全 文 ：此文于 1998 年 2 月 23 日收到。
联合国粮农组织和国际原子能机构联合处资助课题。
用放射免疫测定法分析土壤中
莠去津残留量的研究
徐德武1 杨根海2 秦凤琴2 徐 坤1 阎美玉3
(山东省莱阳农学院 莱阳 2652001 中国农业大学基础科技学院 北京 1000942
山东省莱阳市环保局 莱阳 2652003)
根据莠去津均三氮苯类结构的特征 ,合成连有活性羧基的莠去津半抗原 ,通过活
性脂法与牛血清白蛋白联接 ,制备出较高生物活性的人工抗原 ,以此免疫兔子获得抗
莠去津的多克隆抗体。抗体的特异性强 ,与扑灭津的交叉反应性为 93 % ,与西玛津
的交叉反应性为 8 %。以3 H 标记莠去津建立的莠去津放射免疫测定法对土壤中莠
去津添加回收率的测定表明 ,沙土的添加回收率为 8517 %～9510 % ,壤土的添加回
收率为 8619 %～9211 %。
关键词 :莠去津 放射免疫测定法 土壤 残留量
前 言
莠去津的化学名称为 22氯242乙胺基262异丙胺基均三嗪 ,是一种均三氮苯类除草剂 ,以根
部内吸为主 ,并兼有一定茎、叶内吸作用 ,可破坏植物的光合作用 ,主要用于玉米、高粱、甘蔗、
果园等田地防除一年生杂草。因其使用后 ,在土壤中的残效期长 ,残留量大 ,在一定程度上危
害后茬作物的生产 ,为此有必要对土壤中莠去津的残留量进行分析 ,以指导农业生产。
莠去津残留量常用的分析方法主要是传统的仪器分析方法[1～6 ] ,这些传统分析方法因操
作繁琐、费时、灵敏度和特异性有限 ,远远满足不了大批样品的常规筛检[7～9 ] 。而免疫测定法
特异性和灵敏度高 ,可避免分析工作中复杂样本中杂质的干扰和简化前处理步骤 ,对某些样品
甚至不需要任何纯化处理即可直接用于分析测定[11 ,12 ] 。本试验的目的在于开发研究莠去津
残留量的放射免疫测定法。
材 料 和 方 法
试验材料 主要化学试剂 :莠去津由 IAEA 提供 ;扑灭津、西玛津、异丙胺、氨基己酸、N ,
N2二甲基甲酰胺、N2羟基琥珀酰亚胺和 N ,N2二环己基碳二亚胺购自 Sigma 公司 ;氰尿酰氯购
自 Fluka 公司 ;牛血清白蛋白 (进口分装) 、费氏不完全佐剂、费氏完全佐剂、3 H2atrazine (中国农
业科学院原子能利用研究所标记 ,放射比度 200mCi/ mmol) 、TRITONR ×100 ( HON GKON G)
均为分析纯。
903 核 农 学 报 1998 ,12 (5) :309～313
Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
试验仪器包括紫外分光光度计 (日本岛津 UV2190) 、磁力搅拌器、硅胶板、熔点仪、核磁共
振仪、加样器 (eppendorf) 、透析袋 (允许透过分子量 < 10000 道尔顿) 、流体闪烁计数仪 (美国
PACKARD) 、离心管和旋转蒸发器。
试验方法 莠去津半抗原的合成 :以氰尿酰氯为基础原料化学合成己酸莠去津 ,并以此作
为莠去津半抗原 ,合成物通过1 HNMR、薄层层析法鉴定。
莠去津人工抗原的制备 :用己酸莠去津和牛血清白蛋白通过活性酯法合成莠去津2牛血清
白蛋白复合物 ,以此来免疫动物制备抗莠去津抗血清。
特异性抗体的制备 :莠去津人工抗原与佐剂乳化后 ,分别对 3 只新西兰雄性白兔进行颈、
背部皮内、皮下及腿部肌内注射 ,首次免疫使用福氏完全佐剂 ,第 2、3、4 次免疫使用福氏不完
全佐剂 ,每次免疫后 7～10d 耳缘静脉采血测定抗血清效价 ,待终点效价大于 2500 以上 ,心脏
采血 ,制备抗血清。
莠去津的放射免疫测定程序 :用磷酸缓冲液 (p H712)配制一系列标准溶液 ,平行双管进行
测定游离的3 H2atrazine 的放射性活度 ( F) ,将测定数据换算成结合率B % ,进行 logit 转换 ,以标
准莠去津含量的对数值 lg 为横坐标 ,以 logit (B/ B0) 为纵坐标 ,绘制标准曲线 ,据样品管 logit
(B/ B0)值 ,可从标准曲线上查出莠去津含量。
结 果 与 分 析
(一) 莠去津人工抗原的鉴定
对 atrazine2BSA、BSA、atrazine 羧酸衍生物进行紫外光谱分析发现 ,at razine2BSA 的最大吸
收峰 (λmax)为 250nm ,不同于 BSA 的最大吸收峰 (λmax) 280nm ,这是由于在 BSA 上连接了均
三氮苯环 ,从而使 atrazine2BSA 与 BSA 的吸收峰相比 ,出现明显的蓝移现象 ,所制备复合物
内 ,由紫外光谱分析推算出 atrazine 与 BSA 的摩尔比约为 11∶1 ,与 Jean2Marc Scllaeppi 等的偶
联率相同[8 ] ,较 Bohn Dunbar 等 [7 ]的偶联率高 ,与一般最佳抗原的偶联率 (10～20∶1) 吻合[12 ] ,
