全 文 ：核 农 学 报 2010，24(3):490 ～ 494
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)03-0490-05
番茄 EBF2 基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化
吴 玉1，2 杨迎伍1，2 邓 伟1，2 李正国1，2
(1. 重庆大学生物工程学院基因工程研究中心，重庆 400030;2. 重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室，重庆 400030)
摘 要:为研究番茄 EBF2 基因的功能，利用 RT-PCR 技术从番茄果实 cDNA 中扩增了全长 EBF2 基因，
将其与绿色荧光蛋白(GFP)构建成融合表达载体，在烟草原生质体中进行瞬时表达。结果表明，该基因
定位于细胞核内。将该基因定向克隆到植物表达载体 pCambia1301，构建成由组成型启动子 CaMV35S
启动的植物表达载体 pCambia1301-EBF2，通过农杆菌介导方法转化 Micro Tom 番茄。经 PCR 及 GUS 组
织染色检测，外源基因已整合到番茄基因组中。
关键词:EBF2 基因;亚细胞定位;载体构建;遗传转化;番茄
CLONING，SUBCELLULAR LOCALIZATION AND TRANSFORMATION OF EBF2 GENE IN TOMATO
WU Yu1，2 YANG Ying-wu1，2 DENG Wei1，2 LI Zheng-guo1，2
(1 . Genetic Engineering Research Center，Bio-Engineering College，Chongqing University，Chongqing 400030;
2 . Key Lab of Functional Gene and New Regulation Technologies under Chongqing Municipal Education Commission，Chongqing 400030)
Abstract:In order to study the function of EBF2 cDNA in tomato，EBF2 full length gene from tomato fruit was amplified
by RT-PCR. The transient expression of EBF2-GFP fusion protein in tobacco protoplast revealed its nuclear localization，
and sense recombinant vector of pCambia1301-EBF2 which EBF2 gene driven by the constitutive promoter CaMV35S
was constructed. Then the transgenic tomatoes cv. Micro Tom were obtained via Agrobacterium-mediated transformation
and confirmed by PCR and GUS histochemical staining.
Key words:EBF2 gene;subcellular localization;construction of expression vector;transformation;tomato
收稿日期:2009-10-12 接受日期:2009-12-28
基金项目:国家自然科学基金(编号 30600422)
作者简介:吴 玉(1984-)，女，新疆乌鲁木齐人，硕士研究生，主要从事分子生物学研究。Tel:023-65120483;E-mail:20071902049@ cqu. edu. cn
通讯作者:李正国(1964-)，男，四川大邑人，教授，主要从事植物分子生物学研究。Tel:023-65120483;E-mail:zhengguoli@ cqu. edu. cn
果实的生长发育和成熟是一个非常复杂的生理生
化过程，受到植物激素、环境条件和基因表达等多方面
因素的影响和调控，伴随着大量程序化基因的表达过
程［1］。乙烯是一种植物激素，对植物生长发育的影响
包括种子萌发、对茎和根伸长的抑制、开花、衰老和脱
落、性别分化、果实成熟、胁迫反应等［1，2］。乙烯作为
跃变型果实成熟的重要调控因子，其信号转导途径一
