全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1198 ～ 1202
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)06-1198-05
辐照对脱水高丽菜微生物 ATP生物发光光谱的影响
冯 敏1 肖 欢2 朱佳廷1 林家彬1 唐玉新1 杨 萍1 王德宁1 李行通1
(1.江苏省农业科学院原子能农业利用研究所，江苏 南京 210014;2. 扬州大学生命科学与技术学院，江苏 扬州 225009)
摘 要:以脱水高丽菜为材料，研究辐照对微生物 ATP 生物发光光谱的影响。结果表明:ATP 标准品生
物发光光谱的发光区域在 490 ～ 640nm 的范围内，峰时为 563nm;辐照后样品中微生物 ATP 生物发光光
谱的发光区域未发生改变;不同剂量辐照处理后，样品中微生物 ATP 提取液生物发光光谱的峰时没有
显著差异;辐照后样品中微生物 ATP 生物发光光谱峰值高于对照，说明辐照后微生物 ATP 提取液中
ATP 的浓度有所增加，而且这种影响在相当长的一段时间内依然存在。
关键词:辐照;微生物;ATP 生物发光;光谱
EFFECT OF IRRADIATION ON BIOLUMINESCENCE SPECTRUM OF MICROBIAL ATP
FENG Min1 XIAO Huan2 ZHU Jia-ting1 LIN Jia-bin1 TANG Yu-xin1
YANG Ping1 WANG De-ning1 LI Xing-tong1
(1. Institute for Application of Atomic Energy，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing，Jiangsu 210014;
2. College of Bioscience and Biotechnology，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu 225009)
Abstract:The effect of irradiation on bioluminescence spectrum of dehydrated cabbage microbial ATP was studied. The
results showed that the spectral bandwidth of ATP standard was from 490 to 640 nm and the peak wavelength was at 563
nm. The spectral bandwidths of irradiated dehydrated cabbage microbial ATP and CK did not change. Peak wavelengths
of dehydrated cabbage irradiated at different dosages were not significantly different from that of CK. The peaks of
bioluminescence spectrum of irradiated samples were higher than that of CK，which may be because of the increasing
concentration of ATP，and this effect would be kept for quite a long time after irradiation.
Key words:irradiation;microorganism;ATP bioluminescence;spectrum
收稿日期:2010-08-17 接受日期:2010-09-25
基金项目:农业部公益性行业专项经费项目(200803034)，江苏省自主创新资金项目(6110749)
作者简介:冯 敏(1980 －)，女，江苏射阳人，江苏射阳人，助理研究员，主要从事农副产品辐照加工技术研究。E － mail:fengmin8156@ 163. com
通讯作者:朱佳廷(1955 －)，男，甘肃山丹人，甘肃山丹人，研究员，主要从事农副产品辐照加工及标准化研究。E － mail:zjtlw@ 163. com
ATP 生物发光法具有简便、灵敏、能即时反映样品
含菌量等优势，已在发达国家得到广泛应用。近年来，
我国也逐步开展了这方面的研究，如舒伯华等［1］进行
了肉类食品细菌污染的 ATP 生物发光快速分析技术
研究，司传平等［2］用 ATP 生物发光技术快速测定细菌
的药物敏感性，唐银等［3］用 ATP 生物发光技术快速测
定尿液中的病原菌，杨浏等［4］利用生物发光技术进行
高压灭菌效果的快速检测，冯敏等［5］应用 ATP 发光技
术测定辐照前脱水蔬菜和调味品中的含菌量。此外，
该方法还被应用于啤酒酵母的活性测定［6］、评价奶品
厂的卫生状况、估测牛奶及奶制品的保质期等［7］。应
用 ATP 生物发光法检测样品的含菌量，是建立在细菌
ATP 生物发光强度与样品活菌数间显著正相关基础之
上的，但利用该方法检测脱水香葱和胡椒粉的辐照灭
菌效果时，出现了样品微生物 ATP 生物发光强度与实
际含菌量不一致的现象［8］，其机理尚不清楚，目前也
未见后续文献报道。
化学发光法是利用物质在化学反应过程中出现的
光辐射现象进行化学分析的方法，常用于化学反应性