表明 atrazine2BSA 可用于动物免疫 ,以制备莠去津放射免疫测定 ( RIA) 用的抗 atrazine 抗血
清。
图 1 抗莠去津抗血清的稀释曲线
Fig 1. Dilution curve of anti2atrazine antiserum(二) 兔抗莠去津抗血清的检验以合成的 atrazine2BSA 对 3 只雄性新西兰白兔免疫 2 个月以后 ,接受免疫的白兔血清中都有抗 atrazine 抗体产生 ,其中 1667 号家兔所产生的抗体与 atrazine 的结合力最强 ,用 RIA 对其滴度进行测定如图 1 ,从图 1 中可以看出抗血清的滴度约 2500 左右 ,适合于 atrazine 的放射免疫测定。(三) 交叉反应性的测定本试验用放射免疫测定法对与莠去津结构相似的化合物进行测定 ,测定结果如表 1。从表 1 可以看出扑灭津 (propazine) 的交叉
反应性为 93 % ,西玛津 ( simazine) 的交叉反应性
013 核 农 学 报 12 卷
为 8 % ,这说明 ,在免疫测定中 ,所制备抗体的特异性识别与均三氮苯环的第三位置异胺基有
关。
表 1 抗莠去津抗体与均三氮苯类化合物的交叉反应性
Table 1 Cross2reactivity between anti2atrazine antibody and compounds of 1 ,3 ,52t riazine
农药商品名
Commercial
names
化学名称
Compounds
结构式
Structure formula
I50
(ng/ ml)
交叉反应性
Cross2
reactivity
莠去津
Atrazine
22氯24 (乙基氨)262(异丙氨)均三氮苯
22chloro242ethylamino262
isopropylamino21 ,3 ,52triazine
N
N N
HCHN
CH3
CH3
Cl
NHC2H3
715 100 %
扑灭津
Propazine
22氯24 ,62二 (异丙胺)均三氮苯
22chloro24 ,62diisopropylamino21 ,3 ,52triazine
N
N N
HCHN
CH3
CH3
Cl
NHCH
CH3
CH3
811 93 %
西玛津
Simazine 22氯24 ,62二 (乙基胺)均三氮苯
22chloro24 ,62diethylamino21 ,3 ,52triazine
N
N N
H3C2HN
Cl
NHC2H5
318 8 %
注 :交叉反应性 ( %) = 莠去津 50 %抑制浓度均三氮苯化合物 50 %抑制浓度×100 %
Note :Cross2reactivity ( %) = I50 %of atrazineI50 % of (1 ,3 ,52triazine) ×100 %
(四) 添加回收率的测定
取 5g 土样 ,按表 2 和表 3 所示浓度添加相应体积的 5μg/ ml 莠去津甲醇溶液 ,风干平衡
后 ,加入 25ml 95 %甲醇振荡提取 (12h) ,取滤液 1ml 经 1∶100 倍稀释 ,用本实验建立的 RIA 法
测定添加回收率 ,以确定 RIA 法的准确性。表 2 表明 ,对添加不同莠去津含量的沙土 ,用本试
验建立的莠去津放射免疫测定法可准确地分析出其含量。测得其添加回收率为 8517 %～
95 % ,表明所建立的莠去津的放射免疫测定法对土壤中莠去津残留分析的准确性好。
表 2 合成沙土 atrazine 添加回收率的测定
Table 2 Rate of recovery of compound sandsoil by adding atrazine
样品
Sample
添加 atrazine 量
Ammout of atrazine added
in soil (ppb)
RIA 测定 atrazine 量
Result of RIA
(ppb)
添加回收率
Rate of
Recovery ( %)
CV %
沙土
Sand soil
0 01083 ±01005 515
1 01984 ±01051 9011 512
2 11983 ±01120 9510 610
3 21689 ±01112 8619 412
4 31510 ±01147 8517 412
113 5 期 用放射免疫测定法分析土壤中莠去津残留量的研究
讨 论
11 莠去津放射免疫方法测定的特异性 :本试验所制备的抗莠去津抗体与 propazine 的交
叉反应性为 93 % ,与 simazine 的交叉反应性为 8 % ,测定值与 B1Dunbar 等[7 ]的研究结果相一
致 (propazine 交叉反应性为 90 % ,simazine 交叉反应性为 10 %) ,而与 Schlaeppi [8 ]等的研究结
果有所不同 (propazine 交叉反应性为 90 % ,simazine 的交叉反应性为 215 %) 。探究其原因 ,作