直是国内外研究的热点，现已鉴定出乙烯受体及下游
几个元件，取得了较大进展［2 ～ 4］。最近的研究进一步
表明，几个 F-box 蛋白在植物生长和发育等多方面起
作用，尤其是植物激素信号可能依赖于 SCF 调控［5］。
在拟南芥中研究表明，2 个 F-box 蛋白，即 EBF1 和
EBF2(EIN3-Binding F box protein 1 and 2)，可与 EIN3
(ethylene insesitive 3)相互作用，从而参与乙烯信号的
调控反应［6 ～ 8］。在缺乏乙烯的情况下，EIN3 蛋白被
EBF1 和 EBF2 介导的泛素 /蛋白酶体途径迅速降解。
拟南芥中 ebf1 和 ebf2 任一基因突变，导致 EIN3 的稳
定性增强，从而增强植株对乙烯的反应;且 ebf1 和 ebf2
的双突变型拟南芥植株对外源乙烯显示出组成型乙烯
反应。而任一 EBF1 和 EBF2 基因的超表达降低拟南
芥对外源乙烯的敏感性，并使 EIN3 不稳定。基因上
位性分析表明，EBF1 和 EBF2 作用于 EIN2 下游，并独
立于 EIN2，直接控制 EIN3 蛋白的水平。
由于拟南芥缺乏果实发育与成熟的典型特征，因
094
3 期 番茄 EBF2 基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化
此在拟南芥上的研究结果不能揭示 EBF1 和 EBF2 对
果实发育及成熟过程的影响。番茄果实为肉质浆果，
是一种典型的呼吸跃变型果实，果实成熟过程中伴随
着大量结构和生理生化的变化，是研究果实发育与成
熟过程的重要模式植物。另外，番茄也是一种世界性
种植的重要鲜食和加工原料。本研究从番茄中分离
EBF2 的全长编码序列，构建番茄 EBF2 植物超表达载
体，并转化番茄，对进一步阐明 EBF2 在果实发育与成
熟过程的功能具有重要意义。
1 材料与方法
1. 1 材料
番茄(Solanum lycopersicum，cv. Micro Tom)、大肠
杆 菌 (Escherichia coli ) JM109 菌 株、农 杆 菌
(Agrobacterium)菌 株 GV3101 及 植 物 表 达 载 体
pCambia1301 均为本实验室保存;pGreenⅡ-35S-EGFP
载体由法国图卢兹大学惠赠。该载体由 pGreen 载
体［9］衍生而来，是含有绿色荧光蛋白(GFP)序列和
35S 启动子序列的表达载体。
1. 2 方法
1. 2. 1 SLEBF2 目的基因的克隆 根据拟南芥
(Arabidopsis thaliana)EBF2 序列及番茄 EST 序列进行
同 源 性 分 析， 设 计 引 物 P1 (5 ’-
ATGCCTACTCTTGTTAATTACAGTG-3’)和 P2 (5 ’-
TCGTTTTGACCATTTCGAATGCATT-3’)，通过 TaKaRa
高保真 DNA 聚合酶从番茄绿熟期果实 cDNA 中 PCR
扩增 EBF2 基因，PCR 条件:98℃ 5min;98℃ 20s，56℃
20s，72℃ 150s，40 个循环;72℃ 10min。产物经过回
收，送上海生工生物技术有限公司测序验证。
1. 2. 2 SLEBF2 的亚细胞定位 以引物 P1、R1(5’-
GGAGAGGATGTCACACCTCCACAAAGC-3’)、高保真
酶扩增获得的 EBF2 全长编码片段(去除终止密码子
TAA)与经限制性内切酶 SmaⅠ酶切的 pGreenⅡ-35S-
EGFP 载体连接构建 pGreenⅡ-35S-EBF2::EGFP 融合
表达载体。将所得连接产物转化大肠杆菌感受态细
胞，用 pGreenⅡ-35S-EGFP 载体上的一段特异引物 F1
(5’-CGGAGAGGTACGTATTTTTAC-3’)与 R1，PCR 筛
选正向连接的阳性菌落，提取质粒，并测序验证。
按照 Axelos 等［10］的方法制备烟草原生质体，在
PEG 介导下将 pGreenⅡ-35S-EBF2::EGFP 转入烟草
原生质体。25℃ 振荡培养 16h，激光共聚焦显微镜
(ZEISS LSM-510 META，Germany)观察其亚细胞定位。
1. 2. 3 植物表达载体的构建 将 EBF2 基因同上述
方法先构建到中间载体 pDH51［11］上，以 CaMV35S 前
引物 F (5’-GCTCCTACAAATGCCATCATTGC-3’)与
EBF2 基因后引物 P2，PCR 筛选正向连接的转化子，再
经 EcoRⅠ酶切并与 pCambia1301 载体连接，转化大肠
