全 文 ：文章编号 :100028551 (2008) 032334204
甲基对硫磷压电免疫传感技术的初步探讨
卢　澄1 , 2 　潘家荣1 　高志贤2 　姚　伟2
(11 中国农业科学院农产品加工研究所 ,北京　100193 ; 21 天津军事医学科学院卫生学环境医学研究所 ,天津　300050)
摘 　要 :分别利用蛋白 A 法和巯基自组装膜法将抗体固定在压电石英晶体金电极上 ,结果表明巯基自组
装膜法效果更好。在利用巯基自组装膜法固定甲基对硫磷抗体的基础上 ,初步建立了基于直接法和竞
争法的甲基对硫磷压电免疫传感技术并对两种技术作了比较 ,结果表明 ,基于竞争法的压电免疫传感技
术对对硫磷抗原抗体反应的响应频移值较大 ,可提高检测灵敏度 ,降低检测限。
关键词 :压电免疫传感技术 ;甲基对硫磷 ;巯基自组装膜法 ;竞争法 ;直接法
PRELIMINARY STUDY ON A NOVEL PIEZOELECTRIC IMMUNOSENSORS
FOR DETECTION OF METHYL PARATHION
LU Cheng1 ,2 　PAN Jia2rong1 　GAO Zhi2xian2 　YAO Wei2
(11 Institute of Agro2food Science and Technology , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100193 ;
21 Institute of Hygiene and Environmental Medicine , Academy of Military Medical Science , Tianjin 　300050)
Abstract : Two antibody immobilization methods , immunosensory techniques based on direct and competitive methods for
detection of methyl parathion , were compared in order to develop a simple , cheap , rapid , online2detectable and mass2
response2based piezoelectric immunosensor. The results showed that the anti2methyl parathion polyclonal antibody was better
immobilized on the golden electrode of the piezoelectric quartz crystals with sulfhydryl self2assembled layer than SPA method.
Compared with direct method , piezoelectric immunosensor based on competitive method for methyl parathion detection was more
sensitive due to larger frequency shift obtained.
Key words : piezoelectric immunosensor ; methyl parathion ; sulfhydryl self2assembled layer ; competitive detection ; direct
method
收稿日期 :2007209211 　接受日期 :2007212210
基金项目 : :863 国家高新技术研究计划 (2006AA10Z449)
作者简介 :卢　澄 (19832) ,女 ,湖北黄冈人 ,硕士研究生 ,研究方向为食品安全快速检测。E2mail : lucheng1230 @sohu. com