质的确定、物质鉴别及其化学组成和相对含量的测
8911
6 期 辐照对脱水高丽菜微生物 ATP 生物发光光谱的影响
定［9］。不同的生物发光体系由于反应机制不一样，生
成的激发态复合物也不一样，于是导致光辐射产生的
光谱也不相同，因此可以从发射的光谱特征来识别发
光体系的性质［10］。
本文以脱水高丽菜为原料，通过对使用生物发光
法和常规方法测定的微生物 ATP 生物发光值和菌落
总数含量进行对比，分析辐照对其微生物 ATP 生物发
光光谱的影响，为微生物 ATP 生物发光检测提供理论
依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
脱水高丽菜购自兴化永鑫食品有限公司。
1. 2 试剂与仪器
荧光素-荧光素酶及 ATP 标准品购自中科院上海
植物生理研究所，普通化学试剂均为分析纯，常规微生
物检测法所用试剂购自杭州微生物试剂有限公司。
BPCL-K(-2-G-C)超微弱发光测量仪，配备波长为
490、535、555、575、620、640nm 的滤光片，购自中国科
学院生物物理所。
1. 3 辐照
辐照在南京辐照中心进行。采用 0、2、4、6 和
8kGy 5 个剂量进行辐照处理，0kGy 辐照的样品作为对
照(CK)，每剂量设 2 次重复，1 个用于常规方法测定
菌落总数，1 个用于 ATP 生物发光检测。
1. 4 测定方法
1. 4. 1 标准 ATP 溶液 按说明书将 ATP 标准品粉剂
用双蒸水逐级稀释为浓度 5 × 10 － 8、5 × 10 － 9和 5 ×
10 － 10mol / L 的标准 ATP 溶液，备用。
1. 4. 2 样品中微生物 ATP 的提取［5］ 精确称取脱水
高丽菜，按一定比例加入 Tris-EDTA(20mmol /L Tris +
2mmol /L EDTA，pH 7. 75)充分混匀，沸水浴 90s，立即
冷却后离心 10min，取上清液备用，于微生物 ATP 生物
发光及发光光谱的测定。
1. 4. 3 样品中微生物 ATP 生物发光光谱的测定 将
不同波长的滤光片依次置于检测器上用于放置滤光片
的抽屉中(确保抽屉关严、不漏光)，加 200μl 1. 4. 2 中
制备的上清液上清液至测量杯中，将测量杯置于测量
室暗适应 10min，快速注入 800μl 荧光素 － 荧光素酶
溶液，立即测量发光值，所得结果即为样品中微生物
ATP 生物在该波长下的发光值。辐照样品在贮藏 30d
后再次进行相同测量。
1. 4. 4 样品中菌落总数的测定 菌落总数的测定与
ATP 生物发光法的测定同时进行。菌落总数的测定按
GB /T 4789. 2 － 2003［11］执行。
1. 5 数据处理
ATP 生物发光值为 2 次测定的平均值，菌落总数
含量为 3 次测定的平均值。
2 结果与分析
2. 1 辐照对微生物 ATP 生物发光的影响
表 1 的数据表明，辐照后脱水高丽菜菌落总数减
少，且辐照剂量越高，菌落总数越低;微生物 ATP 的发
光值随辐照剂量的增加产生的变化趋势与菌落总数检
测的结果不同，但辐照的脱水高丽菜中微生物 ATP 提
取液的生物发光值均高于 CK。该结果与生物发光法
检测含菌量的原理，ATP 的生物发光强度与样品中的
活菌数显著正相关相违背。
表 1 辐照对脱水高丽菜微生物 ATP 生物发光的影响
Table 1 Effect of irradiation on ATP bioluminescence of microbial
测试项目
item
剂量 dose(kGy)
0(CK) 2 4 6 8
发光强度 RLU 5371 ± 93 7138 ± 589 11741 ± 904 7531 ± 632 9618 ± 219
菌落总数 aerobic bacterial count (cfu / g) 7. 1 × 104 3. 2 × 103 5. 0 × 102 15 N
注:“N”表示未检出。
Note:“N”means the bacteria were not detected.
2. 2 ATP 标准品生物发光光谱的测试与分析
从表 2 可以看出 ATP 标样生物发光光谱的波长
范围为 490 ～ 640nm。在 490 ～ 640nm 的波长范围内，
光谱的发光强度呈现由低到高再到低的动态变化，对
表中的数据进行曲线拟合后可得到回归方程(二次函
数)y = － 0. 1982x2 + 223. 33x － 61797，相关系数 r =
0. 9804，式中 x 表示波长，y 表示一定波长时的发光强
度。发光强度最大时对应的波长称为峰时，对于二次
函数 y = ax2 + bx + c，当 a < 0 时，曲线有 xmax = － b /2a
= 563nm。
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核 农 学 报 24 卷
表 2 ATP 标准品的生物发光光谱
Table 2 Bioluminescence spectrum of ATP standard
波长 wavelength(nm) 460 490 535 555 575 620 640
发光强度 RLU 0 38 ± 9 1033 ± 51 1050 ± 18 1199 ± 107 337 ± 29 75 ± 3
注:表中数据为扣除本底发光值后的数据，下表同。
Note:Backgrounds of data in the table had been removed，the same as following tables.
