全 文 ：应 用 生 态 学 报 年 月 第 卷 第 期
〔 , , 一
利用甲基对硫磷降解菌
农产品表面农药污染的研究
· 消除
刘 智 张晓舟 李顺鹏“
南京农业大学微生物学系 , 南京 ,
【摘要 】 利用甲基对硫磷降解菌 一 飞曰衣公 、 能高效分解甲基对硫磷的特性 , 研究了消除农
产品表面农药残留污染的途径 采用菌体发酵液 、 发酵液上清液 、 菌体蛋白 、粗酶液 、 添加菌体蛋白的洗涤
剂以及洗涤剂 , 处理了小青菜 、 茶叶 、 黄瓜表面的农药残留污染 结果表明 , 使用发酵液和不同的酶制剂可
以有效去除这些产品表面的农药残留污染 , 最高去除率可达 一 上清液中有一些酶促反应促
进因子 , 有助于酶更好地发挥作用 洗涤剂和酶直接混合作用 , 有助于消除茶叶表面的农药残留 , 但对于黄
瓜和小青菜则相反 在所有选用的模式中 , 使用粗酶液和菌体蛋白效果最好 , 对黄瓜 、 小青菜和茶叶合适的
酶制剂浓度分别为 、 和 粗酶液同时还能降解甲胺磷 、辛硫磷 、 毒死蟀等农药
关键词 甲基对硫磷 发酵液 上清 菌体蛋白 粗酶液 洗涤剂
文章编号 一 一 一 中图分类号 文献标识码
· · 于、邵司物帕田姐‘ ·
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引 言
利用微生物高效快速分解农药的特性 , 对农药
污染的环境进行物修复 , 已成为现代生物技术研究
的热门 , 国内外也有 了许多成功的先例打’
, ” 随着研
究的深人 , 人们发现在许多情况下活体微生物接种
封不能有效地发挥分解农药 残留的功能 , 化学
冲击 、 极端 、 温度 、其他有毒物质 、 微生物捕食者
以及高浓度的农药底物或它们的代谢产物等许多因
素 , 都限制着这种全细胞脱毒技术
。 的应用 与微生物接种剂 相
比 , 酶制剂具有很多优点 , 例如不被微生物代谢抑制
剂所影响 , 对环境要求不高 , 对于低浓度农药酶促反
应速度快 , 酶专一性高 , 酶与底物作用不需要摄入机
制等 因此 研究人 员开始谋求开 发降解农药残
留污染 的酶制剂 , 并取得 了一些进展 「
· ‘“ 本文研
究利用农药残留降解菌及其降解酶消除农产品表面
农药残留污染 , 为农产品残 留污染的清除探索新的
途径
材料与方法
供试材料
甲基对 硫磷降解菌
一
知攻人, 。 , , “ 采用
本研究室保存的菌种
试验方法
菌种活化 从 一 ℃冰箱中取出菌株 , 在添加甲基对
硫磷 ’ 一 ‘的 平板上划线培养 , 挑选快速生长并
有黄色明显水解圈的单菌落 , 作为发酵起始菌株
菌株发酵 接种菌株于 培养基中 ,
· 一 ‘ 、
℃过夜培养 , 以 接种量接人含 培养基
, 农业部“ 九五 ”重点科学技术攻关资助项 目 环 一
‘ , 通讯联系人
一 一 收稿 , 一 一 接受
期 刘 智等 利用甲基对硫磷降解菌 一 消除农产品表面农药污染的研究
或发酵培养基 , 的 三角瓶中 , 同上条件震荡培养
发酵液活力检测 发酵液保存在 ℃冰箱中 , 使用前
取出发酵液 , 分别检测活菌数 、 发酵液降解 能力
· 一 、 离心发酵液 , 用
· 一 ‘磷酸盐缓冲液
,
重悬菌体 , 超声波破碎 破碎的菌体称菌体蛋白 菌
体蛋白和发酵液上清液合并即为粗酶液 测定发酵液上清
液 、 粗酶液及菌体的蛋白含量 、 酶活和 比酶活
菌株计数 用平板菌落计数法 于添加 ’ 一 ‘
甲基对硫磷的 平板上计数 , 读取具有明显黄色水解圈的
菌落数 ,
蛋白质和酶活力的测定 蛋 白质采用 法测
定 测定酶活力的 体系 ’ 一 ‘磷酸盐缓冲液 ,
、 川 甲基对硫磷 色谱纯 , 甲醇溶解 , ’ 矛 一 ‘ , 酶液
℃ , 水浴反应 发酵液反应 , 迅速取出 , 添加
硝酸溶液 八 , , 在
、 · 一 ‘离心
, 取上清测定对硝基苯酚的生成 对硝基苯酚的测定方法
参照文献川 酶活力定义 在 内催化 甲基对硫磷转变
为 对硝基苯酚所需的酶量为 酶活单位 本文数据
