全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 042587205
切花菊‘长紫’辐照后代减数分裂行为
及 ISSR 遗传变异分析
邢莉莉　陈发棣　缪恒彬
(南京农业大学园艺学院 ,江苏 南京　210095)
摘 　要 :通过细胞学和分子标记技术对切花菊‘长紫’辐照后代进行分析 ,探讨辐射诱变机理 ,为菊花辐射
育种提供理论依据。结果发现 ,辐照后代在减数分裂后期 Ⅰ和后期 Ⅱ出现落后染色体和染色体桥的异
常率明显高于对照 ,且随着剂量升高异常率增加 ,两种异常现象发生的最高比率在后期 Ⅰ分别为 910 %
和 1113 % ,后期 Ⅱ为 1515 %和 816 %。用 21 个 ISSR 引物扩增得到多态性条带 112 条 ,多态性比率为
7113 % ,表明 DNA 在不同程度上发生了变异。通过 UPGMA 法将它们分为 5 类 ,聚类结果基本上与花型
和花色的变异类型相关。
关键词 :切花菊 ;辐射变异 ;减数分裂 ; ISSR
MEIOSIS AND ISSR ANALYSIS ON GENETIC VARIATION OF 60 Coγ2RAYS IRRADIATED
VARIANTS OF CUT CHRYSANTHEMUM
XINGLi2li 　CHEN Fa2di 　MIAO Heng2bin
( College of Horticulture , Nanjing Agricultural University , Nanjing , Jiangsu 　210095)
Abstract:Cytology and ISSR technology were used to analyze genetic variations of 60 Co γ2rays induced variants of cut
chrysanthemum‘Changzi’, for further exploring the mechanism of irradiation and providing theoretical basis for breeding of
chrysanthemum. The results showed that , meiotic abnormality ratio of lagging chromosome and chromosome bridge in variants
were significantly higher than those in the control at anaphase Ⅰand Ⅱ. The abnormality ratio was also raised with irradiation
doses increasing. The highest ratio of two abnormal phenomena at anaphase Ⅰwas 910 % , 1113 % , and at anaphase Ⅱ
1515 % , 816 % , respectively. Polymorphic bands of 112 were amplified by 21 ISSR primers and the polymorphism rate was
7113 % , which proved that DNA changed in different degrees. These variants were divided into 5 groups by UPGMA based on
Jaccard coefficient . It was observed that the clustering result related to their characters of flower shape and color variations.
Key words :cut chrysanthemum ; irradiation variation ; meiosis ; ISSR
收稿日期 :2009201210 　接受日期 :2009204208
基金项目 :教育部新世纪优秀人才支持计划 (NCET20620489) ,农业部 948 滚动项目 (2008G3)
作者简介 :邢莉莉 (19832) ,女 ,安徽芜湖人 ,硕士研究生 ,研究方向为花卉遗传育种。E2mail :blueingcheck @yahoo. cn
通讯作者 :陈发棣 (19702) ,男 ,福建三明人 ,教授 ,博导 ,研究方向为花卉遗传育种与分子生物学。Tel :025284395231 ; E2mail :chenfd @njau. edu. cn　　辐射诱变技术具有简便、经济、突变率高等特点 ,近年来已被广泛运用到观赏植物育种中[1 ,2 ] ,但大多研究主要集中在辐射诱变植物的生物学效应上 ,如分析辐射后代的成活率、生长量及目标性状的变异等[3～6 ] ,其次还应用于探讨辐射材料的敏感性和适宜剂量的选择方面[7 ,8 ] ,而有关细胞或分子水平的诱变机理仅有零星报道 ,如亚洲百合辐射后代花粉母细胞减数分裂染 色体数目和结构变异导致花粉不育[9 ] ,通过 RAPD 分子标记技术分析唐菖蒲[10 ] 、水仙[11 ]辐射后代发现基因组存在变异等。菊花 ( Chrysanthemum ×morifolium) 是我国十大传统名花和世界四大切花之一 ,品种极其丰富。辐射诱变是菊花重要育种手段之一 ,已选育出很多新品
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种[12 ,13 ] ,黄建昌和肖艳对菊花插条辐射后根尖的染色
体变异进行了研究[14 ] ,洪亚辉运用 RAPD 标记分析了
菊花辐射变异后代的遗传差异[15 ] ,但诱变后代的减数
分裂异常行为及 ISSR 遗传变异分析尚未见报道。本
研究对切花菊‘长紫’诱变后代先从细胞学角度观察减
数分裂异常行为 ,再从 ISSR 标记水平对基因组发生的
变异加以检测 ,旨在探究γ射线对菊花辐射后产生变
异的机理及实现对突变株的初步筛选 ,提高育种效率。
1 　材料和方法
111 　材料
供试材料为切花菊品种‘长紫’( Ch . × morifolium
‘Changzi’)生根试管苗 ,由南京农业大学“中国菊花种
质资源保存中心”提供。
112 　方法
11211 　辐照预处理 　取生根试管苗在江苏省农业科
学院原子能所钴源室进行不同剂量的60 Coγ射线 (0、
10、15、20Gy) 辐照处理 ,由茎段组培再生得到辐照后
代 ,从中筛选获得不同类型变异单株 (表 1) 。第二年
春天每个处理剂量下挑选 3～4 个表型变化典型的变
异单株进行扦插 ,供减数分裂异常行为和分子标记研
究 ,以 0Gy 处理为空白对照 ,10、15Gy 处理后无表型变
化后代为处理对照 ,共 13 份材料 (表 1) 。
表 1 　供试材料
Table 1 　Experimental materials used in the study
材料编号
materials No.
