全 文 ：此文于 1997 年 5 月 31 日收到。
蛹虫草 ( Cordyceps m ilitaris)菌丝体液体
培养基的优化和发酵条件的研究
李　信　　许　雷
(中国农业科学院研究生院生化教研室　北京　100081)
裴鑫德
(中国农业大学基础科技学院　北京　100094)
采用二次回归通用旋转组合设计方法 ,对蛹虫草菌丝体液体发酵培养基的最佳
组合进行了研究 ,建立了培养基的反应模型 ,并用实验数据验证了数学模型 ,对培养
基最佳优化组合的各种因子、影响产量的反应规律及交互作用进行了探讨 ,并在此基
础上进行了蛹虫草菌丝体液体发酵条件的研究。结果表明 ,蛹虫草菌丝体液体发酵
的最适条件为 :接种量 6 % (v/ v) ,发酵初始 p H7. 0 ,培养基装量 100ml/ 500ml 三角
瓶 ,发酵温度 24 ℃～28 ℃,发酵周期 96h。
关键词 :蛹虫草菌 　菌丝体发酵生产 　培养基优化 　数学模型
前 言
冬虫夏草 ( Cordyceps si nensis)为我国特有的名贵药用真菌 ,主产于云南、贵州、四川 ,青海
和西藏的 3500～5000m 的高山上。由于生长环境和寄生条件特殊而严格 ,天然资源非常紧
张。要想获得天然虫草子实体或采用全人工栽培技术培养虫草 ,条件复杂 ,周期太长 ,产量有
限 ,成本较高。因此 ,国内外一直致力于虫草菌丝体的人工培养研究[1 ,2 ] 。采用虫草菌液体培
养方法 ,收获其培养菌丝体 ,替代天然和人工栽培的子实体 ,也许是一种解决虫草资源不足的
好办法[3 ] 。据有关文献报道[4 ,5 ] ,虫草液体培养菌丝体 ,其内含成份与天然虫草的成份类似 ,
药理作用与有效成份也相似。本文旨在对蛹虫草菌丝体液体发酵培养基进行优化 ,并对其发
酵条件进行探讨。
材 料 与 方 法
材料 　菌种 :蛹虫草菌 ( Cordyceps m ilitaris) 。斜面培养基 : PDA 培养基 ,p H6～7。种子
培养基 ( %) :蔗糖 2 ,蛋白胨 0. 5 ,酵母浸出粉 0. 5 ,MgSO4·7H2O 0102 , K2 HPO4 0104 ,p H 6～7。
发酵基础培养基 ( %) :白糖 5 ,酵母浸出粉 0104 , KNO3012 , MgSO4·7H2O 　0102 , K2 HPO4
53　核 农 学 报　1998 ,12 (1) :35～40Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
0104 ,FeSO4·7H2O 01002 ,p H6～7。
方法 　500ml 三角瓶装液量 100ml ,接种一小块斜面菌种于种子瓶 ,28 ℃、200rpm 旋转摇
床振荡培养 72h。以 5 %的接种量接种到发酵摇瓶中 ,在同样的条件下发酵培养 120h ,发酵液
10000rpm 离心 10min ,水洗 2 次 ,离心收集菌体 ,于 105 ℃烘干至恒重 ,检测菌体生长量 ,以 %
表示。
蛹虫草菌丝体液体发酵培养基的优化 :采用三因素二次通用旋转组合设计方法[6 ] ,具体
水平设置见表 1。
表 1 　自变量设计水平及编码
Table l 　The code and level scaling of the variates
xj
因　素　Factor
白糖 Beet sugar %(x1) KNO3 %(x2) 酵母粉 Yeast extract %(x3)
γ 1210 0150 01080
1 1014 0142 01072
0 810 0130 0106021 516 0118 010482γ 410 0110 01040
△j 31567 01119 010119
　　　　γ= 11682 ,N = 20 ,mc = 8 ,m0 = 6 ,xj = zj - z0j/ △j [6 ]
发酵条件研究选择不同的发酵温度、发酵初始 p H、接种量、培养基装量和发酵培养周期 6
个因素对蛹虫草菌丝体液体发酵进行发酵条件试验研究。
结 果 与 讨 论
(一)培养基的优化试验
蛹虫草菌丝体产量的数学模型 :采用三因素五水平的二次通用旋转组合设计 ,根据 20 组
试验结果 (表 4) ,由计算机算得蛹虫草菌丝体产量 y ( %)与白糖 x1 ( %) 、KNO3x2 ( %)及酵母粉
x3 ( %)关系的数学模型为 (1) :
表 2 　方差分析
Table 2 　Variance analysis
来　源 Source 平方和 SS 自由度 df 方差 MS F 值 F value