中 , 酶活力均折算为 培养液中的菌体或酶液的总酶
活 比酶活定义 单位蛋白 拌 所具有的酶活
消除农作物表面残留试验 取 发酵液 处理
一 、 发酵液上清液 处理 、 粗酶液 处理 、
白猫牌洗涤剂 处理 、 菌体蛋 白 来源于 发酵
液 处理 、 白猫牌洗涤剂及来源于 巧 发酵液的
菌体蛋白 处理 , 用 自来水稀释为 , 调整 值约
为 , 温度为 一 ℃ 加人农药喷雾处理后过夜的样
品 , 缓慢搅拌处理一定时间 , 取出 , 清水洗涤后 , 晾干 , 保鲜袋
封存 , 一 ℃冰箱冻存 , 同时设空 白对照 不经过任何处理 ,
用以确定样品的本底 残留 和阴性对照 经过农药喷雾
处理的样品 , 用清水处理 对于黄瓜和茶叶分别处理
和 , 小青菜分别处理 和
,
农药检测时黄瓜样品
分别取表皮和完整黄瓜进行检测 降解率 一 处理样品
中农药含量 一 空白对照中农药含量 八阴性对照中农药含量
一 空白对照中农药含量 本实验中酶制剂的添加量表示生
产酶制剂所需要的发酵液占反应总体积的量
, 样品处理 称取 样品 , 放人 烧杯中
,
将样
品倒人高速组织捣碎机中 , 加 乙睛 分析纯 冲洗烧
杯 , 转移至高速组织捣碎机中 , 高速匀浆 在 具
塞量筒中加入 一 干燥过的 分析纯 , 将加滤纸的
漏斗放在具塞量筒中 , 倒人匀浆样品过滤 滤完后 , 除去漏
斗 , 盖好量筒的塞子 , 将收集的滤液振摇 , 静止 ,
分层 若乳化严重 , 不能分层 , 可加人适量的蒸馏水 收集上
层澄清滤液 , 装人具塞试管 , 待进样
农药残留测定 委托农业部环境监测总站测试 柱子
类型为 耳 , 丫 拜 , 汽化温度为
℃ 检测器用火焰光度检测器 , 温度 ℃ , 柱温从
℃ 上升至 ℃ 载气为氮气 纯度大
于 , 流速
· 一 ’ 燃气为氢气 , 流速
· 一 ‘ 空气流速
· 一 ‘
, 酶制剂处理模式的优化 取粗酶液和菌体蛋白 , 按其
来源发酵液体积的不同比例 , 加人 自来水中 , 调整 自来水的
值为 左右 , 温度为 一 ℃ , 处理样品 , 检测
农药残留含量
结果与讨论
发酵液的活性检测
取 发酵培养液中的菌液 , 检查活菌数
和发酵液的降解 能力以及菌体的 比降解能力 ,
结果见表 离心发酵液并破碎沉淀细胞 , 分别测定
来源于 发酵培养液中发酵液上清液 、 菌体
蛋 白以及粗酶液的蛋 白含量 、 酶活和比酶活 , 结果见
表 从表 、 可以看出 , 发酵液中降解 甲基对硫磷
表 发酵液活性
晚
溉 菌体含量 酶活,· 一 · 。 一 ’
比酶活
· 一 ·
一
发酵液 只
口 以 明
表 发酵液各组分的活性
三
煞 蛋白含量 酶活· 一
比酶活
卜 一 ,
一
发酵液上清液
菌体蛋白
粗酶液
守 】 暇只分下气 二 一 ——的酶主要存在于菌体细胞体内 , 但单纯用发酵液进行酶学反应试验 , 比用发酵液上清液效果要好 倍
左右 , 这可能是农药分子能够进人细胞体内 , 被体内
的酶催化分解 该方面的研究结果将另文报道 试验
发现 , 发酵液在保存过程中 , 活菌数下降很快 , 但其
酶活却变化不大 , 这可能是因为菌体在死亡过程 中
不断将细胞内的一硫代磷酸醋酶释放到液体中 , 使
发酵液中的酶活保持稳定 这一点对实际生产有很
大的意义
不同模式处理黄瓜表面 残留
采用上述 种模式对黄瓜进行表面残留消除处
理 ,
、
分别取黄瓜表皮和完整黄瓜进行检测其残留
,
对
试验所用的黄瓜还进行了表面积 、 重量以及表皮重
量 、总重量的测定 , 发现每公斤黄瓜表面积为
黄瓜表皮重量与总重量的 比值为 不同
处理模式对黄瓜表面残留的消除效果见图
应 用 生 态 学 报 卷
说明 , 消除农作物表面污染的必要性和可能性
不同模式处理小青菜表面 残留
不同模式处理 处理同上 小青菜表面农药残留
量见图 考虑到小青菜在长期浸水条件下会出现
腐烂 , 而且长时间水浸处理小青菜等叶菜也与实际
生产不相符 , 所以我们设计的处理时间为 和
同样我们测定了小青菜表面积与重量的关系
每公斤小青菜的表面积约为 时
