全 文 ：© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
文章编号 :100028551 (2009) 052766207
根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得
王玉华1 　韩晓玲2 　郝建国1 　贾敬芬1
(11 陕西省生物技术重点实验室Π西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室Π西北大学生命科学学院 ,陕西 西安　710069 ;
21 西安力邦制药有限公司医药科学研究所 ,陕西 西安　710075)
摘 　要 :为建立根癌农杆菌介导的草莓褪黑素基因高效遗传转化体系 ,以草莓品种“早红”叶片和叶柄为
外植体 ,优化了影响根癌农杆菌遗传转化的因素 ,包括农杆菌菌液浓度、侵染时间、共培养时间和预培养
时间等 ,建立了适宜草莓“早红”的农杆菌遗传转化体系。结果表明 ,“早红”草莓适宜的转化条件是 :外
植体的最适预培养时间为 2～3 d ,农杆菌侵染的最佳菌液浓度为 OD600 013～015 ,最适侵染时间为 15
min ,最适共培养时间为 3 d。在此基础上 ,通过根癌农杆菌介导法将褪黑素合成关键酶 N2乙酰转移酶
(AANAT)和羟吲哚2O2甲基转移酶 (HIOMT) 基因 AANAT 和 HIOMT 转入草莓基因组 ,并对获得的抗性植
株进行 PCR 和 PCR2Southern blot 检测分析 ,结果表明外源基因已经整合进草莓基因组中。RT2PCR 分析
证明外源基因已经在转录水平表达。
关键词 :农杆菌 ;褪黑素 ;草莓 ;遗传转化
OBTAINING TRANSGENIC PLANTS OF STRAWBERRY BY Agrobacterium tumefaciens
HARBORING MELATONIN SYNTHETASE GENES
WANG Yu2hua1 　HAN Xiao2ling2 　HAO Jian2guo1 　J IA Jing2fen1
(11 Shaanxi Provincial Key Laboratory of BiotechnologyΠKey Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western ChinaΠCollege of Life Sciences ,
Northwest University , Xi’an , Shaanxi 710069 ; 21 Pharmaceutical Sciences Research Institute ,
Xi’an Libang Pharmaceutical Co. , Ltd . , Xi’an , Shaanxi 710075)
Abstract : In order to establish Agrobacterium tumef aciens2mediated melatonin synthetase genes transformation system for
strawberry , leaves or petioles were used as explants , and some factors influencing the transformation efficiency , such as the
concentration and infection duration of Agrobacterium , the time of both co2culture and pre2culture , were optimized to establish
a stable Agrobacterium mediated gene transfomation protocol of strawberry. The results indicated that the optimal pre2culture
time of explants was 2～3 d ; concentration of Agrobacterium OD600 013～015 ; infection time 15 min , and the co2culture time
3d. Then , melatonin synthetase genes of both AANAT (encoding Arylalkylamine N2acetyltransferase , AANAT) and HIOMT
(encoding Hydroxyindole O2methyltransferase , HIOMT) were transferred into strawberry ( Fragaria ananassa Duch cv.
zaohong) mediated by Agrobacterium tumef aciens . Transgenic plants were regenerated and characterized by using PCR
analysis , PCR2Southern blot and RT2PCR detection , which confirmed that the foreign genes had been integrated into
strawberry genome and transcripted properly.