杆菌感受态细胞，构建重组质粒 pCambia1301-EBF2，
并经测序验证。
1. 2. 4 番茄的遗传转化及转基因植株的鉴定 将重
组质粒 pCambia1301-EBF2 通过冻融法导入农杆菌
GV3101，利用叶盘法转化番茄，经过 100mg /L 卡那霉
素筛选的抗性植株移入温室培养［12］。
以具卡那霉素抗性的番茄转化苗叶片为材料，用
改良 CTAB 法小量提取番茄基因组 DNA。以 DNA 为
模版，pCambia1301-EBF2 质粒为阳性对照，同时用野
生型番茄 DNA 作为阴性对照，以 CaMV35S 前引物 F
与 EBF2 基因特异引物 R2(5’-AGGTATCCATCACAT-
TCAACT-3’)(扩增产物约为 700bp)进行转基因植株
的 PCR 鉴定，PCR 反应条件:95℃ 5min;95℃ 1min，
53℃ 45s，72℃ 1min，35 个循环;72℃ 10min。
2 结果与分析
2. 1 SLEBF2 基因的分离及序列分析
以番茄果实 cDNA 为模板，以 P1、P2 为引物进行
PCR 扩增，扩出 1 条约 2000bp 的条带(图 1)，与预期
目标片段大小一致。测序结果显示该基因全长
2884bp，编码 637 个氨基酸。
图 1 番茄 EBF2 基因的 PCR 扩增
Fig. 1 Amplification of EBF2 gene by
PCR from tomato
M:DNA 分子量标准;1:EBF2 基因
M:DNA marker;1:EBF2 gene
根据测序结果进行相关生物信息学分析表明，该
基因与拟南芥中的 EBF2 基因有 64%的核苷酸序列相
似性。用 DNAMAN 软件对番茄 EBF2 与拟南芥 EBF2
194
核 农 学 报 24 卷
蛋白(其 GenBank 登录号为 NP197917)进行蛋白质比
对(图 2)，显示二者氨基酸序列相似性为 53. 88%。
图中黑实线框出的部分 F-box 保守区域，箭头所示
LRRs(leucine-rich repeats)是蛋白质泛素化作用的底
物(如 EIN3)识别并结合的必需结构［7，13］。将该基因
在 GenBank 中登录，其登录号为 GQ144956，编码的蛋
白登录号为 ACS44350。
图 2 番茄与拟南芥 EBF2 基因的氨基酸序列比对
Fig. 2 Alignment of deduced amino acid sequences of EBF2 gene between Solanum
lycopersicum and Arabidopsis thaliana
黑框示 F-box 保守区;箭头示 LRRs 结构
The F-box sequences are boxed;LRRs are indicated by arrows above the sequences
2. 2 SLEBF2 的亚细胞定位分析
将所获得的番茄 EBF2 基因定向克隆入 pGreen
Ⅱ-35S-EGFP 载体后，PCR 筛选得到正向连接的转化
子，经酶切及测序验证序列正确。将 pGreenⅡ-35S-
EBF2::EGFP 重组质粒转化烟草原生质体，经激光共
聚焦显微镜观察其亚细胞定位(图 3)。由激光共聚焦
扫描显微图与可见光显微图叠加后的效果图可清楚地
看出，未转化目的基因的空质粒并没有明确的核定位，
而含有 EBF2 的重组质粒定位于细胞核内。
2. 3 SLEBF2 转基因番茄植株的获得及鉴定
为研究 EBF2 基因的功能，将 EBF2 基因克隆入
植物表达载体 pCambia1301 中，构建成重组质粒
pCambia1301-EBF2，并通过冻融法将重组质粒转化农
杆菌 GV3101。通过农杆菌介导的叶盘法转化获得的
番茄抗性植株移栽成活后，以叶片为材料提取基因组
DNA，对抗性苗进行 PCR 初步鉴定，检测结果如图 4
所示。由图 4 可见，待测抗性苗中有 3 株是阳性植株。
进一步通过 GUS 组织染色证实，3 株 PCR 检测阳性株
系为转基因番茄植株(结果未列出)。
3 结语
通过泛素 /26S 蛋白酶体途径的蛋白质降解是所
有真核生物一个重要的转录后调节机制，这样能使真
核细胞对信号分子和环境条件的改变作出迅速反
应［14］。F-box 蛋白是参与该途径的重要元件。最近在
拟南芥中发现的 EBF1 和 EBF2(EIN3-binding F box
protein 1 and 2)是通过调节 EIN3(ethylene insesitive
3)蛋白的降解，从而在植物对乙烯信号的反应中起着
重要的调控作用。
294
3 期 番茄 EBF2 基因的克隆、亚细胞定位与遗传转化
