全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 022090205
小麦 ×玉米诱导小麦单倍体高效系统的建立
蔡　华1 ,2 　马传喜2 　黄正来2 　乔玉强2 　陆维忠3
(11 安徽科技学院生命科学学院 , 安徽 凤阳　233100 ; 21 安徽农业大学农学院 , 安徽 合肥　230036 ;
31 江苏省农业科学院遗传生理研究所 , 江苏 南京　210014)
摘 　要 :为建立一套高效的小麦 ×玉米单倍体诱导系统用于构建小麦 DH 群体 ,采用杂交后剪穗进行人
工控制环境条件的室内离体培养法和田间常规杂交法诱导小麦 ×玉米单倍体 ,研究了不同培养环境、离
体培养时环境温度、常规杂交法时 T > 10 ℃有效积温对单倍体成胚率和成苗率的影响。结果表明 :就平
均成胚率而言 ,离体培养法 (2316 %) > 常规杂交法 (1811 %) ,获得最高成胚率的环境温度为 21 ℃～
23 ℃,T > 10 ℃有效积温为 188 ℃;就平均成苗率而言 ,离体培养法 (1817 %) 高于常规杂交法 (1511 %) ,获
得最高成苗率的环境温度为 23 ℃,T > 10 ℃有效积温为 188 ℃。并在此基础上建立了一套高效、可靠、重
复性好的小麦 ×玉米单倍体诱导系统。实验还表明大田条件下 ,授粉后 12～14d 的培养时间不宜作为
小麦 ×玉米单倍体剥胚的时间标准 ,而应以授粉后外界环境提供的 T > 10 ℃有效积温作为剥胚的时间
标准可能更准确。
关键词 :小麦 ×玉米 ;单倍体 ;成胚率 ;成苗率
Establishment of High Efficiency System in Wheat Haploid from Wheat ×Maize
CAI Hua1 ,2 　MA Chuan2xi2 　HUNG Zheng2lai2 　QIAO Yu2qiang2 　LU Wei2zhong3
(11Life Science College , Anhui Science and Technology University , Fengyang ,Anhui 　233100 ; 21 College of Agronomy , Anhui Agricultural
University , Hefei ,Anhui 　230036 ; 31 Insititute of heredity , Jiangsu Academy of Agricultural Science , Nanjing , Jiangsu 　210014)
Abstract :In order to establish a set of high efficiency regeneration system of wheat haploid from wheat ×maize which induce
wheat DH groups , factors affecting the frequency of haploid embryo and young plant production , such as culture condition ,
environmental temperature and T > 10 ℃ effective accumulated temperature , etc. , were studied by using both in vitro
cultivation methods in green house and general cross methods in field. The results showed that he average frequency of haploid
production in vitro cultivation ( 2316 %) was higher than that when embryos were cultured by general cross methods
(1811 %) . the frequency was the highest when environmental temperature was 21～23 ℃, accumulated temperature ( T >
10 ℃) was 188 ℃. the average frequency of young plant production in vitro cultivation (1817 %) was higher than which embryo
were cultured in field (1511 %) , the frequency of young plant production was the highest when environmental temperature was
23 ℃, accumulated temperature ( T > 10 ℃) was 188 ℃. As a result , a high efficiency and repetitive regeneration system of
wheat haploid from wheat ×maize was established. Our studies also indicated that haploid embryos should not be peeled in 12
～14d after pollination in order to obtain more embryos , and it is concluded that the accumulated temperature (T > 10 ℃) may
be more accurate as the time standard of peeling embryos after pollination.