测试不同浓度 ATP 标准品的生物发光光谱，并根
据回归方程绘制光谱曲线(图 1)，ATP 浓度的变化并
未改变 ATP 生物发光光谱的波长范围和峰时，只是影
响了光谱峰值的高度，ATP 的浓度越高，光谱曲线的峰
值就大，反之光谱曲线的峰值小，样品中 ATP 的浓度
就低，两者呈正相关。
2. 3 辐照对脱水高丽菜中微生物 ATP 生物发光光谱
波长范围的影响
表 3 中数据证明，辐照后样品中微生物 ATP 的光
谱发光区域仍集中在 490 ～ 640nm 的范围内，与对照
及 ATP 标准品相同，说明辐照未改变样品中微生物
ATP 生物发光光谱的波长范围。
图 1 ATP 标准溶液生物发光光谱
Fig. 1 Biluminescence spectrum of ATP standard
表 3 辐照对脱水高丽菜中微生物 ATP 生物发光光谱波长范围的影响
Table 3 Effect of irradiation on bioluminescence spectrum of microbial ATP extracted
剂量
dose(kGy)
光谱波长 wavelength(nm)
490 535 555 575 620 640
0(CK) 81 ± 1 1122 ± 2 1661 ± 27 1801 ± 34 700 ± 61 101 ± 5
2 54 ± 1 1063 ± 25 1435 ± 54 1509 ± 55 540 ± 17 79 ± 10
4 92 ± 3 1235 ± 1 1591 ± 34 1681 ± 42 496 ± 8 81 ± 9
6 97 ± 9 1232 ± 30 1549 ± 1 1640 ± 9 557 ± 34 83 ± 4
8 93 ± 6 1306 ± 6 1897 ± 12 2275 ± 219 625 ± 24 105 ± 4
2. 4 辐照对脱水高丽菜中微生物 ATP 生物发光光谱
峰时的影响
对表 4 中不同剂量辐照后的微生物 ATP 生物发
光光谱的峰时值进行差异显著性分析，结果表明不同
剂量处理间的峰时并无显著性差异，说明辐照处理对
样品中微生物 ATP 生物发光光谱的峰时未产生显著
的影响。
表 4 辐照对脱水高丽菜中微生物 ATP 生物发光光谱峰时的影响
Table 4 Effect of irradiation on peak wavelength of microbial ATP extracted from samples
辐照剂量
irradiation dose(kGy)
回归方程
regression equation
相关系数
r
峰时
peak wavelength(nm)
0(CK) y = － 0. 2817x2 + 318. 74 － 88528 0. 9794 566 ± 3
2 y = － 0. 2468x2 + 278. 90 － 77366 0. 9875 565 ± 2
4 y = － 0. 2746x2 + 309. 61 － 85700 0. 9833 564 ± 2
6 y = － 0. 2674x2 + 301. 60 － 83577 0. 9891 564 ± 3
8 y = － 0. 3410x2 + 385. 23 － 106891 0. 9599 565 ± 4
0021
6 期 辐照对脱水高丽菜微生物 ATP 生物发光光谱的影响
2. 5 贮藏对辐照脱水高丽菜中微生物 ATP 生物发光
光谱峰值的影响
从表 5 可以看出，辐照的脱水高丽菜贮藏一段时
间后，各处理样品微生物 ATP 生物发光的光谱仍在
490 ～ 640nm 范围内。根据 ATP 生物发光光谱曲线符
合二次函数 y = ax2 + bx + c，当 a < 0 时，在 xmax处有峰
值 ymax = －(b
2 － 4ac)/4a，计算表 5 中结果的峰值，结
果如表 6 所示。在 ATP 生物发光系统中，ATP 生物发
光光谱的峰值与样品中 ATP 的浓度正相关。应用
ATP 生物发光技术检测样品的含菌量时，样品的微生
物 ATP 提取液中 ATP 的浓度与样品含菌量之间也应
有着相同的关系。表 1 中，8kGy 剂量辐照的样品中菌
落总数未检出，但表 6 中 8kGy 时样品中微生物 ATP
生物发光光谱的峰值仍然很高，峰值的升高，说明辐照
处理增加了微生物 ATP 提取液中 ATP 的浓度。在辐
照处理 30d 后，测定样品中微生物 ATP 液生物发光光
谱的峰值，其影响在一定程度上仍然存在，说明辐照对
样品中微生物 ATP 生物发光光谱峰值的影响具有长
期性。
表 5 储藏对辐照样品中微生物 ATP 生物发光光谱的影响
Table 5 Effect of storage time on bioluminescence spectrum of microbial ATP extracted of irradiated samples