图 3 EBF2 的亚细胞定位
Fig. 3 Subcellular localization of EBF2
上部为 pGreen 空质粒，下部为 EBF2 基因的融合载体
A、D:激光共聚焦扫描显微图;B、E:可见光显微图;C、F:二者叠加图
Upper panel represents the pGreen empty vector，the lower panel represents EBF2 fusion vector
A，D:confocal laser scanning micrographs;B，E:visible light micrographs;C，F:merged images
图 4 转基因番茄植株中 EBF2 基因的 PCR 检测
Fig. 4 PCR analysis of EBF2 gene in
putative transgenic tomatoes
M:DNA 标准分子质量;N:空白对照;
P:阳性对照;W:野生型番茄植株;1 ～ 5:转基因番茄植株
M:DNA marker;N:negative control;P:positive control;
W:wild type tomato;1 ～ 5:transgenic tomatoes
本研究以番茄为材料，成功克隆了 EBF2 基因，并
构建了 pGreenⅡ-35S-EGFP-EBF2 融合载体，通过亚细
胞结构观察，证实 EBF2 定位于核内，符合转录因子特
性。同时构建了 pCambia1301-EBF2 植物超表达载体，
并由农杆菌介导的叶盘法转入 Micro Tom 番茄，经
PCR 及 GUS 组织化学染色鉴定，已获得转基因阳性植
株，为揭示番茄 EBF2 对果实发育和成熟的调控作用
奠定了基础。后续工作将对转基因植株及子代进一步
观察鉴定，并通过添加乙烯合成前体物质［15］或施用外
源乙烯观察植株的乙烯反应(如根、下胚轴、顶勾的生
长状况，果实发育及植株衰老的进程等)，同时通过分
子生物学方法检测 EIN3 等相关基因的表达状况，以
期进一步明确 EBF2 基因超表达所引起的乙烯信号转
导通路的变化及对植株生长发育造成的影响。该结果
可为明确 EBF 基因在番茄果实发育和成熟中的调控
作用提供参考。
参考文献:
［1 ］ Giovannoni J. Molecular biology of fruit maturation and ripening［J］.
Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，2001，52:725 － 749
［2 ］ 杨迎伍，李正国，张 利，陈国平 .乙烯信号的接受与转导［J］. 植
物生理学通讯，2003，39(5):547 － 552
［3 ］ Alonso J M，Stepanova A N. The Ethylene Signaling Pathway［J］.
394
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(3):490 ～ 494
Science，2004，306:1513 － 1515
［4 ］ Wang K L，Li H，Ecker J R. Ethylene biosynthesis and signaling
networks［J］. Plant Cell，2002，14:S131 － S151
［5 ］ Frugis G，Chua N H. Ubiquitin-mediated proteolysis in plant hormone
signal transduction［J］. Trends Cell Biol，2002，12:308 － 311
［6 ］ Potuschak T，Lechner E，Parmentier Y，Yanagisawa S，Grava S，
Koncz C，Genschik P. EIN3-Dependent regulation of plant ethylene
hormone signaling by two arabidopsis F box proteins:EBF1 and EBF2
［J］. Cell，2003，115(6):679 － 689
［7 ］ Guo H，Ecker J R. Plant responses to ethylene gas are mediated by
SCFEBF1 / EBF2 -dependent proteolysis of EIN3 transcription factor［J］.
