全 文 ：玉米小孢子胚胎发生的
细胞形态学观察 3
齐延芳 3 3 　宋建成　姜丽君　杨景成　王启柏
(山东农业大学　泰安　271018)
通过观察玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学特征 ,发现 :离体培养条件下单核后
期的花粉可以通过均等分裂和不均等分裂两条途径形成胚状体 ,与前人的研究结果
一致。淀粉粒的积累 ,多核小孢子的液泡化以及花药壁的衰退都可影响雄核发育。
将诱导培养 3 周的花药转移到降低蔗糖浓度、去除 TZBA 并附加 KT 的分化培养基
上 ,有利于球形胚和梨形胚的极性分化和成熟 ,而发育较迟的胚状体则停止发育 ,趋
向退化。因此胚状体之间出现明显的两极分化。
关键词 :玉米 　小孢子胚胎发育 　细胞形态学
此文于 1997 年 9 月 11 日收到3 本研究为国家自然科学基金项目和农业部“八·五”攻关项目3 3 现工作单位为山东省农业科学院原子能所　济南　250100
70 年代中后期到 80 年代初 ,我国玉米花药培养取得很大进展。对雄核发育的细胞形态
学特征也进行了一定研究[1 ,7 ,9 ,11 ] 。但是由于诱导频率相当低和基因型障碍大等种种原因 ,使
这方面的研究还缺乏系统性。目前现有的易诱导基因型和较成熟的培养方法为深入进行这方
面的研究提供了有利条件。本文将我们在这方面的研究结果报道如下。
1 　材料和方法
供试材料为高诱导率杂交种 (A3 ×A12 - 2) F1 。将单核靠边期的花药接种在改良“玉培”培
养基上。经 7 ℃低温预处理 14d 后 ,转到 28 ℃下暗培养 14d ,然后弱光 (1000lx)培养 7d ,再采用
微胚早期转移的方法[6 ,12 ]进行分化培养。
接种后每天取新鲜花药经 Carnoy 液 (冰醋酸 :95 %酒精 = 1∶3) 或 FAA (50 %酒精∶福尔马
林∶冰醋酸 = 89∶5∶6)固定 ,用高碘酸 ———希夫 (pas)反应 —爱氐苏木精整体染色[5 ]和常规番红
—固绿染色 ,石蜡切片法制片 ,厚度 6～8μm ,Olympus 显微镜观察 ,照相。
2 　结果与分析
211 　雄核发育途径
低温处理后的花药诱导培养 3d 后 ,小孢子已经开始第 1 次分裂 ;7d 后 ,许多小孢子已经
成为多核或多细胞状态。启动分裂的方式有以下几种 :A 途径 :单核花粉经第 1 次有丝分裂形
成 1 个大的营养核 (V)和 1 个小的生殖核 ( G) (图版 Ⅰ24) ,这种花粉通常称作 A 型花粉。在进
1　核 农 学 报　1999 ,13 (1) :1～10Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
一步发育中 ,有的由营养核连续分裂 ,形成多核或多细胞团 (图版 Ⅰ25 ,6) ;有的由生殖核持续
分裂 ,营养核则被挤在花粉壁的一侧 ,停止发育 (图版 Ⅰ27) ;有的营养核和生殖核同时分裂。
形成两类大小及染色程度不同的细胞群 (图版 Ⅰ28 ,9) ,这些结果与前人的研究一致[1 ,7～9 ,12 ] 。
B 途径 :即单核小孢子通过均等分裂形成两个大小及染色程度相近的细胞核 (图版 Ⅰ210 ,
11) ,有时核分裂以后伴随着细胞壁的形成 (图版 Ⅱ22 ,12) 。以后由 2 个子核共同分裂 ,形成大
小相似的多核花粉 (图版 Ⅱ213 ,14) 。进一步旺盛分裂过程中 ,如果不能形成细胞壁 ,细胞核会
突破花粉壁 ,散失在药室中 (图版 Ⅱ214) 。如果核分裂以后伴随着细胞壁的形成 ,则形成的子
细胞排列整齐 ,细胞质浓稠 ,细胞核相对较大 ,细胞间形态相近 ,类似于分生组织细胞的状态
(图版 Ⅱ215 ,16) 。培养 14d 以后 ,细胞团开始突破花粉壁 (图版 Ⅱ217) ,进一步发育成胚状体
或愈伤组织。