回归 Regression 3178995 9 0142111 20182903 F0101 (9 ,5) = 10116
剩余 Residual 0120217 10 01020217
总计 Total 31992119 19
误差 Error 010040836 5 010008167
失拟 Slf 01198089 5 010396177 48150794 F0101 (5 ,5) = 10197
　　y = 119449 + 0106277x1 + 010447x2 + 0105691x3 + 0100875x1x2 + 0101875x1x3
- 0102125x2x3 - 0127729x12 - 013798x22 - 0128436x32 (1)
回归方程显著性检验 :经检验回归方程 (1)的显著性得方差分析表 (表 2) 。
63 核　农　学　报 12 卷
　　经检验得知 ,回归模型 (1)在α= 0101 水平显著 ,试验误差的方差σ^2 可取估计值σ^2 = S剩f剩 =
0120217/ 10 = 01020217。
回归系数的显著性检验 :回归系数的检验结果见表 3。
表 3 　回归系数及 t 检验
Table 3 The regression coefficient and t2test
回归系数
Regression coefficient
性状指标
Character index
显著性
Significance
b0 119453443 3 3 3
b1 010627664 3 3 3
b2 01044729 3 3 3
b3 010569092 3 3 3
b12 0100875
b13 0101875
b23 - 0102125
b11 - 0127731 3 3
b22 - 013798 3 3
b33 - 0128438 3 3
　　3 3 3 极显著 Large significance ; 3 3 显著 Significance
从表 3 的结果可以得知 ,除交互作用项系数 b12 、b13及 b23外 ,其他回归系数都在不同程度
上显著 ,特别是 x12 、x22 及 x32 效应极显著 ,说明白糖、KNO3 和酵母粉都是影响蛹虫草菌丝体
产量的重要因素。
蛹虫草菌丝体产量的单因素分析 :如果对蛹虫草菌丝体产量的数学模型进行“降维”分析 ,
即固定二因素在“零水平”,则得一因素与蛹虫草菌丝体产量的关系为 :
　　y1 = 119449 + 010628x1 - 012773x12 　　(令 x2 = x3 = 0 时) (3)
　　y2 = 119449 + 010447x2 - 013798x22 　　(令 x1 = x3 = 0 时) (4)
　　y3 = 119449 + 010569x3 - 012844x32 　　(令 x1 = x2 = 0 时) (5)
又如 ,令dy1dx1 = 0 ,则得 x1 = 011132 ,即白糖的培养基含量为 8127 %时 ,蛹虫草菌丝体产量
最高可达到 119489 % ,令dy2dy2 = 0 ,则得 x2 = 010589 ,即 KNO3 为 01307 %时 ,其菌丝体产量最高
为 119466 % ,令dy3dx3 = 0 ,则得 x3 = 01100035 ,即酵母粉培养基投入量为 010612 %时 ,其菌丝体
产量最高可达到 119482 %。
蛹虫草菌丝体产量的双因素分析 :如对蛹虫草菌丝体产量的数学模型 (1)分别固定 xi = 0 ,
i = 1 ,2 ,3 ,则可得双因素对蛹虫草菌丝体产量关系的数学模型如下 :
　　y1213 = 119449 + 010628x1 + 010447x2 + 010088x1x2 - 012773x12 - 013798x22 (6)
　　y1312 = 119449 + 010628x1 + 010569x3 + 010188x1x3 - 012773x12 - 012844x32 (7)
　　y2311 = 119449 + 010447x2 + 010569x3 - 010213x2x3 - 013798x22 - 012844x32 (8)
73　1 期 蛹虫草 ( Cordyceps militaris)菌丝体液体培养基的优化和发酵条件的研究
由模型 (6) , (7) , (8)可求得菌丝体最高产量 ( %)时 ,双因素相应的投料水平 :如令9y12139x1 =9y12139x2 = 0 ,则得 x1 = 0. 1145 ,x2 = 0. 08193 ,即白糖的投入量为 8127 %和 KNO3 为 0131 %时 ,蛹