Key words : Agrobacterium tumef aciens ; melatonin ; strawberry ; genetic transformation
收稿日期 :2009206201 　接受日期 :2009207201
基金项目 :国家自然科学基金 (30671082) ;陕西省自然科学基金 (2006C102) ;西北大学西部资源生物与现代生物技术重点实验室开放基金
作者简介 :王玉华 (19752) ,女 ,山东肥城人 ,博士 ,讲师 ,主要从事植物基因工程研究。Tel : 029288303484 ; E2mail : wangyh @nwu. edu. cn
通讯作者 :贾敬芬 (19382) ,女 ,河北深泽人 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物细胞工程研究。Tel : 029288303484 ; E2mail : jiajf38 @nwu. edu. cn　　褪黑素 (melatonin , MT) 又称松果体素 ,化学结构 为 N2乙酰基252甲氧基2色胺 ,是色氨酸的吲哚衍生物。
667　 核 农 学 报　2009 ,23 (5) :766～772Journal of Nuclear Agricultural Sciences
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
因其能使两栖类动物的皮肤变白被命名为褪黑素[1 ] 。
作为松果体分泌的激素之一 ,MT 具有抗衰老、免疫调
节、抗氧化、清除自由基等作用[2 , 3 ] ,同时也具有抗炎、
镇痛、镇静等功效。MT 不仅存在于脊椎动物 ,也存在
于无脊椎动物、藻类、真菌和细菌[4～6 ] ,1995 年首次在
植物中被发现[7 ] ,近年来研究表明 MT 普遍存在于高
等植物 ,特别是一些药用和食用植物中[8 , 9 ] 。虽然已
经证实 MT 在高等植物中普遍存在 ,但研究大多局限
于对植物内源 MT含量的测定 ,而有关 MT在植物中的
许多生理功能及其作用机理等还不清楚。利用转基因
技术提高植物 MT含量以及 MT在植物中的功能研究 ,
目前还未见报道。有研究发现 ,老鼠食用 MT 含量较
高的胡桃后 ,血液中 MT 的水平显著增加[10 ] 。由此受
到启发 ,如果人直接食用 MT含量较高的水果或蔬菜 ,
人体内 MT 的水平也有可能相应提高 ,这对于调节人
的生物钟、改善睡眠将起到非常好的效果 ,它既可以代
替口服化学合成的 MT 药物的作用 ,又避免了化学合
成药物给人带来的毒副作用 ,还大大节约化学合成成
本。
鉴于此 ,作者在已经建立的草莓高效再生体系 (待
发表)的基础上 ,系统研究了影响农杆菌转化草莓的诸
多因素 ,优化了转化条件 ,将来自人的 MT合成途径中
的两个关键酶 (N2乙酰转移酶和羟吲哚2O2甲基转移
酶) 基因 AANAT 和 HIOMT 导入享有“水果皇后”之美
誉的草莓核基因组 ,获得再生植株 ,不仅为培育保健型
草莓新品种提供新材料 ,同时为借助转褪黑素基因的
草莓分析 MT在植物中的功能奠定基础。
图 2 　载体 pYXU55 T2DNA 结构图
Fig12 　Diagram of T2DNA region of p YXU551 　材料与方法111 　植物材料及其培养条件意大利草莓品种“早红”组培苗 ,在光照强度 1500～2000lx、光周期 16 h 光照Π8 h 黑暗、温度 25 ℃±2 ℃条件下培养 ,在继代培养基 MS21 (MS + 62BA 012 mgΠL+ GA3 012 mgΠL)上培养 25～30 d 后 ,取完全伸展开的
叶片及其叶柄为外植体进行遗传转化。转化所用预培
养和共培养培养基为 MS22 :MS + 62BA 310 mgΠL + 2 ,42
D 011 mgΠL ;筛选分化培养基为 MS23 :MS + 62BA 310
mgΠL + 2 ,42D 011 mgΠL + Gen 100 mgΠL + Cef 300 mgΠL ;
筛选继代培养基为 MS24 :MS + 62BA 012 mgΠL + GA3
012 mgΠL + Gen 100 mgΠL ;生根培养基为 MS25 :1Π2MS +
IBA 012 mgΠL + Gen 100 m gΠL。上述培养基均添加 3 %
的蔗糖和 016 %的琼脂 ,pH为 518。
