全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 032497204
自组装膜电化学免疫传感器测定甲基对硫磷
许园园　吴雅欣　潘家荣
(中国农业科学院农产品加工研究所 ,农业部农产品加工与质量控制重点实验室 ,北京　100193)
摘　要 :利用自组装技术将三巯基丙酸固定在金电极上 ,以 12乙基232(32二甲氨基) 碳二亚胺盐酸盐
(EDC)和 N2羟基硫代琥珀亚胺 (NHS) 作为活化剂 ,将甲基对硫磷抗体以共价键形式固定在三巯基丙酸
自组装单分子膜修饰的金电极上 ,制备了一种免疫传感器。根据抗体与抗原之间特异反应前后电极电
位的变化对甲基对硫磷进行定量测定 ,该传感器的检测下限为 01085μgΠml ,检测范围为 015～15μgΠml ,并
可以再生、重复利用。
关键词 :甲基对硫磷 ;电化学免疫传感器 ;自组装
SAM ELECTROCHEMICAL IMMUNOSENSOR IN DETERMINATION OF METHYL PARATHION
XU Yuan2yuan 　WU Ya2xin 　PAN Jia2rong
( Institute of Agro2Food Science and Technology , CAASΠKey Laboratory of Agriculture Nuclear Technology
and Agro2Food Processing , Ministry of Agriculture , Beijing 　100193)
Abstract :An immobilization procedure of antibody on gold electrode is proposed and a SAM ( Self2assembled monolayer)
electrochemical immunosensor was prepared. A pretreated gold electrode is first immersed in mercaptopropionic acid solution
for self assembly through the Au2S covalent bond. Then antibody against methyl pararthion is immobilized to prepare the
sensory component . By means of covalent coupling with the activation of 12ethyl232(32dimethyllaminopropyl ) carbodiimide
hydrochloride ( EDC) ) and N2hydroxysulfosuccinimide (NHS) . With the immunosensor , the change of electrode potential was
recorded to determine the amount of methyl parathion ranging from 015～15ugΠml with the detection limit of 01085ugΠml. The
regeneration and repeating characteristics were also studied.
Key words :methyl parathion ; electrochemical immunosensor ; self2assembled monolayer
收稿日期 :2008209202 　接受日期 :2008209224
基金项目 :“十一五”国家高技术研究发展计划 (863) (2006AA10Z449)
作者简介 :许园园 (19852) ,女 ,山东济宁人 ,硕士研究生。研究方向为食品安全检测技术。E2mail :hakuna
-
matata85 @126. com