212 　花药培养早期小孢子的退化特点
尽管雄核发生的启动类型有多种 ,但观察中发现 ,A 型花粉的 3 种启动方式在进一步发育
中较 B 型花粉容易退化。在最后形成的胚状体或愈伤组织中占的比例较小 ,与前人的报道不
一致[7～9 ] ,推测分歧的原因 ,可能是由于培养体系不同造成的 ,有可能低温预处理是一个关键
因素。遗憾的是 ,有关低温预处理的机理目前仍未有确切解释。
另外 ,观察到在培养 7～10d 的花药中 ,有的花粉细胞质变稀薄 ,细胞核解体 ,形成空瘪无
生活力的花粉 ,其药室壁退化迅速 ,只剩下药室外壁 (图版 Ⅱ218) ;有的花粉停留在单核状态 ,
核的周围积累颗粒状贮藏物质 ,呈 pas 正反应 ,证明是淀粉粒 (图版 Ⅱ219) ;也有的小孢子已经
进行了 1～2 次分裂 ,但是细胞质液泡化程度高 ,只在核的周围染色较深 (图版 Ⅱ220) ,这种液
泡化的花粉将由于物质供应不足而趋向退化。
213 　胚状体和愈伤组织的发育
花药诱导培养 20d 左右 ,突破花粉壁的多细胞团进一步发育成没有极性分化的球形胚 (图
版Ⅲ222)或稍有极性分化的梨形胚 (图版 Ⅲ223) ,这些胚状体的细胞之间结合紧密 ,没有细胞
间隙 ,细胞质浓稠 ,核/ 质比高 ,表现出旺盛的分裂能力。在 1 个药室中可以观察到多个胚状体
(图版 Ⅲ224) ,有时虽然两个或两个以上胚状体紧靠在一起 ,但仍能看出相互间的隔离 ,说明胚
状体之间具有相对独立性。有的球形胚在周围结构比较疏松的细胞团内发育 (图版 Ⅲ,25) ,球
形胚较周围的细胞团核大 ,细胞质染色深 ,细胞形状比较规则一致。而周围细胞形状不规则 ,
核/ 质比低 ,细胞质染色浅。黄斌[2 ]在研究大麦花药培养时 ,观察到许多分区多细胞花粉 ,设
想胞质浓密的细胞相当于花粉原胚 ,而胞质稀少的液泡化细胞则代表着营养或哺育组织。上
面描述的形状不规则的细胞紧贴花粉壁 ,似乎表明在胚状体发育早期曾有着类似胚柄的作用。
诱导培养 3 周以后 ,将外观新鲜的花药转移到去除 TZBA ,附加 KT1mg/ L ,降低蔗糖浓度
至 2 %的分化培养基上。切片观察发现 ,球形胚在这种培养基上生长迅速 ,并且在各个方向上
的生长速度不一致 ,逐渐失去上下的轴向对称 ,发生极性分化 :在胚状体的一端细胞质浓稠 ,染
色深 ,另一端细胞质比较稀薄 ,染色浅 (图版 Ⅲ226) 。分化培养以后 ,各个胚状体之间两极分化
明显 ,发育好的球形胚体积迅速增大 ,朝着成熟胚的方向发育 ;同药室中发育迟的胚状体停止
发育 ,逐步退化 (图版 Ⅲ227 ,28) 。随着分化培养的进行可以观察到多种形态的胚状体 ,有的胚
状体具有“胚柄”状结构 (图版 Ⅳ230) ,“胚柄”细胞与胚状体的主体部分细胞相比 ,核小 ,细胞质
染色浅。“胚柄”与花药壁紧密连接 ,使胚状体着生于花药壁上 ,从结构上看出 ,花药壁在胚胎
发育过程中起着类似于胎座的作用。
2 核　农　学　报 13 卷
　　一般在分化培养 1 周左右 ,即有胚状体突出花药壁 (图版 Ⅳ232 ,图版 Ⅰ21) ,并进一步分化
出根、芽 ,形成完整植株 (图版 Ⅰ22 ,3) 。
在目前采用的玉米花粉培养程序中 ,愈伤组织的产生频率较胚状体低得多 ,一般在 10 %
～20 %左右。两者在早期外部形态上很难区分。通过切片观察 ,可以发现愈伤组织细胞形态
不规则 ,排列比较疏松 ,细胞核相对较小 ,细胞质比较稀薄、染色浅 (图版 Ⅳ229 ,31) ,有的愈伤
组织在培养过程中有淀粉粒的积累 (图版 Ⅳ233) 。这些特征与胚状体的“胚柄”细胞特征极为
相似。
无论胚状体还是愈伤组织 ,在分化培养以后 ,都有部分区域的细胞核大 ,细胞体积比较小 ,
核/ 质比较周围细胞大得多 ,是分裂旺盛的“分生区域”(图版 Ⅳ231 ,34) 。由于这些区域细胞旺