图 1 　植物双元表达载体 pYXU55 结构图
Fig11 　The sketch map of the expression vector p YXU55
112 　根癌农杆菌介导的遗传转化
根癌 农 杆 菌 ( Agrobacterium tumef aciens ) 菌 株
LBA4404 和植物双元表 达 载 体 p YXU55 由 美 国
Vanderbilt 大学许耀博士惠赠。载体 p YXU55 (图 1) 携
带有庆大霉素抗性基因和来自人的褪黑素合成关键酶
基因 AANAT (编码 N2乙酰转移酶 , Arylalkylamine N2
acetyltransferase , AANAT ,Genbank 登录号为 U40347) 与
HIOMT (编码羟基吲哚 O2甲基转移酶 ,Hydroxyindole O2
methyltransferase , HIOMT , Genbank 登录号为 U11090) ,
其 T2DNA 区结构示意如图 2 所示。
767　5 期 根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
取完全展开的草莓叶片及叶柄作外植体 ,较小的
叶片去除四周叶缘 ,较大的叶片去除四周叶缘后沿叶
面两侧以与主脉垂直方向交错切 2～4 个伤口 ,并保持
叶片基本完整 ,叶背面接触培养基 ,叶柄切成 015 cm
左右的切段 ,平放在培养基表面 ,在 MS22 培养基中预
培养。挑取根癌农杆菌 LBA4404 (p YXU55) 单菌落 ,接
种在附加有 100μgΠml 链霉素 (Streptomycin , Str) 、25μgΠ
ml 利福平 ( Rifampicin , Rif ) 和 100 μgΠml 壮观霉素
(Spectinomycine , Spc) 的 YEB 液体培养基中 ,28 ℃、180
rΠmin 振荡培养过夜 ,之后将培养物按 1 %的比例转接
入含有相同成分的新鲜 YEB 液体培养基中继续培养
至对数生长期 (OD600 = 016 左右) ,收集菌液 ,2500g 离
心 3 min ,弃培养液 ,菌体用无菌 MS0 液体培养基重悬
后用于外植体侵染。转化后的外植体在筛选分化培养
基MS23 上培养 ,抗性小芽长到 3～5 mm 后转入继代培
养基继续培养 ,之后在生根培养基中培养生根。
113 　菌液浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间
对草莓转化的影响
草莓外植体预培养 1～5 d 后 ,用 MS0 液体培养基
分别稀释农杆菌菌液至 OD600 = 011、013、015、017 和
019 进行侵染 ,以未侵染的外植体为对照 ,侵染时间分
别为 5、10、15、20 和 25 min ;侵染后用无菌滤纸吸干外
植体周围的菌液 ,转接到 MS22 培养基中进行共培养 ,
培养时间分别为 1、2、3、4 和 5 d ;共培养后的外植体用
无菌水冲洗后转接到筛选分化培养基 MS23 上 ,30 d 后
统计庆大霉素 ( Gen) 抗性愈伤组织发生率。每组处理
外植体数 50 个左右 ,重复 3 次。
114 　转基因植株的分子检测
11411 　转基因植株的 PCR、PCR2Southern 检测 　根据
载体 p YXU55 序列设计 3 对特异引物 (表 1) ,CTAB 法
微量制备[11 ]抗性植株和未转化植株的基因组 DNA 作
模板 ,PCR 分别检测庆大霉素抗性基因 aacC1、褪黑素
合成关键酶基因 AANAT 和 HIOMT 在基因组中的插入
情况。PCR 扩增体系为 25μl ,扩增程序为 :94 ℃预变
性 5 min ;94 ℃变性 1 min ,58 ℃退火 1 min ,72 ℃延伸 1
min ,30 个循环 ;最后 72 ℃延伸 7 min。
将 3 个基因的扩增产物片段切胶回收纯化 ,等量
混合后用地高辛标记与检测试剂盒 (购自 Roche 公司)
标记 ,对部分 PCR 扩增呈阳性的转基因植株进行 PCR2
Southern 检测。
11412 　转基因植株的 RT2PCR 检测 　分别提取部分草
莓转基因植株和未转化植株总 RNA ,用M2MLV 第一链
cDNA 合成试剂盒进行反转录。以 cDNA 的第一链为
模板 ,PCR 扩增庆大霉素基因 aacC1 , 所用引物、反应
体系及 PCR 程序同 11411。
