[ 9 ] 　阳文龙 ,刘敬梅 ,刘 　强 ,公衍道 ,赵南明. 高羊茅中一个 DREB
类转录因子基因的分离及鉴定分析 [J ] . 应用与环境生物学报 ,
2006 ,12 (2) :145 - 150
[10 ] 　阳文龙 ,刘敬梅 ,刘　强 ,公衍道 ,赵南明. 高羊茅MAPK基因的克
隆与表达分析[J ] . 西北植物学报 ,2006 ,26 (5) :871 - 877
[11 ] 　吴关庭 ,胡张华 ,郎春秀 ,陈笑芸 ,陈锦清 ,夏英武. 高羊茅 CBF 转
录激活因子基因片段的克隆[J ] . 核农学报 ,2004 ,18 (5) :353 - 356
[12 ] 　Marcel luscher , Urs Honchstrasser , Guido Vogel , et al . Cloning and
functional analysis of sucrose : Suceose 12fructosyltransferase from tall
fescue[J ] . Plant Physiology ,2000 ,124 :1217 - 1227
[13 ] 　Ergon A , Fang C , Aamlid TS , Rognli OA. Quantitative trait loci
controlling vernalisation requirement heading time and number of panicles
in meadow fescue ( Festuca pratensis Huds. ) [ J ] . Theor Appl Genet ,
2006 , 112 (2) :232 - 242
[14 ] 　Su Hwan , KwakSun , Hi Lee. The Requirements for Ca2 + , Protein
Phosphorylation , and Dephosphorylation for Ethylene Signal Transduction
in Piswn sativum L[J ] . Plant Cell Physiology ,1997 ,38 :1142 - 1149
[15 ] 　Seal A G. DNA variation in Festuca[J ] . Heredity ,1983 ,50 :225 - 236
[16 ] 　Humphreys M W , Thomas H M , Morgan W G, et al . Discriminating the
ancestral progenitors of hexaploid Festuca arundinacea using genominc in
situ hybridization[J ] . Heredity ,1983 ,75 :171 - 174
[17 ] 　Purugganan M D , Rounsley S D , Schmidt R J Yanofsky M F. Molecular
evolution of flower development diversification of the plant MADS2box
regulatory gene family[J ] . Genetics ,1995 ,140 :345 - 356
[18 ] 　Riechman J L , Meyerowitz E M. MADS domain proteins in plant
development[J ] . Biol Chem ,1997 ,378 :1079 - 1101
[19 ] 　Busch M A , Bomblies K, Weigel D. Activation of a floral homeotic gene
in Arabidopsis[J ] . Science ,1999 , 290 : 2114 - 2117
[20 ] 　Parcy F , Nilsson O , Busch M A , Lee I , Weigel , D. Agenetic
framework for floral patterning[J ] . Nature ,1998 ,395 :561 - 566
487 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (5) :778～784