者认为造成这种差别的主要因素在于二者免疫测定中所用的抗体不同 ,作者与 Dunbar 等的免
疫测定中 ,所制备抗体都是多克隆抗体 ,特异性相对较小 ,而 Schlaeppi 等的免疫测定中 ,所制
备的抗体为单克隆抗体 ,其特异性强。
21 基质对测定结果的影响 :为研究基质对放射免疫测定法分析土壤中 atrazine 残留的影
响 ,本试验对两种不同的加样土壤进行分析比较 ,如表 3 所示。
表 3 不同土壤基质对 RIA测定结果的影响
Table 3 Influence of different soil matrices on results of RIA
样品
Sample
添加 atrazine 量
Ammout of atrazine added
in soil (ppb)
RIA 影响值
Result of RIA
(ppb)
添加回收率
Rate of recovery
( %)
CV %
0 01083 ±01005 515
沙土 1 01984 ±01051 9011 512
Sand soil 2 11983 ±01120 9510 610
3 21689 ±01112 8619 412
4 31510 ±01147 8517 412
0 01103 ±01003 217
壤土 1 01993 ±01074 8910 715
Clay soil 2 11945 ±01072 9211 317
3 21719 ±0180 8712 219
4 31578 ±01152 8619 411
用本试验所建立的 RIA 对表 3 中两种不同有机质含量的土壤进行分析 ,其中沙土有机质
含量为 0167 % ,壤土有机质含量为 2114 %。用所建立的莠去津的放射免疫测定法能够准确测
出这两种低有机质含量土壤提出液中的莠去津含量 ,表明低有机质基质对 RIA 的测定结果不
产生影响。
致谢 :在本论文完成过程中 ,张起刚教授给予了极大支持 ,同时彭根元教授、钱传范教授、齐孟文副教授、王化国先生也
提供许多宝贵的意见。王敏教授、周洪杰副研究员分别在莠去津半抗原的合成及其3H 标记给予了大力的帮助。在此一并
表示衷心的感谢。
参 考 文 献
1 Wigfield Y Y. , Ralph G. Analysis for atrazin in fortified cornmeal and corns using a commercially available enzyme immunoas2
say microtiter plate. Bull Environ Contam. Toxicol. 1993 ,51 :171～177
2 Vickery T M , Karlesky. D L ,Blackmer G L . Colorimetry and high performance liquid chromatography of atrazine residues in
soil :comparison of methods. J AoAc 1980 , 63 :506～510
3 Sherma J . Determination of triazine and chlorphenoxyacid herbicides in natural water samples by solid phase extraction and
213 核 农 学 报 12 卷
quantitative thin layer chromatography. J Liq Chomatogr 1986 ,9 :3433～3485
4 Vermeulen N M J , Apostolides Z , Potgieter D J J , Nel P C , Separation of atrazine and some of its degradation products by
high2performance liquid chromatography of atrazine residues in soil :comparision of methods. J AoAc. 1980 , 63 :506～510
5 Dicorcia A , Marchetti M , Samperi R. Rapid determination of simazine and atrazine in water at the parts pertrillion level. J
Chromatogr , 1987 , 405 :357～367
6 Roseboom H , Herbold H. A Determination of triazine herbicides in various crops by capillary gas chromatography with
thermionic detection. J Chromatorgr. 1980 202 :431～438