盛分裂 ,使胚状体进一步产生根原基、芽原基、维管束等组织 ,向着成熟胚的方向发育。
3 　讨 　　论
据报道[13～16 ] ,诱导产生的多细胞团只有很少一部分能够分化出绿苗 ,其它的在进一步培
养中停止发育。因此 ,如何提高胚状体成苗率 ,已引起人们的重视。诱导培养 3 周 ,在肉眼可
见的胚状体形成之前将新鲜培养物转移到分化培养基上 ,有利于绿苗的形成[6 ,11 ] 。这种方式
虽然降低了胚状体诱导率 ,但可以保证存活胚状体的质量 ,从而使绿苗分化率提高 10 倍以
上[6 ] 。本研究利用光镜对转移前后的胚状体进行观察 ,发现诱导 3 周以后 ,胚状体发育到无极
性分化的球形胚或稍有极性分化的梨形胚时期。李春玲[4 ]推测 ,该时期是胚状体能否分化成
苗的一个临界期。在高糖浓度、含有代谢抑制剂 TZBA 的诱导培养基上 ,可能进一步极性分化
受到阻碍。转到分化培养基上以后 ,胚状体很快越过球形胚阶段 ,向着成熟胚的方向发育 ,从
而提高了绿苗分化率。
另据报道[18 ] ,花粉囊中的任何花粉都具有胚胎发生潜能。因此要提高花粉植株的诱导频
率 ,必须从促进小孢子脱分化启动入手 ,也就是在适当的外界因素刺激下 ,诱导其完成脱分化。
例如 :对大麦[2～3 ]的花药进行甘露醇预处理 ,可明显提高诱导频率。在玉米上 ,低温预处理花
药对于提高诱导频率是十分有效的 ,遗憾的是 ,低温诱导脱分化的机理至今还不清楚 ,还有待
于进一步研究。
参 考 文 献
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3 　李春玲. 植物花培育种进展. 北京 :中国农业出版社 ,1996 ,279～290
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5 　姜丽君 ,等. 植物花培育种进展. 北京 :中国农业科技出版社 ,1996 ,249～253
6 　郭仲琛 ,等. 玉米花粉植株的诱导和雄核发育的研究. 植物学报 ,1978 ,20 (3) :204～209
7 　郭仲琛 ,等. 玉米花粉愈伤组织产生胚状体的细胞形态学研究. 植物学报 ,1984 ,26 (1) :19～23
8 　潘景丽 ,等. 玉米花粉培养过程中花粉的发育及其愈伤组织的形成. 西北植物研究 ,1981 ,1 (1) :38～43
9 　李文泽 ,等. 在大麦花药—花粉培养中甘露醇预处理机理的研究. 科学通报 ,1995 ,40 (4) :1344
10 　李文泽 ,等. 甘露醇预处理对大麦雄性发育的影响. 植物学报 ,1995 ,37 (7) :552～557
11 　Anna P , et al. Structural observations during androgenic micropore culture of the 4cl genotype of zeamays L . Euphytica. 1994 ,
65 :61～69
3　1 期 玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学观察
12 　Barley D , et al. Improvement of regeneration ability of androgenetic embryos by early transfer in maize. Plant Cell , Tissue and
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13 　Dunwell J M , et al. Pollen ultrastructure in an ther cultures of nicotiana tabacum. ⅡChomges associated with embryogenesis.