通讯简介 :潘家荣 (19642) ,男 ,博士 ,从事食品安全和生物物理研究。Tel : 010262815875 ; E2mail : panjr @2631net　　甲基对硫磷是一种常见的有机磷农药 ,它不仅被单独使用 , 还常常与氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类农药混配使用[1 ] , 造成环境污染和危害 ,甚至引起急性人畜中毒 ,近年来已被禁止在蔬菜、水果上使用 , 但在农产品的进出口贸易和市场检测中 , 甲基对硫磷仍有一定的检出率 ,有时残留量还很高。例如 ,中山市上市蔬菜中包括甲胺磷、对硫磷、甲基对硫磷等 12 种有机磷农药残留量超标率高达 3011 %[2 ] ;2003 年长春市场销售蔬菜中检出甲基对硫磷、敌敌畏、对硫磷、甲拌磷等 4 种有机磷农药残留 ,其中残留最普遍的是甲基对 硫磷[3 ] 。传统的甲基对硫磷残留分析方法为气相色谱法和液相色谱法 ,这些方法对仪器要求较高 ,耗时长 ,操作繁琐 ,前处理工作复杂 ,难以满足市场准入和监管快速检测的需要[4 ] 。酶联免疫吸附分析 ( ELISA) 是检测甲基对硫磷残留的快速方法 ,但难以进行现场和在线检测。基于质量响应的压电免疫传感器法是近年来发展的快速免疫检测技术之一 ,其结构简单 ,成本低廉 ,快速灵敏 ,可能更适合现场和在线检测。压电免疫传感技术基于直接法 (即将抗体固定在
433　 核 农 学 报　2008 ,22 (3) :334～337Journal of Nuclear Agricultural Sciences
传感器金电极上 ,直接检测样品中抗原物质) ,更适合
大分子抗原检测[5 ,6 ] 。由于甲基对硫磷分子量小 ,基于
直接法检测时引起的晶体频移值较小 ,灵敏度较低。
而基于竞争法 (即 OVA 偶联的甲基对硫磷与游离的甲
基对硫磷竞争与固定的抗体发生反应) 的检测涉及到
甲基对硫磷2大分子偶联物 ,分子量较大 ,抗原抗体反
应引起的频移值较大 ,可提高灵敏度。本试验试图建
立基于直接法和竞争法检测甲基对硫磷的压电免疫传
感技术 ,并对其测定效果进行了比较和分析 ,以为建立
甲基对硫磷快速免疫检测技术提供依据。
1 　材料与方法
111 　仪器与试剂
CHI400 系列电化学石英晶体微天平为上海辰华
仪器厂产品 ;石英晶体基频 71995MHz ,AT 切型 ,双面
抛光 ,直径 1317mm ,中间镀有直径 511mm 的金盘电
极 ;甲基对硫磷纯品购于 Delka 公司 ; 卵清白蛋白
(OVA)购于 Fluka 公司 ;甲基对硫磷多克隆抗体为本所
实验室自制 ,效价 1∶16000 ,浓度 23mgΠL ;金黄色葡萄
球菌蛋白 A(蛋白 A)购于北京本元正阳基因技术有限
公司 ;十六巯基烷基酸 (MHDA) 购于 Fluka 公司 ;l2乙基232(32二甲基氨基丙基)碳二亚胺 ( EDC) 及 N2羟基琥珀
酰亚胺 (NHS)购于 Sigma 公司 ;Piranha 试剂为 3 :1 的浓
H2 SO4 和 H2O2 混合液 ;所用水均为二次水 ,其他试剂
均为分析纯。
112 　抗体的固定化
11211 　蛋白 A 法 　将洗净的石英晶体固定在检测池
中 ,于金电极表面分别滴加 0110、0115、0120、0125 和
0130 mgΠml 的蛋白 A 溶液各 50μl ,37 ℃温育 60min ,用
PBS 和二次水冲净 ,氮气吹干后滴加 50μl 甲基对硫磷
抗体 (1∶10) ,37 ℃温育 60min ,用 PBS 和二次水冲净 ,并
用氮气吹干 ,测定抗体固定前后石英晶体的频移值。
11212 　巯基自组装膜法[7 ,10 ] 　将洗净的石英晶体浸
泡在 0125 %的 MHDA 中过夜 ,用 PBS 和二次水洗净 ,
固定在检测池中 ,于金电极表面滴加 211 %的 EDC 与
012 %的NHS 各 50μl ,37 ℃下温育 60min ,用 PBS 和二次
水冲净 ,氮气吹干 ,再于金电极表面滴加 50μl 甲基对
硫磷抗体 (1∶10) ,37 ℃温育 60min ,用 PBS 和二次水冲
净 ,氮气吹干 ,测定抗体固定前后石英晶体的频移值。
11213 　电化学检测 　以 310ml 5mmolΠL 的 Fe (CN) 32Π426
(1∶1)2PBS 为电解液 ,以金电极为工作电极 ,铂电极为
对电极、AgΠAgCl 为参比电极测定金电极固定抗体 (巯
基自组装膜法)前后的循环伏安曲线[7 ] 。
11214 　抗体稀释度的优化 　选取巯基自组装膜法形
成自组装膜 ,分别于金电极表面滴加 50μl 不同稀释度
(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶30、1∶40 和 1∶50) 的甲基对硫