贮藏时间
storage time(d)
剂量
dose(kGy)
波长 wavelength(nm)
490 535 555 575 620 640
0
30
0(CK) 21 ± 3 724 ± 49 1110 ± 65 1176 ± 22 387 ± 17 55 ± 4
2 53 ± 1 1139 ± 21 1476 ± 16 1787 ± 81 468 ± 4 59 ± 8
4 71 ± 5 1428 ± 67 1793 ± 0 2108 ± 34 633 ± 6 61 ± 7
6 69 ± 11 1349 ± 18 1676 ± 29 1837 ± 43 623 ± 34 67 ± 3
8 83 ± 9 1503 ± 34 1966 ± 89 2269 ± 61 651 ± 45 71 ± 16
0(CK) 81 ± 21 843 ± 91 1120 ± 23 1288 ± 18 459 ± 15 57 ± 7
2 71 ± 15 768 ± 33 1087 ± 18 1739 ± 47 591 ± 64 66 ± 6
4 40 ± 3 504 ± 11 556 ± 51 1112 ± 51 425 ± 8 37 ± 2
6 20 ± 3 312 ± 5 343 ± 1 484 ± 31 157 ± 13 11 ± 3
8 89 ± 9 1511 ± 61 1987 ± 109 2782 ± 5 962 ± 9 102 ± 24
表 6 辐照对样品中微生物 ATP 生物发光光谱峰值的影响
Table 6 Effect of storage time on the peak value of microbial ATP extracted of irradiated samples
贮藏时间
storage time (d)
剂量 dose(kGy)
0(CK) 2 4 6 8
0 1063 1529 1879 1695 2026
30 1133 1283 792 394 2228
3 讨论
3. 1 辐照对脱水高丽菜中微生物 ATP 生物发光的检
测产生了影响，与前期在脱水香葱、胡椒粉等样品上的
研究结果一致［8］。
3. 2 ATP 标准品生物发光光谱的峰时为 563nm。波
长范围和峰时是 ATP 生物发光光谱的 2 个主要特征，
据胡天喜［12］等报道虫荧光素酶催化的发光光谱依萤
火虫的种类而异，P. Pyralis 发射的光谱带宽为 500 ～
650nm，峰 时 为 562nm (pH 7. 5 );而 Photurus
Pennsylvanicus 的 峰 时 为 552nm; Purophorus
Phagiothalamus 的峰时值为 557 ～ 560nm，本研究的结
果与报道相符。ATP 浓度的变化并不能对 ATP 生物
发光光谱的波长范围和光谱的峰时产生影响，只是改
变光谱的峰值，ATP 的浓度越高光谱曲线的峰值就高，
两者呈正相关。
3. 3 辐照后样品中微生物 ATP 生物发光光谱的发光
区域仍在 490 ～ 640nm 的范围内，与对照相同，说明辐
照并未改变样品 ATP 发光光谱的波长范围。不同剂
量处理后样品中微生物 ATP 生物发光光谱的峰时没
有显著差异，说明辐照处理也没有对样品的峰时产生
影响。
3. 4 当辐照后的样品中已无微生物存在或微生物含
量很低时，ATP 提取液生物发光光谱的峰值仍然很高
甚至高于对照，辐照后样品中微生物 ATP 生物发光光
谱峰值高于对照，说明辐照处理增加了微生物 ATP 提
取液 ATP 的浓度，而且这种影响在相当长的一段时间
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内依然存在。
4 结论
辐照后脱水高丽菜中微生物 ATP 与标准 ATP 生
物发光光谱的发光区域相同，在 490 ～ 640nm 的范围
内，辐照处理后样品中微生物 ATP 生物发光光谱的峰
时没有显著改变，辐照后脱水高丽菜中微生物 ATP 生
物发光光谱峰值高于 CK 的现象会持续相当长的时
间。
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［12］ 胡天喜主编 . 发光分析与医学［M］. 上海，华东师范大学出版
社，1990
(责任编辑 高美须 裴 颖)
更正:
我刊于 2009 年 1 期、2 期刊登的文章《宠物干粮食品辐照杀菌工艺参数的确定》(2009，24(1):98 ～ 101)和
《宠物食品辐照杀菌剂工艺剂量研究》(2009，24(2):279 ～ 284)中基金项目均为“公益性行业科研专项
(200803034)”，特此声明。
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