J Exp Bot . 1974 ,25 :363～373
14 　Genoves A P , et al. In vitro production of haploid plants of com via anther culture. Crop Science ,1982 ,22 (6) :1137～1144
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Genet . 1987 ,73 :863～869
16 　Peroline J F , et al. Genetic analysis of anther culture response in maize. Thor. Appl. Genet . 1987 ,74 :284～286
17 　Sarah L , et al. Barley anther culture :pretreatment on mannital stimulates production of microspore2derveelem bryos. Plant
Cell , Tissue and Organ Culture ,1990 ,20 :235～240.
CYTO2MORPHOLOGICAL OBSERVATIONS OF MAIZE
MICROSPORIC EMBRYOGENESIS
Qi Yanfang 　Song Jiancheng 　J iang Lijun 　Yang Jingcheng 　Wang Qibo
( S handong A gricut ural U niversity 　Taian 　271018)
ABSTRACT
To study the mechanism of maize microsporic embryogenesis during anther culture proce2
dure ,the cyto2morphological features were observed. The results were as follows :
1. Inoculated on the induction medium at the late uninucleate stage , the microspores could
initiate embryogenesis by f irst divisions in both symmetric and asymmetric patterns ,but the for2
mer was predominant. The accumulation of starch , vacuolation of multinucleate microspores and
degeneration of anther wall affected microsporic embryogenesis.
2. Three weeks after inoculation , anthers were transfered to differentiation medium with
2 % sucrose and 1mg/ L KT. This method was favourable to differentiation and maturity of
sphere2or pear2l ike embryoids but accelerated the degeneration of other less developed multicel2
lular structures. It was suggested that the qual ity of androgentic structures influenced their re2
generation abil ities.
Key words :Maize ( Zea m ays L . ) ,micropsoric embryogenesis ,cyto2morphology.