7 Dunbar , b d , Niswender G D , Hudson J M. Antibody for the detection and quantification of atrazine. U S Patent 1985 , 4 ,
530 ,786
8 Schlaeppi J2M , Fory WL , Ramsteiner K. Hydroxyatrazine & water by enzyme2linked immunosorbent assay using specific
monoclonal antibodies. J Agric Food Chem. 1989 ,37 :1532～1538
9 Bushway RJ Perkin B , Savage SA , Lekousi SL , Ferguion BS Determination of atrazine residues in food by enzyme immunoas2
say. Bull Environ Contam Toxico. 1989 142 :899～904
10 Wittmann C , Hock B. Improved enzyme immunoassay for the analysis of s2triazines in water samples. Food Agric Immunol
1989 ,4 :211～224
11 Giersch T. A new monoclonal antibody for the sensitive detection of atrazine with immunoassay in microtiter plate and dipstick
format . J Agric food Chem. 1993 ,41 :1006～1011
12 Schneider P , Hammock B D. Influence of the EL ISA format and the hapten2enzyme conjugate on the sensitivity of an im2
munoassay for s2triazine herbicides using monoclonal antibodies. J Agric Food Chem. 1992 ,40 :525～530
ANALYSIS ATRAZINE RESID UES IN SOILS USING RADIOIMMUNOASSAY
Xu Dewu1 Yang Genhai2 Qin Fengqin2 Xu Kun1 Yan Meiyu3
( Depart ment of A ni mal Science , L aiyang A gricult ural College , L aiyang 2652001
Depart ment of Biophysics , China A gricult ural U niveraity , Beiji ng 1000941
L aiyang City Envi ronment Protection B ureau , L aiyang 2652003)
ABSTRACT
The determination of atrazine residue in soil with radioimmunoassay method was studied.
The high bioactive antigen was synthesized and the high titer anti2atrazine antibody was pre
pared. The antiserum was specif ic for atrazine , the cross2reactivity of the antiserum to
propazine and simazine was 93 %and 8 %, respectively. The RIA for atrazine labeled by 3 H was
establ ished and showed that the rate of recovery by adding atrazine in sand and clay soils were
8917 %～9510 %and 8619 %～9211 %, that the recoveries of atrazine in sand and clay soil were
8517 %～9510 %and 8619 %～9211 %,respectively.
Key words :Atrazine , radioimmunoassay , soil residue
313Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1998 ,12 (5) :309～313