Key words :wheat ×maize ; haploid ; frequency of embryo production ; frequency of young plant production
收稿日期 :2005210220
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30270825) ;安徽省教育厅自然科学研究项目 (2006KJ142C)
作者简介 :蔡　华 (19722) ,讲师 ,硕士 ,主要从事小麦遗传育种研究工作 ,Email :ch6732012 @tom. com。马传喜为通讯作者 ,Email :machx @tom. com
09　 核 农 学 报　2006 ,20 (2) :90～94Journal of Nuclear Agricultural Sciences
　　自 Zenkteler[1 ]首先报道小麦与玉米杂交产生小麦
单倍体现象以来 ,许多学者对这种通过远缘杂交诱导
单倍体的方法进行了广泛的研究[2～4 ] 。然而这种诱导
小麦单倍体的方法要真正用之于育种实践 ,首先必须
克服小麦和玉米属间杂交的不亲和障碍 ,并能获得相
对高且稳定的成胚率。常规的田间杂交在胚拯救前 ,
杂种幼胚的生长发育易受外界环境 ,特别是温度变化
的影响。因此 ,授粉后如果能人工创造一个适宜的环
境来诱导单倍体 ,这对于提高并稳定小麦 ×玉米的成
胚率无疑是非常有意义的 ,目前这方面的研究尚少见
报道。本文报道在人工控制环境下离体培养诱导小麦
单倍体 ,研究环境温度和有效积温对小麦 ×玉米产生
单过快却又因胚乳败育 ,营养不良而过早夭亡[5 ] 。因
此 ,授粉后如果能人工创造一个适宜的环境条件来诱
导倍体的影响 ,试图建立一套不受环境温度变化影响
的小麦×玉米高效成胚、成苗系统 ,进而创制出一定规
模的小麦双单倍体 DH(Double Haploid) 群体 ,为小麦的
分子标记研究和标记辅助选择提供遗传育种资源材料。
1 　材料与方法
111 　材料
试验用作母本的普通小麦为 F1 杂交组合安农 2
号ΠS42 (2n = 6x = 42) ,用作父本的玉米为“苏玉糯”(糯
玉米) 、“中北 407”(普通玉米) 和“超甜 S076”(甜玉米)
3 个品种。
112 　试验方法
11211 　田间常规杂交法 　11 - 12 月在冷温室和网室
中分期播种小麦。为保证小麦、玉米花期相遇并使玉
米幼苗能安全越冬 ,12 月至次年 1 月种子经催芽后 ,
在温室中分期播种玉米各品种 ,4 至 5 月于小麦开花
前 2～3d 进行人工去雄 ,套袋隔离 ,开花当日收集新鲜
玉米花粉给去雄的小麦穗逐花授粉 ,5h 后在杂交穗最
上部茎节间注射约 015ml 的 100mgΠL 2 ,42D 溶液 ,24h
后重复注射 1 次 ,12d 后隔日取部分杂交穗 ,剥下膨大
子房 70 %酒精消毒 2min ,011 %升汞表面灭菌 20min ,
无菌水冲洗 3 次 ,在超净工作台上用立体解剖镜解剖
出幼胚 ,接种于 1Π2MS 培养基上 ,先在 4 ℃冰箱中冷藏
2d ,然后转入 25 ℃暗室 ,5～7d 后待幼胚已分化出根和
芽时 ,再移入 25 ℃组培室光照培养至出苗。
11212 　室内离体培养法 　去雄授粉按常规方法进行。
授粉后即剪下杂交穗 ,将穗下部茎杆浸入含 40gΠL 蔗
糖 ,8mlΠL H2 SO3 ,100mgΠL 2 ,42D 混合营养液中离体培
养杂交穗 (温度 20 ℃±1 ℃,光照 3000lx 每天 12h ,相对
湿度 70 %) ,培养 14d 后待穗上子房已充分膨大时 ,取
出杂交穗剥胚 ,经灭菌消毒后将幼胚接种于 1Π2MS 培
养基上进行胚拯救 ,培养方法同田间常规杂交法。
成胚率 = (成胚数Π授粉小花数) ×100 %
成苗率 = (成苗数Π授粉小花数) ×100 %
