全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1182 ～ 1184
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)06-1182-03
低氮胁迫下大麦谷氨酰胺酶基因的表达分析
陈志伟 陆瑞菊 王亦菲 何 婷 杜志钊 高润红
邹 磊 单丽丽 黄剑华
(上海市农业科学院生物技术研究所 /上海市农业遗传育种重点实验室，上海 201106)
摘 要:谷氨酰胺酶是氮代谢中的关键酶，在氨同化和谷氨酰胺生物合成中起着重要的作用。为研究谷
氨酰胺酶基因在大麦耐低氮中的作用机理，本研究利用荧光定量 PCR 技术检测了大麦中这两类谷氨酰
胺酶基因(GS1 和 GS2)在低氮胁迫下的表达情况，并分析了谷氨酰胺酶基因在耐低氮大麦基因型 BI-04
和低氮敏感大麦基因型 BI-45 间的表达差异。结果表明，GS1 基因在 BI-04 中表现为上调表达，而在 BI-
45 中表现为下调表达，但随着时间的延长其表达量恢复并超过对照;而 GS2 基因在两种大麦基因型中
的表达差不多，都表现为下调表达。另外，本文也观察到大麦谷氨酰胺酶基因的表达在黑暗条件下受到
抑制，因此推测其也受到光照条件的影响。
关键词:大麦;谷氨酰胺酶基因;耐低氮;荧光定量反转录 PCR
EXPRESSION ANALYSIS OF GLUTAMINE SYNTHETASE
GENE IN BARLEY UNDER LOW-NITROGEN STRESS
CHEN Zhi-wei LU Rui-ju WANG Yi-fei HE Ting DU Zhi-zhao GAO Run-hong
ZOU Lei SHAN Li-li HUANG Jian-hua
(Biotech Research Institute，Shanghai Academy of Agricultural Sciences / Shanghai Key Laboratory of
Agricultural Genetics and Breeding，Shanghai 201106)
Abstract:Glutamine synthetase (GS) is a key enzyme in nitrogen metabolism，it plays important roles in ammonia
assimilation and glutamine biosynthesis. To reveal the mechanisms of glutamine synthetase genes on low-nitrogen
tolerance in barley，the expression patterns of GS1 and GS2 genes in leaves under low-nitrogen stress were analyzed by
real time RT-PCR in this study，and the different expression between the low-nitrogen tolerance genotype BI-04 and the
sensitive type BI-45 were observed. The results showed that the expression level of GS1 was up-regulated rapidly after
low-nitrogen treating 1h in genotype BI-04，while it was down-regulated in genotype of BI-45，but the expression
resumed after treating 24h. The expression patterns of GS2 in the two genotypes were all down-regulated. In addition，
both of these two types of GS genes were restrained obviously in the dark condition，so we inferred that these genes were
infected by lights.
Key words:Hordeum vulgare L.;glutamine synthetase;low-nitrogen tolerance;real-time RT-PCR
收稿日期:2010-10-08 接受日期:2010-12-02
基金项目:大麦现代产业技术体系(NYCYTX-029)，上海市基础研究重点项目(09JC1412800)，公益性行业(农业)科研专项 (nyhyzx07-001-大
麦)，上海市农科院青年科技发展基金［农青年科技 2009(20)，2007(06)］
作者简介:陈志伟(1980-)，男，江苏溧阳人，硕士，研究实习员，研究方向为大麦分子育种。Tel:021-62203071;E-mail:czw1900@ yahoo. com. cn
陆瑞菊(1962-)，女，上海人，硕士，研究员，研究方向为作物组织 /小孢子培养研究。Tel:021-62202965;E-mai:cs7@ saas. sh. cn。陈志
伟，陆瑞菊并列第一作者。
通讯作者:黄剑华(1953-)，男，上海人，博士，研究员，研究方向为生物技术育种。Tel:021-62201032;E-mail:sw1@ saas. sh. cn