磷抗体 , 37 ℃温育 60min ,用 PBS 和二次水冲净 ,氮气
吹干 ,测定石英晶体的频移值。
113 　甲基对硫磷的检测
11311 　直接法 　巯基自组装膜法固定抗体后 ,于检测
池中注入 200μl PBS(pH = 712) ,待石英晶体振荡频率
稳定后 (5min 内ΔF < 1Hz) ,加入一系列不同浓度的甲
基对硫磷抗原溶液 ,测定其频移值 △F ,作频移值对甲
基对硫磷浓度的响应校准曲线 ,并作线性相关分析。
取线性显著相关范围内的高低两个浓度作 10 次重复
测定。
11312 　竞争法 　将 OVA 与甲基对硫磷偶联合成
OVA2甲基对硫磷[8 , 9 ] ,固定抗体的金电极经 015 %OVA
封闭后 ,检测池中加入 10μl 10μgΠml 的 OVA2甲基对硫
磷 ,分别与 0、011、015、110、210、510、810 和 1010μgΠml
的 10μl 甲基对硫磷抗原 ,测定各自频移值ΔF ,作频移
值对甲基对硫磷浓度的响应校准曲线 ,并作线性相关
分析。取线性显著相关范围内的高低两个浓度作 10
次重复测定。
2 　结果与讨论
211 　两种抗体固定方法的比较
抗体固定方法的优劣以抗体最大固定量表示。抗
体固定量决定了测量中抗原抗体结合的活性位点多
少 ,从而决定检测方法的灵敏度。固定量越大 ,固定抗
体前后的频移值ΔF (ΔF = f 0 - f 1 ) 越大。根据最佳条
件的试验结果表明 ,蛋白 A 的膜形成前后的频移值达
(
- 221 ±2217) Hz ,而巯基自组装膜形成前后的频移值
为 ( - 160 ±2514) Hz (表 1) 。蛋白 A 膜较厚 ,巯基自组
装膜较薄。结果还表明 ,在抗体过量前提下 ,蛋白 A
法固定抗体前后的频移值 ( - 282 ±1819) Hz 极显著低
于巯基自组装膜法抗体固定前后的频移值 ( - 364 ±
3317) Hz ,说明蛋白 A 法固定抗体最大量极显著低于巯
基自组装膜法 ,即巯基自组装膜固定法优于蛋白 A
法。
212 　抗体包被过程中抗体浓度的确定
图 1 结果表明 ,在温度为 37 ℃与酸度为 pH 712 条
件下 ,抗体的固定量与抗体的浓度成正比 ,浓度越高抗
体固定量越大。但当抗体 1 ∶10 稀释即浓度为
213mgΠml时 ,其在传感器电极表面固定量趋于饱和。
说明选取稀释度为 1∶10 为宜。
533　3 期 甲基对硫磷压电免疫传感技术的初步探讨
表 1 　两种抗体固定方法引起的频移值比较
Table 1 　Comparison of two antibody immobilization
methods inΔF ( n = 10 , €x ±s)
抗体固定方法
antibody immobilization
methods
膜形成前后的频移值
frequency shift before
and after membrane
formation(Hz)
抗体固定前后的频率值
frequency shift before
and after antibody
immobilization (Hz)
蛋白 A 法 SPA method - 221 ±2217Aa - 282 ±1819Aa
巯基自组装膜法
sulfhydryl self2assembled
layer method
- 160 ±2514Bb - 364 ±3317Bb
注 :字母不同表示显著性差异 ,小写为 p < 0105 ,大写为 p < 0101。
Note : The letters stand for significant difference , small letters stand for p <
0105 , capital letters stand for p < 01011
图 1 　抗体稀释度对频移值 △F 的影响
Fig. 1 　Effects of antibody concentration
on the frequency shift ( △F)
213 　电化学的测定
修饰 MHDA 后和固定抗体后的电极循环伏安曲
线如图 2 所示。由于金电极表面固定的抗体对电子传
递有阻碍作用 ,在一定程度上阻碍了金电极表面电子
传输过程。与修饰 MHDA 电极相比 ,修饰 MHDA 后又