2 　结果和分析
211 　不同培养环境对诱导单倍体的影响
用超甜 S076 等 3 个玉米品种的花粉分别给小麦
F1 杂交组合 D26 授粉 ,在大田和室内两种不同培养环
境下诱导小麦单倍体。田间常规杂交共授粉 2857 朵
小花 ,获得杂种胚 516 个 ,胚拯救后成苗 432 株 ;室内
离体培养共授粉 1049 朵小花 ,获得杂种胚 248 个 ,胚
拯救后成苗 196 株。从表 1 可以看出 ,不同玉米品种
和小麦杂交的平均成胚率和成苗率都表现为离体培养
法高于常规杂交法。可见控制环境条件的离体培养法
能有效提高小麦 ×玉米的成胚率和成苗率 ,同时
　　　
表 1 　不同培养环境对诱导单倍体的影响
Table 1 　Effect of different culture condition on Frequent of producing embryo
玉米品种
maize breed
田间常规杂交 general cross in filed 室内离体培养 isolated culture in green house
授粉小花数
No. of
spikelet
pollinated
成胚数
No. of
embryos
produced
成苗数
No. of
young plant
produced
成胚率
frequency
of embryo
production ( %)
成苗率
frequency
of young plant
production ( %)
授粉小花数
No of
spikelet
pollinated
成胚数
No. of
embryos
produced
成苗数
No. of
seeding
produced
成胚率
frequency
of embryo
production ( %)
成苗率
frequency
of young plant
production ( %)
超甜 S076
Chaotian S076 767 147 113 19. 2 14. 7 251 71 55 28. 3 21. 9
苏玉糯 Suyunu 1232 225 198 18. 3 16. 1 402 101 81 25. 1 20. 1
中北 407
Zhongbei 407
858 144 121 16. 8 14. 1 396 76 60 19. 2 15. 2
平均成胚率 3 18. 1 15. 1 23. 6 18. 7
Note : 3 means average frequent of producing embryo.
19　2 期 小麦×玉米诱导小麦单倍体高效系统的建立
玉米基因型对单倍体的诱导也具有不同的影响。王广
金[6 ] 、陈新民等[7 ] 也曾报道了不同玉米基因型的小麦
×玉米成胚率差异明显 ,说明小麦玉米杂交后 ,虽然玉
米染色体在细胞分裂的初期即被排除 ,但却不能忽视
其中的某些遗传物质对诱导单倍体的影响 ,因此 ,在实
际操作时 ,选择具有高受精、易成胚的玉米品种非常
重要。
212 　不同有效积温对诱导单倍体的影响
田间条件下 ,为获得高成胚率 ,小麦 ×玉米杂交后
的最佳剥胚时期一般被认为是在授粉后第 12 - 14 天 ,
然而我们最近的实验[5 ] 却表明 ,在温度较低的 11 - 12
月份 ,授粉后 12 - 14d 的成胚率要显著低于授粉后 20d
左右的成胚率 ;而在温度较高的 9 月份 ,授粉后 10 -
11d 的成胚率却最高 ,因此我们认为 ,低温下的长培养
时间和高温下的短培养时间对小麦 ×玉米单倍体成胚
率的增加效应可能与授粉后的有效积温有关。本实验
中 ,对田间常规杂交法 ,自授粉之日起至剥胚之日记录
每天的日平均温度 ,统计 T > 10 ℃的有效积温 ;自授粉
之日后第 12 天起至第 22 天 ,每天收获适量杂交穗剥
胚 ,统计成胚数 ,计算成胚率。
图 1 显示 ,小麦和玉米杂交后 ,成胚率和成苗率在