表 1 　转基因草莓 PCR 检测用引物
Table 1 　Primers used for PCR analysis
of transgenic strawberry
扩增片段
fragment
引物名称
primer
引物序列 (5′23′)
sequence of primer (5′23′) PCR 产物长度length of fragment
aacC1 GEN2U TACGCAGCAGCAACGATG 481bp
GEN2L ATGCCCAACTTTGTATAGAGA
AANAT AANAT2U CGGCACTTCCTGACCCTATGT 349bp
AANAT2L TGAGGGAGCCCACGGTGATT
HIOMT HIOMT2U AGCGACTACCTGACCACG 572 bp
HIOMT2L TACCCAGAATGCCACCACC
2 　结果与分析
211 　农杆菌对草莓“早红”转化条件的优化
21111 　菌液浓度对抗性愈伤组织发生率的影响 　用
MS0 液体培养基调整农杆菌菌液 OD600值分别为 011、
013、015、017 和 019 后侵染外植体 ,侵染时间 10 min ,
暗处共培养 3 d 后进行选择培养 ,选择培养 30d 后统
计愈伤组织发生率。由图 3 可见 ,菌液浓度直接影响
抗性愈伤组织发生率 ,随菌液浓度的增加 , Gen 抗性愈
伤组织发生率增加 ,当OD600值为 013 和 015 时 ,抗性愈
伤组织发生率无显著差异 ,均在 45 %以上 ,且在选择
培养时无农杆菌污染 ;当 OD600 ≥017 时 ,抗性愈伤组织
发生率明显降低 ,且选择培养时出现大量农杆菌覆盖在
外植体上 ,致使部分外植体褐化、死亡。因此 ,选定草莓
“早红”转化适宜的菌液浓度为 OD600 013～015。
图 3 　农杆菌菌液浓度对抗性愈伤组织发生率的影响
Fig. 3 　Effects of Agrobacterium concentration
on resistant callus rate
邓肯氏新复极差测验 , P = 0. 05 , 不同字母表示差异显著。下图均同
Duncan’s test at P = 0. 05. Different letters indicate significant . The same as
following figure
867 核　农　学　报 23 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
21112 　侵染时间对抗性愈伤组织发生率的影响　用
OD600为 015 的菌液分别侵染外植体 5、10、15、20、25 和
30 min ,暗处共培养 3 d 后选择培养 ,30 d 后统计抗性
愈伤组织形成情况。由图 4 可见 ,随侵染时间的增加 ,
抗性愈伤组织发生率明显提高 ,侵染时间为 10 和 15
min 时 ,抗性愈伤组织发生率均在 50 %以上。而当侵
染时间超过 25 min 后 ,抗性愈伤组织发生率明显下
降 ,此时 ,外植体易褐化死亡。本研究中农杆菌对草莓
的适宜侵染时间为 15 min。
图 4 　农杆菌侵染时间对抗性愈伤组织发生率的影响
Fig. 4 　Effects of infection time on resistant callus rate
21113 　外植体预培养时间对抗性愈伤组织发生率的
影响 　将外植体分别预培养 0、1、2、3、4 和 5 d 后用
OD600为 015 的农杆菌 LBA4404 侵染 15 min ,暗处共培
养 3 d 后进行选择培养。结果表明 ,适当时间的预培
养能提高外植体抗性愈伤组织发生率 (图 5) ,未进行
预培养的外植体的抗性愈伤组织发生率为 27 % ,预培
养 1 d 时为 30 % ,预培养 2 d 和 3 d 的外植体抗性愈伤
组织发生率明显提高 ,分别为 4415 %和 4616 %。但预
培养时间超过 3 d ,抗性愈伤组织发生率开始明显下
降 ,预培养 5 d 时 ,已降至 2018 %。因此 ,研究认为对
草莓“早红”的最适预培养时间为 2～3 d。
图 5 　预培养时间对抗性愈伤组织发生率的影响
Fig. 5 　Effects of pre2culture time on resistant callus rate
图 6 　共培养时间对抗性愈伤组织发生率的影响