固定抗体时电极的 [ Fe (CN) 6 ]3 - Π [ Fe (CN) 6 ]4 - 的氧
化还原峰电位之差增大 ,电流强度减小 ,说明抗体固定
在金电极表面的巯基自组装膜上。
214 　压电免疫传感器的响应特性
如图 3 所示 ,巯基自组装膜法固定甲基对硫磷抗
体后 ,注入 pH = 712 的 PBS 背景缓冲溶液 200μl 时 ,
5min 内石英晶体ΔF < 1Hz , 20min 后石英晶体金电极
基本处于稳定。再加入 25μgΠml 甲基对硫磷标准溶液
10μl 后 ,传感器出现明显的响应 ,石英晶体频率下降 ,
约 10min 后频率趋于稳定 ,而加入空白缓冲溶液后 ,传
感器几乎没有响应。
215 　压电免疫传感器的检测特性
21511 　直接法 　在优化试验条件 (巯基自组装膜、1∶
图 2 　固定在金电板上的 Fe3 + ΠFe2 + 的循环伏安曲线
Fig. 2 　Cyclic voltammograms of Fe3 + ΠFe2 + on
the same Au electrode
A :修饰 MHDA 电极 ;B :修饰抗体后电极
A :modified with MHDA ;B :modified with antibody
图 3 　加入空白缓冲溶液 (a)和甲基对硫磷
溶液 (b)后传感器的响应
Fig. 3 　Frequency shift as function of time after
methyl parathion solution (a) and only PBS (b) added
10 抗体 37 ℃和 pH 712 固定 60min、pH 712 PBS) 下 ,直
接加入甲基对硫磷标准溶液时 ,传感器石英晶体频移
值对甲基对硫磷浓度的响应校准曲线如图 4。结果表
明 ,抗原溶液浓度在 110～25μgΠml 时 ,频移值与抗原浓
度成良好的线性相关 , 回归方程 Y = 411968 +
317871 X ,相关系数 R = 0199533 ,检测限约为 110μgΠml。
线性范围内高低两个浓度的频率相对值偏差分别为
417 %和 513 % ,说明传感器的重复性较好。
21512 　竞争法 　在优化试验条件下 (同 21511) ,利用
竞争法原理得出的传感器频移值对甲基对硫磷 (OVA2
甲基对硫磷的偶联比为 23∶1) 浓度的响应校准曲线如
图 5。结果表明 ,抗原溶液浓度在 011～10μgΠml 时 ,传
感器响应的频移值与抗原浓度成良好的线性相关 ,回
归方程 Y = 550199 - 41120 X ,相关系数 R = - 0199033 。
与直接法相比 ,竞争法测定的抗原浓度范围 (线性) 大
633 核　农　学　报 22 卷
幅度降低 ,检测限为直接法的 10 %倍。说明竞争法可
以明显地提高检测灵敏度 ,降低检测限 ,更适合小分子
化学物质的检测。
图 4 　基于直接法传感器频移值对甲基对
硫磷浓度的响应校准曲线
Fig. 4 　Calibration curves of the relationship between
the frequency shift (ΔF) of immunosensor and
concentration of methyl parathion by using direct method
图 5 　竞争法传感器响应的频移值与
甲基对硫磷溶液浓度的校准曲线
Fig. 5 　Calibration curves of the relationship between
the frequency shift (ΔF) of immunoreaction
and the concentration of methyl parathion by
using competitive method
3 　结论
在本试验条件下 ,利用十六巯基烷基酸 (MHDA)
自组装膜法比蛋白 A 法固定更多的抗体 ,说明研制压
电免疫传感器时利用十六巯基烷基酸 (MHDA) 自组装
膜法更适合。同时 ,与直接法相比 ,基于竞争法的农药
检测压电免疫传感技术灵敏度较高 ,检测限较低 ,说明
基于竞争法的压电免疫传感技术更适合小分子抗原的
检测。
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