授粉第 12 - 14 天 ( T > 10 ℃有效积温为 73 ℃～92 ℃之
间)后 ,仍随培养时间的延长而增加 ,直到第 20 天 ( T >
10 ℃有效积温为 188 ℃) 成胚率和成苗率才达到最大 ,
然后又逐渐下降。值得注意的是 ,虽然授粉后 20d 可
获得最高的成胚率和成苗率 ,但此时的胚苗率 (成苗数Π成胚数) 为 5516 % ,不及授粉后第 12 - 14 天 (8313 %
～8915 %) ,这是由于长时间处理后 ,部分已充分发育
的杂种胚因无胚乳营养而败育 ,以致不能出苗 ,因此授
粉后如能控制环境温度使 12 - 14d 的 T > 10 ℃有效积
温稳定在 188 ℃左右 ,则一定既能提高成胚率 ,又能提
高胚萌发成植株的频率 ,为此我们在室内离体培养方
法中 ,研究了授粉后离体培养 14d ,环境温度对小麦 ×
玉米诱导单倍体的影响。
图 1 　有效积温 (T > 10)对诱导单倍体的影响
Fig. 1 　Effect of effective accumulated temperature (T > 10) on haploid induction
213 　不同环境温度对诱导单倍体的影响
小麦和玉米杂交后 ,剪下杂交穗 ,将穗下茎杆插入
营养液 ,分别放至 17 ℃、19 ℃、21 ℃、23 ℃、25 ℃、27 ℃的
光照培养箱 (光照、相对湿度条件同组培室) 中离体培
养诱导小麦单倍体 ,14d 后剥胚进行胚拯救 (方法同
11211)诱导单倍体苗。从图 2 可见 ,在 17 ℃～27 ℃温
度范围内 ,3 个玉米品种与小麦杂交的成胚率和成苗
率均呈现先上升后下降趋势 ,在 21 ℃～23 ℃处成胚率
达到最高 ,在 23 ℃时成苗率达最大。当日平均温度为
23 ℃时 ,至第 14 天的 T > 10 ℃有效积温为 182 ℃,与本
实验中大田条件下获得最高成胚率的 188 ℃有效积温
相近 ,因此可以认为 23 ℃是小麦 ×玉米幼胚离体培养
较适宜的温度。
214 　小麦 ×玉米诱导单倍体高效系统的建立
根据以上实验结果建立了一套普通小麦与糯玉米
远缘杂交的单倍体高效诱导系统。该系统以小麦玉米
杂交后套袋 ,然后剪下杂交穗将茎杆插入含 40gΠL 蔗
糖 ,8mlΠL H2 SO3 ,100mgΠL 2 ,42D 混合营养液中 ,放至
22 ℃±1 ℃培养箱 (光照 3000lx 每天 12h ,相对湿度
70 %)进行离体培养 ,每 3d 更换营养液 1 次 ,离体培养
29 核　农　学　报 20 卷
14d 后取出杂交穗剥胚 ,消毒灭菌后接种于 1Π2MS 培
养基上 ,4 ℃冷藏 2d ,25 ℃暗处理使幼胚分化出根和
芽 ,再揭去覆盖物光照培养至出苗。该单倍体诱导和
再生系统已经过数次的重复 ,各实验的成胚率和一次
成苗率均在 30 %和 20 %左右 ,利用这套系统 ,我们目
前已构建了一定规模的小麦抗、感赤霉病 DH群体。
图 2 　不同环境温度对成胚率的影响
Fig. 2 　Effect of environmental temperature on
frequency of embryo production
图 3 　不同环境温度对成苗率的影响
Fig. 3 　Effect of environmental temperature on trequency
of young plant production
3 　讨论
利用小麦与玉米远缘杂交诱导小麦单倍体 ,经加
倍后第 1 代即可获得纯合的双单倍体 DH 系 ,其自交
后代的遗传结构能直接反映 F1 配子中基因的分离和
重组 ,在较短的时间内就能构建一个理想的遗传作图
群体 ,因而这种方法可有效进行小麦遗传图谱构建、
QTL 定位、多基因聚合育种[7 ] 。此外 ,DH 群体的创建
对于小麦种质资源的拓新[8～10 ] 、品质改良[11 ] 等也具有