辐照剂量
irradiation dose ( Gy)
变异类型
type of variation
1 0 2
2 10 2
3 10 E
4 10 A
5 10 B ,D
6 15 2
7 15 E
8 15 B
9 15 C
10 20 B
11 20 A
12 20 B ,E
13 20 B
注 :A :瓣性增加 ;B :瓣性下降 ; C :舌状花发生卷曲 ;D :舌状花由平瓣变
成管瓣 ; E :花色变深 ;2 :无变异
Note: A : petal number increased ; B : petals number decreased ; C : ray florets
became curls ; D :ray florets turned to tubular ; E :flower color became darker ; 2 :
means no variation
11212 　减数分裂 　参照陈发棣等[16 ] 的方法在晴天
8 :00 - 10 :00 取直径 6～10mm 大小的花蕾 ,卡诺氏 Ⅰ
固定液 (无水乙醇∶冰醋酸 = 3∶1 ,VΠV)固定 ,4 ℃冰箱保
存备用。制片时取出头状花序 ,去除苞片 ,用镊子夹取
管状小花 ,45 %醋酸压片 ,在 Olympus BX41 相差显微
镜下观察统计减数分裂不同时期的异常现象并拍照。
11213 　ISSR 标记 　采用 CTAB 微量法[17 ] 提取嫩叶基
因组 DNA ,Lambda DNA 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质
量和浓度。引物筛选参考缪恒彬等 [17 ] 文献。ISSR2
PCR 扩增反应体系 20μl : PCR 缓冲液 210μl ; ISSR 引物
110μl ;Mg2 + 112μl ; dNTP 110μl ; Taq 酶 012μl ;DNA 模板
210μl。扩增程序为 :94 ℃预变性 5min ;94 ℃变性 45s ,
55 ℃复性 40s , 72 ℃延伸 70s , 45 个循环 ; 72 ℃延伸
7min ,4 ℃保存。扩增反应结束后 ,每管各加入 6 ×溴酚
蓝 015μl ,离心混匀后 ,取 7μl 扩增产物在 210 %琼脂糖
凝胶上电泳 ,凝胶中含 0105 %溴化乙锭 ( EB) 。电极缓
冲液为 l ×TAE ,电压 5VΠcm ,电泳结束后在 JS2380 型凝
胶成像分析仪上观测并照相。
根据 PCR 扩增产物的电泳结果 ,在凝胶的某个相
同迁移率位置上有 DNA 条带的记为“1”,无 DNA 条带
的记为“0”。采用 POPGEN 1131 软件计算多态位点百
分率 (PPL) ,用 SPSS 1110 分析软件 Jaccard 法计算相似
系数、UPGMA 法进行聚类分析。
PCR扩增选用的 ISSR 引物由上海英骏生物技术
有限公司合成 ;Taq DNA 聚合酶、dNTP、Lambda DNA 以
及 100bp DNA marker 购自宝生物工程 (大连) 有限公
司。
2 　结果与分析
211 　‘长紫’辐照变异后代减数分裂异常行为观察
染色体具有高度的辐照敏感性 ,畸变是辐照损伤
的典型表现特征。本试验对辐照变异后代的减数分裂
过程进行观察 ,发现异常现象主要出现在后期 Ⅰ和后
期 Ⅱ。
在减数分裂后期 Ⅰ,空白对照染色体分离正常 ,但
在辐照后代中观察到了落后染色体 (图 123) ,且随着辐
照剂量的加大 ,异常率增加 ,20Gy 处理下异常率达到
910 %(表 2) 。染色体桥 (图 122) 发生的概率也随辐照
计量的增加而相应增大 ,由空白对照的 311 %上升到
15Gy 处理下的最大异常率 1113 % ,10Gy 和 20Gy 处理
下异常率分别为 517 %和 911 % ,也均高于对照。
在减数分裂后期 Ⅱ中 ,同样发现有较高频率的落
后染色体和染色体桥出现 (表 2 ,图 1) 。20Gy 处理下
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出现落后染色体的异常率达到 1515 % ,超过空白对照
219 %的 6 倍 ,另外 2 个剂量下的异常比率也都高达 15 %左右 ;染色体桥出现的概率也随着辐照剂量的增加而变大 ,最大异常率为 816 %。
表 2 　变异后代减数分裂后期 ⅠΠⅡ异常率
Table 2 　Meiotic abnormality rate at anaphase Ⅰand Ⅱin variant
辐照剂量
irradiation dose
( Gy)
观察细胞数
No. of
cells observed
后期Ⅰ异常率
abnormality rate at anaphase Ⅰ( %)
落后染色体
lagging chromosome