通讯作者 :潘家荣 (19642) ,男 ,广东高州人 ,博士生导师 ,研究方向为农产品质量与食品安全。Tel : 010262815875 ; E2mail : panjr @263. net　　电化学免疫传感器是指由抗原 (抗体)作为敏感元件 ,电极 (固体电极、离子选择性电极、气敏电极等) 作为转换元件 ,以电势或电流为特征检测信号的传感器。由于电化学免疫传感器既有免疫传感器选择性好、种类多、测试费用低、适合联机化等优点 ,又有电化学体系可实现在体检测、不受样品颜色、浊度的影响 (样品不需复杂预处理 ,不需分离) 、所需仪器相对简单的优点 ,被广泛用于医疗、食品分析、工业生产、环境检测等领域 ,近年来成为生物传感器研究的热点之一[1 ] 。自组装单分子膜 (self2assembled monolayer , SAM) , 是利用固体表面在稀溶液中吸附活性物质而形成的有序分子组织 ,其基本原理是通过固2液界面间的化学吸附或化学反应在基片上形成化学键连接的、取向紧密排列的二维有序单层膜。SAM 从组成结构上可分为三部分 :一是分子的头基 ,它与基底表面上的反应点以共价键 (如 Si2O 键及 Au2S 键等) 或离子键 (如 CO2 -Ag + )结合 ,这是一个放热反应 ,活性分子会尽可能占据基底表面上的反应点 ;二是分子的烷基链 ,链与链之间靠范德华力使活性分子在固体表面有序且紧密地排列 ,相互作用能一般小于 40kJΠmol ,分子链中间可通过
794　核 农 学 报　2009 ,23 (3) :497～500Journal of Nuclear Agricultural Sciences
分子设计引入特殊的基团使 SAM 具有特殊的物理化
学性 质 ; 三 是 分 子 末 端 基 团 , 如 —CH3 , —COOH ,
—OH , —NH2 , —SH , —CH CH2 及 —C ≡CH 等 ,其意
义在于通过选择末端基团以获得不同物理化学性能的
界面或借助其反应活性构筑多层膜。SAM 具有均匀
一致、高密度堆积和低缺陷等特性 ,其制备方法简单且
具有更高的稳定性。由于 SAM 具有牢固有序的优良
性能 ,只要选择末端为羧基或氨基的巯基化合物制成
SAM ,再经活化就能进一步固定各种蛋白[2～4 ] 。三巯
基丙酸可以以 —SH 基团化学吸附在金电极表面自组
装成有序、致密的单层膜。该自组装膜超薄 ,稳定性
好 ,单分子层中的羧基能被 EDC 和 NHS 活化成活泼
酯 ,抗体与单分子层中的活泼酯反应形成酰胺键从而
组装在修饰电极上[5 ] 。本文利用三巯基丙酸自组装膜
法将甲基对硫磷抗体固定在金电极上 ,制备了测定甲
基对硫磷的电化学免疫传感器 ,具有检测时间短、使用
寿命较长等特点。
1 　材料与方法
111 　主要仪器、试剂
CHI400 系列电化学石英晶体微天平 (上海辰华仪
器有限公司) ;小鼠抗甲基对硫磷血清 (本实验室自
制) ;三巯基丙酸 (Alfa 公司) ; 12乙基232(32二甲氨基)
碳二亚胺盐酸盐 EDC (Aldrich 公司) ;N2羟基硫代琥珀
亚胺 NHS (Sigma 公司) ;磷酸盐缓冲溶液 (0101molΠL ,
pH = 714) ,Fe (CN) 6 4 - Π3 - (1mmolΠL) ,实验室用水均为超
纯水。
112 　试验方法
11211 　抗体在自组装膜上的固定化 　将金电极经
011molΠL NaOH和 011molΠL HCl 淋洗 3 次后 ,浸入新配
制的 piranha 溶液 (30 %H2O2∶浓硫酸 = 1∶3) 中 15min。
取出电极经超纯水淋洗 5 次后 ,在超声波清洗器中用
超纯水清洗 3 次 , 每次 5min , 水洗后在 013μm 和
0105μm Al2O3 糊上打磨抛光 ,再依次于双蒸水和无水
乙醇中超声清洗 5min ,氮气干燥备用。将洁净的金电
极放入三巯基丙酸溶液中浸泡 1h ,取出用水清洗 ,氮
气干燥后置于 EDC(1mmolΠL) 和 NHS(4mmolΠL) 混合溶
液中活化 7min ,取出电极 ,用水淋洗 3 次 ,再氮气干燥。
将修饰电极置于 1∶100 稀释的小鼠抗甲基对硫磷血清
中 ,37 ℃下温育 2h ,取出用水洗净备用[6 ] 。