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处理模式
图 不同处理模式去除黄瓜表面 残留的效果
娘 即 提 、 叨 】双 访 玉 皿 抚山
黄瓜表面检测 、 完整黄瓜检测
。 一 处理 一 一
下同
由图 可见 , 使用发酵液 、 发酵液上清液和粗酶
液能起到很好的降解效果 , 而添加菌体蛋 白的量 只
有粗酶液中的一半 , 说明单独添加菌体蛋 白的作用
也很明显 上清液和发酵液的酶活远远低于粗酶液
和菌体蛋白 , 但在试验中去除效果却同样很好 , 这可
能是上清液中的其他成分对酶与农作物表面上的农
药有促进作用 另外的可能性是 , 在消除农作物表面
残留污染的体系中 , 上清液中的酶量 已经足够反应
了 , 粗酶液以及菌体蛋 白中多余的酶起不到太大的
作用
、
下面的优化试验将会部分证明这一观点 在处
理 中 , 洗涤剂和菌体蛋白直接混合没有起到预想
的相互促进作用 这是因为洗涤剂本身又是一种蛋
白质变性物质 , 它们相互影响 , 而导致作用最差 如
果使用酶固定化等技术 , 使洗涤剂和酶分别发挥它
们的作用 , 而又不相互影响 , 将是一项极具前景和意
义的工作
总的来看 , 酶制剂或发酵液能消除农作物表面
农药污染 , 明显好于单纯清水洗涤 阴性对照 和洗
涤剂洗涤 , 而且蛋白质和发酵液因为是天然物质 该
菌株已通过安全评估 , 所以不会带来二次污染等问
题 使用农药残留降解菌和其酶制剂消除农作物表
面农药残留污染 , 是一项具有 良好开发前景的研究
课题
另外 , 通过计算黄瓜表皮和完整黄瓜 中所含的
农药残留量 , 发现黄瓜 中的农药残留决大部分是残
留在表皮上 , 所以在试验中我们直接检测黄瓜表皮
中农药残留量 , 这样采样可以 比较均匀 上述结果也
处理模式 介。
图 不同处理模式去除小青菜 、 茶叶表面 残留的效果
扒 ‘ ‘邢 切
小青菜 , 茶叶 。
由图 可见 , 在处理小青菜表面 残留时 , 出
现了与黄瓜试验不同的结果 使用发酵液和粗酶液
处理效果很好 , 使用菌体蛋白和洗涤剂也有一定的
效果 , 但使用上清液处理和使用洗涤剂及菌体蛋白
混合处理效果很不明显 , 尤其是在 处理时完
全没有检测到与清水洗涤的差别 后者可能的原因
上文已经分析过 , 使用上清液处理时处理效果差的
原因可能是单位重量的小青菜中所 占表面积 比较
大 , 所吸附的农药比较多 , 所以上清液中所含的少量
酶类不足以发挥作用 , 将残留农药充分降解 当然
,
在相同施药条件下农作物表面农药残留含量的高低
还与其表面的成分及物理结构等有关 在相同的施
药环境中小青菜和黄瓜表皮的甲基对硫磷残留量分
别是 一 和
· 一 ’, 前者是后者的
倍 另外小青菜和黄瓜单位重量所占表面积比值
为 , 说明不同农作物表面农药残留与很多因素
有关 , 下面的茶叶试验还将说明这一现象
不同模式处理茶叶表面农药残留
由于茶叶是我国重要的出 口农产品 , 而且近年
期 刘 智等 利用甲基对硫磷降解菌 一 消除农产品表面农药污染的研究
来由于茶叶中农药残 留超标 , 导致我国茶叶出 口 连
年下降 , 所以我们研究了消除茶叶表面农药残 留污
染的问题 , 检测结果见图 由于茶叶中含有 比较
多的芳香类 、醋类等化合物 , 对农药提取 、 测定等造
成很大的困难 茶叶表面比较光洁 , 覆盖有一层蜡质
层 , 虽然其单位重量有较大的表面积 分别是小青菜
的 倍和黄瓜的 倍 , 但相同施药条件下 , 其
农药残留只有
· 一 ‘ , 相当于黄瓜表皮中
所含的农药残留 , 而这一部分农药残留比较难 以消
除 在各种处理中 , 最好的效果只有 左右 排除
提取和检测方面的问题 , 对图 进行分析 , 发现上清
液处理效果相对较好 , 说明 上清液中所含的酶已
经进行了足够的酶促反应 茶叶中农药残 留的降
解可能与酶和底物的接触有关 , 例如上清液中可能
含有一些能起表面活性作用或起加强酶促反应作用
的物质 除添加大量酶的处理 外 , 其他各处理 , 处