Fig. 6 　Effects of co2culture time on resistant callus rate
21114 　共培养时间对抗性愈伤组织发生率的影响　
用OD600为 015 的菌液将预培养 3 d 的外植体侵染 15
min 后 ,暗处分别共培养 1、2、3、4 和 5 d ,之后进行选择
培养。由图 6 可以看出 ,共培养时间对草莓“早红”抗
性愈伤组织发生率的影响显著 ,随共培养时间的延长 ,
抗性愈伤组织发生率显著提高。共培养 1 d 的抗性愈
伤组织发生率仅为 1417 % ,而共培养 3 d 的外植体抗
性愈伤组织发生率高达 50 %以上 ,但当共培养时间超
过 4 d 后 ,由于农杆菌在外植体周围过度繁殖 ,大部分
外植体褐化、死亡 ,导致抗性愈伤组织发生率明显下
降。因此 ,对草莓“早红”进行转化时 ,共培养时间以 3
d 为宜。
212 　农杆菌介导的草莓转化和转基因植株获得
在上述优化的转化条件下 ,即外植体在培养基
MS22 上预培养 3 d 后用 OD600为 015 的农杆菌LBA4404
侵染 15 min ,转入 MS22 培养基中共培养 3 d ,然后转接
到筛选分化培养基 MS23 中进行选择培养 (图 72A) ,约
2 周左右外植体膨大 (图 72B) ,周围开始形成愈伤组
织 ,随着培养时间的延长 ,大部分外植体逐渐褐化、变
黑、直至死亡 ,少数外植体长出淡黄色乃至绿色抗性愈
伤组织 (图 72C和图 72D) ,进而分化出小芽 (图 72E 和
图 72F) 。将抗性小芽从原外植体上切下 ,转入新鲜的
筛选继代培养基 MS24 中 ,2 周后抗性芽长成完整的再
生植株 (图 72G) ,之后转入生根培养基 MS25 中培养生
根 (图 72H) ,抗性小苗经炼苗后移栽到花盆中 (图 72I) 。
213 　转基因草莓的分子检测
21311 　PCR 检测 　以 GEN2U、GEN2L 为引物对 Gen 抗
性植株及未转化对照植株基因组DNA 进行 PCR 扩增 ,
检测庆大霉素抗性基因 aacC1 的整合。结果显示 :阳
性对照质粒和大部分抗性植株均能扩增到 481 bp 的
目的片段 ( aacC1 基因的部分片段) ,而对照株 (Lane 2)
967　5 期 根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
图 7 　转基因草莓的再生
Fig17 　Regeneration of transgenic strawberry
A : 共培养后的外植体在选择分化培养基上 ; B : 膨大的外植体在选择分化培养基上 ; C , D : 抗性愈伤组织 ; E , F : 抗性小芽 ; G: 再生植株 ;
H : 再生植株生根 ; I : 再生植株的盆栽
A : Explants in selectable differentiation medium ; B : Larger size explants in selectable differentiation medium ; C and D : Resistant calluses induced from
explants ; E , F : Buds differentiated form calluses ; G: A transgenic plant ; H : Rooting of transgenic plants ; I : Transgenic plant grown in the flowerpot
图 8 　部分转基因植株 aacC1 基因的 PCR 检测
Fig18 　PCR detecting of some transgenic plants
for aacC1 gene
M: DL2000 ; 1 : 质粒 ; 2 : 未转化的植株 ; 3 : H2O ; 4～16 : 不同转基
因株系
M: DL2000 ; 1 : Positive control of plasmid ; 2 : Negative control of non2
transformed plant ; 3 : Negative control of H2O ; 4～16 : Different transgenic
plants
和 H2O(Lane 3) 未扩增出特异条带 (图 8) 。在 aacC1
基因扩增呈阳性的基础上 , 以引物对 AANAT2U、
AANAT2L 及引物对 HIOMT2U、HIOMT2L 对参与褪黑素