染色体桥
chromosome bridge
观察细胞数
No. of cells
observed
后期Ⅱ异常率
abnormality rate at anaphase Ⅱ( %)
落后染色体
lagging chromosome
染色体桥
chromosome bridge
0 63 0 311 65 219 318
10 63 318 517 63 1417 810
15 76 616 1113 68 1513 719
20 78 910 911 78 1515 816
图 1 　变异后代减数分裂后期 ⅠΠⅡ中的异常现象
Fig. 1 　Abnormal meiosis observed at anaphase Ⅰand Ⅱin variants
1 :正常后期Ⅰ;2 :异常后期Ⅰ:箭头所指为染色体桥 ;3 :异常后期Ⅰ:箭头所指为落后染色体 ;4 :正常后期Ⅱ;
5 :异常后期Ⅱ:箭头所指为染色体桥 ;6 :异常后期Ⅱ:箭头所指为落后染色体。标尺 = 10μm
1 :normal anaphase Ⅰ; 2 :abnormal anaphase Ⅰ:arrow indicates the chromosome bridge ; 3 :abnormal anaphase Ⅰ:arrows indicate the lagging chromosomes ;
4 :normal anaphase Ⅱ; 5 :abnormal anaphase Ⅱ:arrow indicates the chromosome bridge ; 6 :abnormal anaphase Ⅱ:arrow indicates the lagging chromosomes.
Scale bar = 10μm
图 2 　引物 ISSR61 在 13 份材料中的扩增图谱
Fig. 2 　ISSR profiles of 13 materials amplified by primer ISSR61
1 - 13 见表 1。箭头所指为多态性条带。
1 - 13 materials are same as table 1. Arrows indicate the polymorphic bands.
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212 　辐照诱变后代的 ISSR 分析
21211 　ISSR 扩增结果 　从 30 个引物中筛选出 21 个
条带清晰 ,多态性好的有效引物 ,对 13 份材料进行多
态性分析。共扩增出 157 条条带 ,其中多态性条带 112
条 ,多态性比率达 7113 % ,说明60 Coγ射线辐照引起了
后代基因组 DNA 不同程度的变异 (图 2) 。
21212 　辐照对后代基因组变异情况的影响 　根据
ISSR 扩增结果 ,通过软件计算获得 13 份材料两两之间
的遗传相似系数矩阵 (表 3) 和聚类分析图 (图 3) 。由
表 3 可以看出 ,10Gy 处理下的变异植株遗传相似系数
在 01071～01613 之间 ,平均遗传相似系数为 01302 ;
15Gy 处理下的变异植株遗传相似系数在 01041～
01389 之间 ,平均遗传相似系数为 01234 ;20Gy 剂量处
理下的变异植株遗传相似系数在 01083～01300 之间 ,
平均遗传相似系数为 01228。说明随着辐照剂量的增
加 ,平均遗传相似系数呈逐渐下降的趋势 ,即随着辐照
剂量的加大 ,DNA 出现的变异程度也随之加大。但同
时可以看出 ,各剂量处理内的遗传相似系数在变异株
之间也存在较大差异 ,表明辐照变异的随机性较强。
表 3 　13 份材料的基因型相似性系数矩阵
Table 3 　The genotype similarity coefficients of 13 materials
材料编号
number 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1 11000
2 01071 11000
3 01613 01726 11000
4 01450 01683 01749 11000
5 01072 01001 01013 01364 11000
6 01367 01775 01742 01967 01230 11000
7 01041 01794 01568 01757 01078 01849 11000
8 01389 01230 01529 01790 01067 01241 01252 11000
9 01139 01608 01675 01749 01174 01724 01625 01354 11000
10 01240 01676 01747 01825 01102 01736 01285 01789 01504 11000