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6 期 低氮胁迫下大麦谷氨酰胺酶基因的表达分析
大麦是世界上列于小麦、玉米和水稻之后的第四
大作物，也是制造啤酒的主要原料，所以培育优质、高
产、广适的专用啤酒大麦品种越来越受到人们的重
视［1，2］。目前，我国大麦正面临着氮肥利用率低、品质
差等问题［3］，并已成为我国啤酒工业是否选用国产大
麦作为原料所争论的焦点，这严重影响着我国啤酒工
业的健康发展和麦农收益。究其原因，除品种外，生产
上氮肥施用过量是关键问题。氮素代谢是植物生长发
育中重要的生理途径，而谷氨酰胺酶(GS)在高等植物
氮素代谢途径中起着重要作用，也是无机氮转化为有
机氮的关键酶，它既参与氨的同化作用，又参与谷氨酰
胺的生物合成［4 ～ 6］。GS 存在多种同功酶，根据其在亚
细胞的定位，主要可以分为胞液型 GS1 和质体型
GS2［7，8］。目前关于大麦 GS 酶的研究主要集中在 GS
活性方面［9］，而关于 GS 基因表达方面的研究较少。
本试验利用荧光定量 PCR 技术研究低氮胁迫下对氮
素不同反应大麦基因型间 GS 基因的表达变化，在分
子水平揭示了 GS 基因的表达调控，为进一步研究大
麦耐低氮机理和大麦耐低氮育种提供服务，从而有效
减少氮肥施用量、提高大麦品质。
1 材料和方法
1. 1 材料
以耐低氮大麦(Hordeum vulgare L.)基因型 BI-04
和低氮敏感大麦基因型 BI-45 为试验材料。
1. 2 材料处理和试验设置
种子用 1% NaClO 消毒 30min 后清水冲洗干净，
30℃浸种 5h，25℃催芽过夜，露白后播于 96 孔板上进
行水培。营养液配方参考国际水稻所营养液配方，并
有所改动，以 NH4NO3 为氮源，营养液组成成分(mg /
L)如 下: NH4NO3 114. 3 (低 氮 处 理 时 为 28. 6)、
NaH2PO4·2H2O 50. 4、K2SO489. 3、CaCl2110. 8、MgSO4
·7H2O 405. 0、MnCl2·4H2O 1. 875、(NH4)6Mo7O24
· 2H2O 0. 0925、H3BO3 1. 1675、ZnSO4 · 7H2O
0. 04375、CuSO4 · 5H2O 0. 03875、FeC6H5O7 · 5H2O
14. 9875，pH6. 8 左右，按昼夜给予光照。到三叶期进
行低氮处理，处理时间从早上 10 点半开始，并分别在
处理 0、1、3、6、12、24 和 48h 时取幼叶置于 － 80℃保存
备用，其中只有 12h 为晚上取样。
1. 3 荧光定量 PCR 分析
1. 3. 1 RNA 提取和反转录 使用 Trizol Reagent
(Invitrogen)提取总 RNA，按 TRIZOL 试剂盒说明书进
行操作。采用 ND-1000 分光光度计(NanoDrop)进行
RNA 浓度和质量检测。使用 PrimeScriptTM RT reagent
试剂盒 (TaKaRa)合成 cDNA，按试剂盒说明书进行操
作。
1. 3. 2 荧光定量 PCR 根据 Genebank 中大麦基因序
列(X69087. 1、X53580. 1 和 AY145451. 1)，运用 Primer
Express Software Version 3. 0 (Applied Biosystem)分别
设计大麦 GS1、GS2 和 Actin 引物，序列分别如下(5′端
到 3′端):GS1-F:CCTTGTCATGTGCGATTGCT，GS1-R:
GCAGCGTTGTATCTCTTGTTGGT; GS2-F: GAGCTG-
GCTGCCACACAA，GS2-R:TGATCACGTCGAAACCTC-
CAT;Actin-F:AGCCACACTGTGCCCATTTAT，Actin-R:
CAGCGAGATCCAAACGAAGAA。引物由上海英骏生
物技术有限公司合成。
采用 StepOne Real-Time PCR system (Applied
Biosystem)进 行 荧 光 定 量 PCR，反 应 试 剂 使 用
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (TOYOBO)。荧光定
量 PCR 反应体系(20μl):2 × Mix 10μl，引物(10μmol /
L)各 0. 6μl，样品 cDNA(约 50ng /μl)2μl，ddH2O 6.
8μl。荧光定量 PCR 反应程序:95℃ 预变性 10min;
95℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 10s，40 个循环。
1. 4 数据处理
采用 Microsoft office excel 2003 软件对数据进行
统计分析。
2 结果与分析
2. 1 低氮胁迫下 2 个大麦基因型地上部 GS1 基因的
表达变化
从图 1 中可以看出，低氮胁迫后 0 到 6h，大麦 GS1
基因在 BI-04 中的表达明显加强，在 12h 时，其表达明
显受抑，而在处理 24h 后，其表达水平明显高于对照，
因此大麦 GS1 基因在 BI-04 中的表达在整个低氮处理
中基本是增强表达的。而对于 BI-45，在处理 1h 时，大
麦 GS1 基因的表达就明显减弱，尽管在处理 3h 时，表
达有所增强，但是在 6h 和 12h 表达又出现了明显的下
降，不过 24h 后其表达又恢复甚至超过对照，因此大麦
GS1 基因在 BI-45 中的表达只是在低氮处理的初期出