虫草菌丝体的最大产量为 Max y1213 = 1195 %。类似 , 9y13129x1 = 9y13129x3 = 0 ,可得 x1 = 0111676 ,x3
= 0110389 ,即白糖投入量为 8128 % ,酵母粉为 01061 %时 ,蛹虫草菌丝体产量最高可达到 Max
y1312 = 11952 %。同理 ,当9y23119x2 = 9y23119x3 = 0 ,则可得 x2 = 010561 ,x3 = 0109794 ,即当 KNO3 投
入量为 01307 % ,酵母粉为 01061 %时 ,蛹虫草菌丝体最高产量可达到 Maxy2311 = 119493 %。
预测值与实验实测值的比较 :蛹虫草菌丝体产量 ( %)的实测值与模型 (1)计算的预测值的
比较见表 4。
表 4 　蛹虫草菌丝体产量预测值与实验值的比较
Table 4 　Comparison of calculation with experiment data for C. m ilitaris
试验号
Test No.
实验值 y
Experiment data
预测值y^
Calculation data
y2y^
1 1117 111741 - 01004054
2 1101 110652 - 01055235
3 1108 111096 - 01029596
4 0181 019158 - 0110577
5 0193 019935 - 0106352
6 0182 019597 - 011397
7 0185 019641 - 0111406
8 0168 018452 - 0116525
9 1130 1126598 0103402
10 1126 110548 0120516
11 1102 019455 01074499
12 0196 017950 0116497
13 1128 112361 01043879
14 1124 110447 01195322
15 1194 119449 - 01004889
16 1198 119449 01035111
17 1196 119449 01015111
18 1190 119449 - 0104489
19 1193 119449 - 0114889
20 1192 119449 - 01024889
　　如果将以编码值计算得出的回归模型 (1) 的系数换算成试验因素实际用量单位的回归系
数 ,则回归模型 (1)将变为以下的模型 :
　　y = - 010352689 + 1155702x1 - 01221125x2 - 0108732x3 - 01004714x1x2
- 010048424x1x3 - 01002266x2x3 - 01361786x12 - 0108449x22 - 01014537x32 (9)
83 核　农　学　报 12 卷
模型 (9)中 ,xi (i = 1 ,2 ,3)的取值应为试验因素实际用量值。
(二)蛹虫草菌丝体液体发酵条件的研究
发酵温度对菌丝体产量的影响 :如图 1 所示 ,蛹虫草菌丝体液体发酵对温度要求比较严
格 ,最适温度在 24 ℃～28 ℃之间 ,温度过高 (32 ℃)会抑制菌体的生长。
图 1 　发酵温度对蛹虫草菌丝体产量的影响
Fig. 1 　 Effect of fermentation temperature on
biomass of C. militaris
图 2 　发酵初始 p H 值对蛹虫草菌丝体产量
的影响
Fig. 2 　Effect of initial p H on biomass of C. mili2
taris
　　发酵初始 p H 值对菌丝体产量的影响 :蛹虫草菌丝体发酵对初始 p H 值的要求不很严格
(图 2) ,在 p H5～9 范围内 ,菌体产量变化不大 ,初始 p H 值为 710 时 ,其产量达到最高。
　　接种量对蛹虫草菌丝体产量的影响 :从图 3 可以看出 ,接种量在 2 %～10 %范围内 ,最适
接种量为 6 %时 ,菌丝体产量最高 ,说明接种量应适当 ,过低或过高都会影响菌丝体产量。
图 3 　接种量对蛹虫草菌丝体产量的影响
Fig. 3 　Effect of inoculation volume on biomass of
C. militaris
图 4 　培养基装量对蛹虫草菌丝体产量的影响
Fig. 4 　Effect of medium volume on biomass of C.