11 01300 01432 01385 01975 01276 01608 01340 01404 01736 01622 11000
12 01083 01667 01560 01868 01401 01666 01902 01529 01617 01445 01441 11000
13 01288 01364 01607 01684 01149 01778 01499 01276 01728 01369 01544 01548 11000
图 3 　13 份材料的 UPGMA 聚类图
Fig. 3 　The UPGMA phylogenetic tree of 13 materials
　　从聚类结果看 ,以 01540 为阈值可把 13 份材料分
为 5 类 (图 3) ,聚类结果与辐照剂量基本无直接相关
性。组 Ⅰ的 4 个变异单株来自不同剂量处理 ,如 4 和
11 号分别来自 10 和 20Gy 的处理 ,但变异都发生在花
型上 ,同属于瓣性增加的变异类型 ,遗传相似系数高达
01975。组 Ⅱ共有 5 个材料 ,有 3 个 (3、7、12 号) 属花色 加深的变异类型 ,花朵的颜色由淡紫色变成深紫色 ,相似系数最高为 01902 ,其中 10 和 15Gy 处理下未发生变异的对照 (2、6 号) 也聚在这一组 ,与空白对照遗传相似系数小。组 Ⅲ中 8 和 10 号的遗传相似系数为01789 ,花型上都发生了瓣性下降的变异。空白对照和5 号各单独成一组 ,5 号和其他变异株相似系数普遍较小 ,最高只有 01401 ,最低为 01010 ,其在花型上发生了较大变异 ,舌状花由原来的平瓣变成了管瓣。聚类结果说明植株表型上的变异和内在 DNA 水平上受到辐照诱发的变化具有一定的相关性。3 　结论与讨论本研究从细胞学水平观察染色体减数分裂行为的异常 ,分子水平分析基因组水平的变化 ,发现辐照诱变对植株的减数分裂和基因组 DNA 产生了明显影响 ,诱变导致表观性状的变异确实在微观细胞学和分子水平上检测到差异。对变异后代的减数分裂行为观察发现 ,落后染色体和染色体桥的异常现象在减数分裂后期 Ⅰ和后期 Ⅱ
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出现比率显著高于空白对照 ,这与前人在航天诱变的
凤仙花和γ射线辐照柑桔种子获得的无核品种中花粉
母细胞减数分裂行为一致[18 ,19 ] 。辐射诱变导致的减数
分裂后期形成落后染色体及染色体桥等损伤现象是染
色体行为畸变的典型表现 ,可通过统计二者发生的概
率来讨论辐照对植株的诱变效应和机理 ,同时可作为
辐照敏感性研究和适宜辐照剂量选择的理论参考。第
二代仍存在与空白对照相比较高的异常率 ,说明辐射
损伤依旧存在 ,连续多代观察细胞学上发生的异常现
象 ,或许能找出某些变异类型与减数分裂异常之间的
相关性。陈善春等[19 ] 在对辐照柑桔干种子选育出的
无核品系的花粉母细胞减数分裂行为观察中 ,发现了
辐射诱发的染色体结构变异引起其减数分裂异常致使
花粉不育 ,表现出无核性状且稳定遗传。辐射当代观
察染色体分裂行为异常率可以从辐射效应上说明染色
体受到了损伤 ,而关于辐射机理的深入研究则需要对
连续多代进行观察 ,才有可能寻找出产生变异的根本
机理所在。
分子标记技术已成功运用于辐射诱变后代的变异
程度及突变体的研究[20 ] ,如对水仙组培鳞茎辐射后得
到的材料进行 AFLP 和 RAPD 分析 ,检测到 DNA 水平
上发生突变的频率分别为 15148 %和 8133 %[11 ] 。张克
中等[21 ]对百合及 13 个表现雄性不育的突变体进行
RAPD 分析 ,实现了 DNA 水平上的早期筛选。ISSR 标
记克服了 RAPD 标记稳定性和重复性差等缺点 ,操作
简单 ,重复性好 ,多态性丰富[22 ] ,所以本研究选用 ISSR
标记对变异单株进行分析。基于 ISSR 结果的聚类分
析发现变异后代基本按照表观性状上观察到的变异类
型进行聚类 ,且聚类结果与辐照剂量关系不大。说明
辐射诱变随机性强 ,同一剂量下并不是诱导变异向同
一方向发展 ,而是可能诱发不同位点突变 ,得到多种变
异类型。其中舌状花由平瓣变为管瓣的变异株与空白
对照及其他变异株遗传距离均较远 ,说明其在分子水
平发生了较大变异 ,导致其瓣型发生改变。10、15Gy
处理后无表型变化后代与空白对照遗传相似性较小 ,
表明虽表观上未发现可见变异 ,实际在基因组上已检
测到变化。20Gy 下的变异单株在花色加深的同时花
朵变小、瓣性降低 ,不利于有益变异的累加表达 ,这两
种优劣变异的同时发生 ,可能与基因连锁有关[23 ] ,或
辐射在一定程度上影响了次生物质的合成代谢以及花
器官组织的分化发育 ,相关机理还有待进一步研究。
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