4 Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (1) :1～10
图版 Ⅳ
图版 Ⅰ
Em :胚状体 ,Ca :愈伤组织 ,V :营养核 (细胞) , G:生殖核 (细胞) ,N :细胞核 ,Su :胚柄 ,S :淀粉粒 ,CW :细胞壁
11 分化培养 7d ,从花药壁裂开处形成胚状体
21 胚状体分化成苗
31 花粉植株转移到三角瓶中
41 小孢子不均等分裂形成 1 个营养核和 1 个生殖核 ( ×800)
51 小孢子分裂形成 3 个营养核和 1～2 个生殖核 ( ×800)
8 核　农　学　报 13 卷
61 多个营养核和 1 个残存的生殖核 ( ×800)
71 多个生殖核和 1 个停止发育的营养核 ( ×800)
812 个营养核和 2 个生殖核 ( ×800)
91 多个营养细胞和多个生殖细胞区域分布 ( ×400)
101 小孢子均等分裂形成 2 个近似等大核 ( ×800)
111 同上 ( ×800)
图版 Ⅱ
121 均等分裂以后形成细胞壁 ( ×800)
131 均等分裂以后形成三核或四核 ( ×800)
141 均等分裂形成的多核 ( ×400)
151 均等分裂形成的四细胞 ( ×800)
161 均等分裂形成的多细胞 ( ×400)
171 多细胞团突破花粉壁 ( ×200)
181 空瘪退化小孢子 ( ×200)
191 积累淀粉粒的小孢子 ( ×800)
201 液泡化小孢子 ( ×800)
图版 Ⅲ
211 药室壁具有中层 ( ×200)
221 无极性分化的球胚 ( ×400)
231 稍有极性分化的胚状体 ( ×200)
241 两个合并药室中具有多个胚状体 ( ×80)
251 胚状体与“哺育组织”间明显区分 ( ×200)
261 极性分化的胚状体 ( ×200)
271 同药室中胚状体之间发育两极分化 ,长箭头示迅速发育的胚状体 ,短箭头示趋于退化的胚状体 ( ×80)
281 同上
图版 Ⅳ
291 愈伤组织 ( ×80)
301 具有胚柄的胚状体 ( ×200)
311 胚状体和愈伤组织的“分裂中心”( ×80)
321 胚状体突出药室 ( ×200)
331 在一侧积累淀粉粒的愈伤组织 ( ×200)
341 胚状体的“分裂中心”( ×200)
Plate Ⅰ
Em : Embryoid , Ca :Calus , V :Vegetative nucleus (cell) , G: Generative nucleus (cell) , S :Starch , CW :Cell wall , N :Nucleus , Su :
Suspensor
1. Embryoids (arrow) extrud the anther wall 7 days after differentiation culture.
2. Embryoids differentiate into plantlets.
3. Pollen plantlets were transfered into culture bottle.
4. One vegetative nucleus (V) and one generative nucleus( G) were formed via microspore asymmetric division ( ×800)
5. Three vegetative nuclei (V) and two generative nuclei ( G) ( ×800)
6. Multinucleate microspore containing many vegetative nuclei (V) and one abortive generative nucleus( G) ( ×800)
7. Many generative nuclei ( G) and one abortive vegetative nucleus(V) ( ×800)
8. Two vegetative nuclei (V) and two generative nuclei ( G) ( ×800)
9. Vegetative cells(V) and generative cells( G) were distributed regionally ( ×400)
10. Two nuclei with equal size were formed via microspore symmetric division ( ×800)
11. Same as above ( ×800)
9　1 期 玉米小孢子胚胎发生的细胞形态学观察
Plate Ⅱ
12 ～16 :All through symmetic division
12. Cell wall was formed (arrow) ( ×800)
13. Threeor four2nucleus microspore ( ×800)
14. Multinucleate microspore ( ×400)
15. Four2cell micropsore ( ×800)
16. Multicellular microspore ( ×400)
17. The emergence of multicellular unit after rupture of the exine (arrow) ( ×200)
18. Abortive microspore ( ×200)
19. Starch2accumulated microspore ( ×800)
20. Vacuolative microspore ( ×800)
Plate Ⅲ
21. The middle layer of anther cell wall (arrow) ( ×200)
22. Sphere2like embryoid without differentiation ( ×400)
23. Embryoid with a little differentiation ( ×200)
24. Embryoids in the two combined anther cells( ×80)
25. Embryoid and“nurse tissue”( ×200)
26. Differentiating embryoid ( ×200)
27. Embryoids in quick development (long arrow) and towards degeneration (short arrow) ( ×80)
28. Same as above. ×80
Plate Ⅳ
29. Callus( ×80)
30. Embryoid with suspensor2like structure ( ×200)
31. Embryoid and callus in the same anther cell ,“dividing centre”is noted (arrow) ( ×80)
32. Embryoid extruding the anther cell ( ×200)
33. Starch2accumulated callus( ×200)
34.“Dividing centre”of embryoid (arrow) ( ×200)
01 核　农　学　报 13 卷