现了明显的下调。考虑到 BI-04 是耐低氮大麦基因
型，而 BI-45 是对低氮敏感的大麦基因型，因此 GS1 基
因在胁迫初期的这种上调表达可能更有利于大麦对低
氮条件的适应。
2. 2 低氮胁迫下 2 个大麦基因型地上部 GS2 基因的
表达变化
从图 2 可以看出，低氮胁迫后，大麦 GS2 基因在 2
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图 1 低氮胁迫下 GS1 在 BI-04 和 BI-45 中的相对表达量
Fig. 1 Relative expression level of GS1
in the genotype of BI-04 and BI-45 under
low-nitrogen stress
个基因型中的表达是比较相似的，即处理 1h 时，其表
达明显下降，然后又上升，在 12h 时又明显下降，但在
24h 时其表达又明显超过对照，而在 48h 时其表达又
开始回落。综合考虑 2 个大麦基因型对低氮条件的差
异表现，因此推测 GS2 基因对于大麦在低氮胁迫下的
适应可能影响较小。
图 2 低氮胁迫下 GS2 在 BI-04 和 BI-45 中相对表达量
Fig. 2 Relative expression level of GS2 in
genotypes of BI-04 and BI-45 under
low-nitrogen stress
3 讨论
大量研究表明，谷氨酰胺酶在植物氮代谢中起着
重要作用［10］，对于植物在低氮条件下的适应影响显
著［4］。目前，在大麦上分别已经克隆了胞质型谷氨酰
胺酶基因［11］和质体型谷氨酰胺酶基因［12］，但关于低
氮条件下这 2 个基因在耐低氮差异品种中表达差异并
不清楚。本研究所用的两个大麦材料在耐低氮性上具
有明显的差异［13］，因此利用这两个基因型有利于研究
大麦 GS 基因在大麦耐低氮性中的作用机理。试验结
果表明在低氮胁迫下，GS1 基因在耐低氮差异基因型
中的表达模式是不同的，而 GS2 基因在耐低氮差异基
因型中的表达模式是相类似的。很多研究认为，胞质
型谷氨酰胺酶在植物氮素代谢中起着重要的作
用［14，15］，转胞质型谷氨酰胺酶基因植物在低氮条件下
也表现出较好的适应性［16，17］。本研究中，大麦胞质型
谷氨酰胺酶基因在 2 个耐低氮差异基因型间的表达差
异可能也反映了这两个基因型对低氮胁迫耐性的不
同，即大麦 GS1 基因在低氮胁迫下的迅速上调可能更
有利于植物对低氮胁迫的适应。
另外，Oliveira 等［17］认为水稻 GS1 酶受到光照条
件的调控，它很可能是通过光合作用或光呼吸作用来
起作用，此外 GS2 基因在豌豆中的表达也是受到光照
和光呼吸作用来调控的［18］。本试验是从上午 10 点半
开始取样的，在氮胁迫处理期间仍然按照昼夜给与光
照，因此在处理 12h 时取样即为黑暗条件下取的样。
从基因表达的情况来看，处理 12h 时谷氨酰胺酶基因
在 2 个基因型中其表达都明显受到抑制，所以本文检
测大麦中谷氨酰胺酶基因可能也受到光照条件的影
响。
参考文献:
［1 ］ 张玉红，巴桑玉珍，寿建昕，边红武，韩 凝，强小林，朱睦元 . 不同
基因型大麦品种大麦油及其母育酚含量的变异规律［J］.麦类作
物学报，2007，27(4):721 － 724
［2 ］ 陆瑞菊，杜志钊，陈志伟，何 婷，王亦菲，黄剑华 . 大麦空间诱变
SP2 和 SP3 代萌发期耐盐性变异［J］. 核农学报，2010，24(5):
901 － 909
［3 ］ 杨 力，许学荣，李长亚，唐义军，姚成勇，周汝芹，陶 红 .啤麦籽粒
高蛋白质含量对麦芽品质的影响及其对策［J］.大麦科学，2005，
03:4、14、24
［4 ］ Kumada Y，Benson D R，Hillemann D，Hosted T J，Rochefort D
A，Thompson C J，Wohlleben W， Tateno Y. Evolution of the
glutamine synthetase gene，one of the oldest existing and functioning
genes［J］. PNAS，1993，90:3009 － 3013
［5 ］ 潘丽峰，李昆志，陈丽梅 . 谷氨酰胺合成酶植物基因工程应用研
究进展［J］.广东农业科学，2007，1:106 － 109
［6 ］ 李锦辉，李潮海 .不同基因型玉米氮素利用的机理研究［J］.核农
学报，2007，21(2):173 － 176.
［7 ］ 王小纯，安 帅，熊淑萍，程振云，陈新建，孟凡荣，马新明 . 小麦叶
片谷氨酰胺合成酶的分离纯化及鉴定［J］.麦类作物学报，2010，
30(1):83 － 86
［8 ］ Bernard S M，Meller A L，Dionisio G，Kichey T，Jahn T P，Dubois
F，Baudo M，Lopes M S，Tercé － Laforgue T，Foyer C H，Parry M
A，Forde B G，Araus J L，Hirel B，Schjoerring J K，Habash D Z.
Gene expression， cellular localisation and function of glutamine
synthetase isozymes in wheat (Triticum aestivum L.) ［J］. Plant
Molecular Biology，2008，67:89 － 105
(下转第 1207 页)
4811