理时间越长 , 处理效果越好 , 与上面的试验结
果有明显的区别 这说明茶叶 中农药残 留可能在茶
叶表面紧密吸附 , 甚至溶解 因为甲基对硫磷农药是
脂溶性的 , 刚好与茶叶表面的脂类等物质相似相溶
处理 的异常现象同样提示我们可作如下设想 洗
涤剂将茶叶中的农药溶出 , 降解酶将溶出的农药进
行降解 , 两者互相促进 由于黄瓜和小青菜表面所含
的脂类物质相对较少 , 洗涤剂主要起 了蛋 白质的变
性作用 , 而在茶叶处理中 , 由于洗涤剂主要参与了溶
解脂类物质 , 为酶制剂提供了作用的环境 所以在实
际操作过程中 , 如果直接混合使用酶制剂和洗涤剂 ,
如何选择两者合适的配 比 , 应是研究的重点
,
处理黄瓜的酶制剂优化浓度
上面的研究中我们已经发现酶制剂在处理农作
物表面残留污染中效果明显 , 而且也发现 了添加不
同浓度的酶制剂对农药残 留的降解有很大的影响
所以我们设计了添加不同浓度酶制剂去除农作物表
面 残留污染的试验 , 以期找出处理不同农作物
表面残留时的最佳酶制剂添加浓度 试验中的百分
比表示酶制剂来源发酵液体积所占整个反应体系的
比例 根据上面研究结果 , 结合生产实践 , 我们设计
为酶促反应时间 酶制剂处理黄瓜表面残留
污染的结果见图
从图 可以看出 , 酶制剂在 添加浓度时消
除残留效果很好 从趋势线中可以看出 , 在低浓度时
粗酶液和菌体蛋 白的消除残 留效果有一定的差别 ,
但随酶浓度增加 , 差别减少
处理小青菜的酶制剂优化浓度
不同酶浓度处理小青菜表面 残留的试验结
果见图 我们发现在处理小青菜表面残 留时 , 粗
酶液的效果始终高于菌体蛋白 , 可能是因为小青菜
表面农药残留与酶制剂相互作用时 , 粗酶液中所含
的其他酶促进因子始终发挥一定的作用 , 结合成本
分析 , 比较好的添加浓度为 酶制剂
〔二」
‘ ⋯
加
︵求万巴口召氏占铃淮盘
添加浓度
图 不同浓度酶制剂消除黄瓜 和小青菜 表面 心 残留的效果
工 粗酶液 卿
, 菌体蛋白 , 班 对数 粗酶
液酶 , 对数 酶体蛋白 下 同
处理茶叶的酶制剂优化浓度
同上试验 , 我们设计了茶叶表面残留污染消除
的酶浓度优化试验 , 结果见图 这里所得到的酶制
沁
萝丫曰巴口左扫召的占裤璞世
添加浓度
图
·
含
不同浓度酶制剂消除茶叶表面 残留的结果
,、,
剂添加浓度试验结果与模式试验中很相似 , 酶制剂
处理茶叶表面的残留效果始终比黄瓜和小青菜差 ,
实际操作中可以通过延长反应时间 、增加酶浓度以
及加人表面活性剂等来解决 试验表明 , 处理茶叶
时添加 的酶制剂比较合适 粗酶液处理茶叶的
结果也好于菌体蛋白 , 尤其是在高浓度时
应 用 生 态 学 报 卷
酶制剂降解农作物表面其他农药效果
选取当前农业生产中经常造成人畜伤亡的几种
有机磷农药 , 用小青菜作为代表 , 用粗酶液处理 , 反
应条件同上 , 处理时间为 结果表明 , 我们所
开发的酶制剂对 甲胺磷 、 辛硫磷和毒死蟀分别具有
、 和 的降解率 这一试验结果说
明利用酶制剂降解多种农药残 留的可能性 , 也为开
发清除农作物表面农药污染 的酶制剂 , 进一步奠定
了基础
,
参考文献
一
郭坤梅 ,
一
邓友军
一 、
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、 耐 环境污染与防治 ,
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范秀容 ,
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一 超饭 , 一
仪月
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记
, 召衣址改流刀以 压祀刀
, 一
,
、
八妙 从 子,站泛
, 一
作者简介 刘 智 , 男 , 年生 , 博士研究生 , 主要从事环
境微生物学与分子生物学研究 , 发表论文 篇 一
,