11212 　修饰电极的电化学表征 　利用 CHI400A 型传
感器 ,采用三电极系统 ,分别将裸金电极、三巯基丙酸Π
金电极 ,抗体Π三巯基丙酸Π金电极作为工作电极 ,AgΠ
AgCl 电极作为参比电极 ,铂丝电极作为对电极 ,在含
1mmolΠL Fe (CN) 6 4 - Π3 - 的 0101molΠL pH = 714 的磷酸盐
缓冲溶液中进行电位扫描 ,电位范围为 - 013～017V ,
扫描速度为 100mVΠs ,得出电极的循环伏安曲线。
11213 　免疫传感器对抗原的电位响应　免疫传感器
对甲基对硫磷抗原的检测方法 :以金电极为工作电极 ,
AgΠAgCl 电极作为参比电极 ,铂丝电极作为对电极 ,将
三电极插入到磷酸盐生理缓冲溶液 (pH714) 中测出免
疫电极在稳态时的空白电位 ( E0 ) ,然后将电极插入不
同浓度的甲基对硫磷溶液 ,记录稳定后的电位值 ( E1 ) ,
用 E1 - E0 表示该传感器对不同浓度抗原溶液的响应
值 ,并相对于抗原浓度的对数作标准曲线。
2 　结果和讨论
211 　对金电极固定过程的电化学表征
分别对裸金电极和固定有三巯基丙酸、抗体的金
电极进行了电化学表征 ,结果如图 1 和图 2 所示。从
图中可以看出溶液在裸金电极上有明显的氧化还原
峰 ,峰电流 ia = 81843μA。固定了三巯基丙酸后 ,峰电
流有明显减小 ,ib = 71117μA ,表明 Fe (CN) 6 4 - Π3 - 可以通
过三巯基丙酸膜到达金电极表面进行反应 ,但是由于
在金电极表面层层自组装 ,使得有效截面积减小 ;固定
抗体后 ,抗体一方面堵塞了修饰电极表面更多的孔径
通道 ,另一方面又进一步减小 Fe (CN) 6 4 - Π3 - 向金电极
表面扩散的有限面积 ,从而进一步减小了峰电流 ,ic =
41025μA。
图 1 　裸金电极和 MPA 修饰电极在 Fe (CN) 6 4 - Π3 - + PBS
溶液中的循环伏安图
Fig. 1 　Cyclic V2A curve of Fe3 + ΠFe2 + on
the same Au electrode
a :裸金电极 ;b :MPA 修饰电极。下图同
a :not modified ; b : modified with MPA. The same as in figure 2
894 核　农　学　报 23 卷
图 2 　裸金电极和抗体修饰电极在 Fe (CN) 6 4 - Π3 - + PBS
溶液中的循环伏安图
Fig. 2 　Cyclic V2A curve of Fe3 + ΠFe2 + on
the same Au electrode
c : 抗体修饰电极 ;c :modified with antibody
212 　免疫传感器对游离抗原的响应
抗体是一种蛋白质 ,当溶液的 pH 值高于或低于
抗体的等电点时会使抗体带有负电荷或者正电荷。当
抗原与抗体免疫电极发生特异反应后 ,电极表面的电
荷数量和密度将发生改变 ,这样就引起电荷电位的变
化[7 ] 。Aizawa 认为膜电位的变化与被测物浓度的对数
呈线性关系 (荷电膜机理) ,即当膜两侧为一价离子的
电解质时 ,膜电位主要由表面电位和扩散电位组成 ,当
膜两侧的电解质浓度为一定值时 ,膜电位的变化主要
取决与膜相的固定电荷密度和离子迁移数 ,当膜两侧
的电解质浓度均很小时 ,扩散电位可以忽略 ,则膜电位
主要取决于表面电位 ,即主要与膜电荷密度成正比[8 ] 。
图 3 是电极电位随抗原浓度对数的变化曲线。由
图 3 可以看出 ,电极电位随抗原浓度对数变化呈“S”型
曲线关系 ,取线性部分可得测定标准曲线 ,如图 4 ,回
归方程为ΔE = 01033log[ c (Ag) ] + 01049 , R2 = 01998 ,
线性范围 :015～15μgΠml。
图 3 　电极电位随抗原浓度对数的变化曲线图
Fig. 3 　Curve of the relationship between the potential