Cell，2003，115(6):667 － 677
［8 ］ Kepinski S，Leyser O. SCF-mediated proteolysis and negative
regulation in ethylene signaling［J］. Cell，2003，115(6):647 － 648
［9 ］ Hellens R P，Edwards A E，Leyland N R，Bean S，Mullineaux P.
pGreen:A versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-
mediated plant transformation［J］. Plant Mol Biol，2000，42:819 －
832
［10］ Axelos M，Curie C，Mazzolini L，Bardet C，Lescure B. A protocol for
transient expression in Arabidopsis thaliana protoplasts isolated from
cell suspension culture［J］. Plant Physiol Biochem，1992，30:123 －
128
［11］ Pietrzak M，Shillito R D，Hohn T，Potrykus I. Expression in plants of
two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast transformation
with a new plant expression vector［J］. Nucleic Acids Res，1986，14
(14):5857 － 5868
［12］ Sun H J，Uchii S，Watanabe S，Ezura H. A highly efficient
transformation protocol for Micro-Tom，a model cultivar for tomato
functional genomics［J］. Plant Cell Physiol，2006，47(3):426 － 431
［13］ Gagne J M，Downes B P，Shiu S H，Durski A M，and Vierstra R D.
The F-box subunit of the SCF E3 complex is encoded by a diverse
superfamily of genes in Arabidopsis［J］. Proc Natl Acad Sci，2002，
99:11519 － 11524
［14］ Hershko A，Ciechanover A. The ubiquitin system［J］. Annu Rev
Biochem，1998，67:425 － 479
［15］ 郑宝强，王 雁，彭镇华，李晓华 . 卡特兰 ACO 基因克隆与反义
表达载体的构建［J］.核农学报，2009，23(3):442 － 446
(责任编辑 王媛媛
櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀櫀
)
(上接第 469 页)
［8 ］ 高俊凤 . 植物生理学实验指导［M］. 北京:高等教育出版社，
2006:144 － 148
［9 ］ 周艳虹，喻景权，钱琼秋，黄黎锋 .低温弱光对黄瓜幼苗生长及抗
氧化酶活性的影响［J］.应用生态学报，2003，14(6):921 － 924
［10］ Lu S Y，Peng X X，Guo Z F，Zhang G Y，Wang Z C，Wang C Y，
Pang C H，Fan Z and Wang J H. In vitro selection of salinity
tolerant variants from triploid bermudagrass (Cynodon transvaalensis
× C. dactylon )and their physiological responses to salt and drought
stress［J］. Plant Cell Rep，2007，26:1413 － 1420
［11］ 臧 威，张淑园，张国民，李柱刚，孙剑秋，张兰兰，严善春 . 用
60 Co γ射线诱导水稻抗瘟突变体的筛选［J］. 核农学报，2008，22
(3):248 － 252
［12］ Yang A，Zhu L，Zhao S，Zhang J. Induction of multiple bud clumps
from inflorescence tips and regeneration of salt-tolerant plantlets in
Beta vulgaris［J］. Plant Cell Tiss Org Cult，2004，77:29 － 34
［13］ 王月华，韩烈保，尹淑霞，王金来，程晓霞 . γ 射线辐射对高羊茅
种子发芽及酶活性的影响［J］. 核农学报，2006，20 (3):199 －
201
［14］ 卢少云，陈斯平，陈斯曼，梁 潇，郭振飞 . 三种暖季型草坪草在干
旱条件下脯氨酸含量和抗氧化酶活性的变化［J］. 园艺学报，
2003，30 (3):303 － 306
［15］ 赵 昕，李玉霖 .高温胁迫下冷地型草坪草几项生理指标的变化
特征［J］.草业学报，2001，10 (4):85 － 91
［16］ 朱维琴，吴良欢，冉勤南 . 干旱逆境下不同品种水稻叶片有机渗
透调节物质变化研究［J］.土壤通报，2003，24 (1):25 － 28
［17］ 李会云，郭修武 .盐胁迫对葡萄砧木叶片保护酶活性和丙二醛含
量的影响［J］.果树学报，2008，25(2):240 － 243
［18］ 马 炜，王彩云 .几种引进冷季型草坪草的生长及抗旱生理指标
［J］.草业科学，2001，18(2):57 － 61
(责任编辑 王媛媛)
494