重要意义。近年来 ,研究者在克服小麦与属间物种杂
交不亲和障碍的基础上 ,为提高杂种的成胚和成苗率 ,
先后研究了激光处理[12 ] 、重复授粉[13 ] 、冷温室小麦越
冬[6 ]等的积极影响。
Campbell 等[4 ] 把在冷温室中小麦 ×玉米杂交后的
植株移至白天 22 ℃,夜晚 17 ℃的温室 ,获得了近 30 %
的单倍体成胚率 ,但这种方法在大田条件下不能推广
应用。本试验采用小麦与玉米杂交后 ,剪下杂交穗进
行人工控制环境条件的离体培养来诱导小麦单倍体 ,
相比常规田间杂交法 ,平均成胚率由 1811 %提高到
2316 % ,平均一次成苗率也由 1511 %提高到 1817 % ,说
明这种方法对提高并稳定小麦 ×玉米单倍体产生频率
是行之有效的。
本次实验表明 ,小麦和玉米杂交后 ,足够的 T >
10 ℃有效积温是获得高成胚率的必要条件 ,这对于在
大田环境下 ,提高并稳定小麦 ×玉米的成胚率具有一
定的指导意义。即实践中当环境温度下降时 ,为获得
稳定的高成胚率 ,必须延长剥胚时期至其能获得足够
的有效积温 ;而当环境温度升高时 ,为防止发育过快的
杂种幼胚因缺乏营养而夭亡 ,必须缩短剥胚时期至适
宜的有效积温。因此我们认为大田条件下授粉后 12
- 14d 的培养时间不宜作为剥胚的时间标准 ,而应以
授粉后外界环境提供的 T > 10 ℃有效积温作为剥胚的
时间的参照指标可能更准确 ,从本实验的结果来看 ,这
一适宜的 T > 10 ℃有效积温为 188 ℃左右。
环境温度对小麦 ×玉米成胚率具有显著影响[4 ] ,
这是因为在相同时间内 ,低温更能抑制杂种幼胚的形
成 ,或即使形成胚 ,但因体积太小 ,亦难培养成单倍体
苗 ;而高温虽可能促进幼胚的形成 ,但同时又加速杂种
幼胚的生长发育 ,若未及时进行胚拯救 ,最终将使得部
分发育过快的幼胚因在子房内无法获得胚乳的营养而
分化消失。试验中我们确实在一些已干瘪的子房内发
现部分残缺、颜色灰白的杂种胚 ,显然已失去了生活
力。虽然低温环境条件下 (T < 15 ℃) ,可通过延长剥胚
时间至授粉后第 20 天左右来获得可供培养的幼胚 ,但
适宜的日平均温度更能有效地促进小麦 ×玉米成胚。
因而 ,日平均温度可以看作是影响成胚速率的一个重
要因子。从本实验来看 ,获得最高成胚率和成苗率的
环境温度应在 23 ℃左右 (图 2 ,3) 。
同时 ,试验还表明 ,虽然就平均得胚率而言 ,室内
39　2 期 小麦×玉米诱导小麦单倍体高效系统的建立
离体 培 养 法 ( 2316 %) 要 高 于 田 间 杂 交 常 规 法
(1811 %) ,但后者的最高得胚率 (5219 % ,见图 1) 却比
前者 (3411 % ,见图 2)高出近 20 % ,这一结果在本来就
非常困难的小麦 ×玉米远缘杂交系统中是非常令人鼓
舞的。
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关于征集实践八号育种卫星装载育种材料的通知
农业部办公厅、国防科工委办公厅 2006 年 3 月 14 日联合印发了“关于征集实践八号育种卫星装载育种材料
的通知”。根据国家航天育种工程项目总体计划安排 ,为科学合理地安排实践八号航天育种卫星的装载材料 ,广
泛吸收优势科技力量参与航天育种的机理研究工作 ,经研究 ,决定向社会征集实践八号卫星装载育种材料。
有关征集指南、申请条件和申请书等详细内容请点击中国农业科学院作物科学所网站 http :ΠΠicscaas. com. cnΠ
qitaΠ2006031601. htm ,或农业部网站 http :ΠΠwww. agri . gov. cnΠxztzΠt20060316-571432. htm。(刘录祥)
49 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2006 ,20 (2) :90～94