change and the logarithm of concentration of methyl parathion
图 4 　电极电位随抗原浓度对数的校正曲线
Fig. 4 　Calibration curve of the relationship between
the potential change and the logarithm of concentration
of methyl parathion
213 　传感器的再生
在电化学传感器中 ,常用一定浓度的酸、碱或高离
子强度的溶液将抗原2抗体间的键和作用解离。为此 ,
我们分别用甘氨酸2HCl 缓冲溶液 (pH218) 、甘氨酸2HCl
+ DMSO(1 %) 、尿素 (810molΠL) 、piranha 溶液作为解离
剂进行了对比。试验发现 :使用甘氨酸2HCl 缓冲溶液
(pH218)作为解离剂时可以使传感器重复使用 4～6
次 ,采用甘氨酸2HCl + DMSO (1 %) 可以重复使用 6～8
次 ,采用尿素可以重复使用 8～10 次 ,piranha 溶液能够
洗脱金电极表面固定的所有的抗原2抗体复合物 ,能够
实现传感器的反复再生 ,但再生后的电极需重新固定
抗体。其中加了 DMSO 的甘氨酸2HCl 缓冲液再生作用
优于不加 DMSO 的甘氨酸2HCl 溶液 ,分析原因可能是
DMSO 是有机溶剂 ,又溶于水 ,可以削弱抗原抗体的键
和力[9 ] 。
214 　检出限的确定及免疫传感器的电位响应性能
为了确定该传感器的检出限 ,用修饰有小鼠抗甲
基对硫磷抗体的电极对不含甲基对硫磷的空白磷酸缓
冲液进行重复测定 15 次 ,其电位值的标准偏差为
010034mV ,将其作为免疫传感器的噪音值 ,取 3 倍噪音
值 (即 010102mV) 作为免疫传感器的最小有效值 ,只有
大于该值的响应值才有检出的电位响应信号[10 ] 。将
010132mV 代入到拟合曲线中 ,其对应的抗原浓度为
01085μgΠml。因此将 01085μgΠml 作为该免疫传感器对
甲基对硫磷抗原浓度的最低检出浓度。
215 　免疫传感器的重现性和稳定性
分别取不同时间、不同批次制备的免疫传感器对
同一浓度的样品标准溶液进行检测 ,结果标准偏差
RSD < 3 %(表 1) ,表明该传感器有较好的重现性。
994　3 期 自组装膜电化学免疫传感器测定甲基对硫磷
表 1 　免疫传感器的重现性
Table 1 　The reproducibility of the immunosensor
抗原浓度
concentration
(μgΠml) 1ΔE(mV) 2ΔE(mV) 3ΔE(mV) 4ΔE(mV) 5ΔE(mV) RSD( %)
1 010482 010461 01047 010479 010475 117
5 010720 010710 01068 010715 010720 213
10 010828 010826 01080 010830 010815 115
15 010891 010880 01089 010877 010865 112
　　稳定性是评价传感器性能好坏的重要指标 ,在本
试验中 ,将修饰好的电极在 4 ℃下干态放置 ,每隔 3～
5d 对同一浓度的甲基对硫磷抗原溶液进行检测 ,结果
表明电位在前 45d 基本保持不变 ,说明该传感器具有
较好的稳定性。
3 　结论
本文利用自组装单分子膜技术 ,将三巯基丙酸固
定在金电极上 ,通过 EDC和NHS 的活化将抗体成功固
定在自组装膜修饰的用三巯基丙酸法对抗体固定操作
简单 ,制备的电化学免疫传感器检测范围宽 ,响应时间
短 ,并可以再生利用。缺点是灵敏度不够高 ,分析原因
是本试验所用抗体为多克隆抗体 ,多克隆抗体的滴度
和亲和性均比单克隆抗体差 ,限制了传感器的灵敏度
与检测限。有报道的用甲基对硫磷单克隆抗体研制出
来免疫传感器检测限可达 0105ngΠml[11 ] 。目前本实验
室单克隆抗体正在制备过程中 ,其应用将大大提高本
文传感器的灵敏度 ,有潜在的应用价值。
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