militaris
　　发酵培养基装量对蛹虫草菌丝体产量的影响 :发酵培养基的装量对蛹虫草菌丝体产量有
一定的影响。从图 4 可看出 ,培养基的适宜装量为 100ml/ 500ml 三角瓶 ,培养基装量过多会影
响菌体生长的好氧需求 ,近而影响到菌丝体的产量。
　　发酵周期对蛹虫草菌丝体产量的影响 :发酵周期对蛹虫草菌丝体产量的试验结果表明 ,蛹
虫草菌丝体发酵的周期偏长 ,菌丝体开始生长比较缓慢 ,随着发酵进程的不断深入 ,菌体生长
越来越旺盛 ,到 96h 时菌体产量达到最高峰 (2128 %) ,之后生长趋于稳定期 ,菌体浓度有所下
降 ,其主要原因可能与后期菌丝体自溶有关。
93　1 期 蛹虫草 ( Cordyceps militaris)菌丝体液体培养基的优化和发酵条件的研究
图 5 　发酵周期对蛹虫草菌丝体产量的影响
Fig. 5 　Effect of fermentation time on biomass of C. militaris
参 考 文 献
1 　陈传盈等. 冬虫夏草工业深层发酵研究. 中成药 ,1992 , (5) :409
2 　忻丁烯. 人工深层发酵冬虫夏草菌丝体的研究进展. 中成药研究 ,1988 , (1) :35
3 　张长铠等. 冬虫夏草菌丝生长的营养要求. 微生物学通报 ,1992 , (3) :129
4 　丁凤平等. 冬虫夏草研究性状. 中国生化药物杂志 ,1994 , (4) :297
5 　徐　飞. 我国深层培养虫草菌丝体的药用研究. 中国药学杂志 ,1992 , (4) :195
6 　茆诗松等. 回归分析及其试验设计. 上海 :华东师范大学出版社 ,1983
THE OPTIMIZATION OF FERMENTATION PROCESS FOR MYCEL IA PROD UCTION
OF Cordyceps milita ris
Li 　Xin 　　Xu 　Lei
( Graduate School , CA A S , Beiji ng ,10081)
Pei 　Xinde
( China A gricult ural U niversity , Beiji ng ,10094)
ABSTRACT
The optimization of fermentation medium for mycel ia production of C. milita ris was stud2
ied by using a current ,rotational and combinative design of quadratic regression in this experi2
ment. The mathematical model of reaction on the media was built up. The model was of high pre2
diction and verif ied by the experimental data to be rel iable. The reaction regularity ,relation be2
t ween the t wo factors in the best combination of medium ,the output of mycel ia and mutual effect
of different factors were discussed by use of the mathematical model . The optimum culture con2
ditions were as follows :the initial pH 7. 0 , 96 h of the culture time , 6 % of inoculated volume ,
culture temperature of 24 ℃～28 ℃and 100ml/ 500ml flask of culture volume.
Key words : Cordyceps m ilitaris , mycelia fermentation production ,optimization of medium ,
mathematical model
04 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1998 ,12 (1) :35～40