合成的 2 个关键酶基因 AANAT 和 HIOMT 分别进行了
检测 ,所测试的 10 个 aacC1 基因扩增呈阳性的株系均
检测到了 2 个关键酶基因的存在 ,分别为 349 bp 的
AANAT 基因片段 (图 92A) 和 572 bp 的 HIOMT 基因片
段 (图 92B) ,对照株则没有扩增产物出现。
图 9 　部分转基因植株 AANAT 和 HIOMT 基因的 PCR 检测
Fig19 　PCR detecting of some transgenic plants
for both AANAT and HIOMT genes
M: DL2000 ; 1 : 质粒 ; 2 : 未转化的植株 ; 3～12 : 不同的转基因株系
M: DL2000 ; 1 : Positive control of plasmid ; 2 : Negative control of non2
transformed plant ; 3～12 : Different transgenic plants. A : Detection of gene
AANAT ; B : Detection of gene HIOMT
077 核　农　学　报 23 卷
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
21312 　PCR2Southern blot 　以未转基因植株为阴性对
照 ,选取 3 个 PCR 检测呈阳性的转基因株系 , 以
aacC1、AANAT 及 HIOMT 3 个基因的 PCR 扩增产物作
探针进行 PCR2Southern blot 分析。从图 10 可以看出 ,
被测试的 3 个转基因株系均能杂交到大小正确的阳性
信号 ,证明所得转基因株系为真实的。
图 10 　部分转基因植株的 PCR2Southern blot 分析
Fig110 　PCR2Southern blot detecting of some
transgenic plants
M: DL2000 ; 1、6、11 : 质粒 ; 2、7、12 : 未转基因植株 ; 3～5、8～10、13
～15 : 3 个不同的转基因株系。1～5 : aacC1 基因的检测 ; 6～10 :
AANAT 基因的检测 ; 11～15 : HIOM 基因的检测
M: DL2000 ; 1 , 6 , 11 : Plasmid ; 2 , 7 , 12 : Non2transformed plant ; 3～5 ,
8～10 , 13～15 : Three transgenic plants. 1～5 : Detection for aacC1 gene ;
6～10 : Detection of AANAT gene ; 11～15 : Detection of HIOMT gene
21313 　RT2PCR 　用 Trizol 试剂提取转基因草莓的总
RNA作模板 ,以 Oligo dT 为引物进行反转录 ,用引物
GEN2U 和 GEN2L 对部分 PCR 检测证实为阳性的转基
因株系进行 RT2PCR 扩增。由图 11 可以看出 ,所有转
基因株系均扩增出预期大小的片段 (481 bp , aacC1 基
因的部分片段) ,而对照 (Lane 1 和 Lane 2 ,以转基因植
株的 RNA 或未转基因植株 RNA 的 cDNA 第一条链为
模板)则没有相应产物扩增出 ,说明 aacC1 基因在转基
因草莓中实现了转录水平上的稳定表达。
图 11 　转基因草莓的 RT2PCR 分析
Fig111 　RT2PCR analysis of transgenic strawberry lines
M: DL2000 ; 1 : 未转基因的草莓对照 ; 2 : 转基因植株 RNA 对照 ; 3～
11 : 转基因草莓株系
M: DL2000 ; 1 :non2Untransformed strawberry ; 2 : Control of RNA ; 3～11 :
Transgenic strawberry lines
3 　讨论
农杆菌介导法因具有转化效率高、操作简单、实验
设备便宜、遗传稳定性好等优点 ,成为双子叶植物遗传
转化的首选转化系统 ,大多数草莓转化就采用此系统。
因根癌农杆菌介导法转化的效率受诸多因素的影响 ,
本研究系统分析了农杆菌菌液浓度、侵染时间、预培养
时间和共培养时间对草莓抗性愈伤组织发生率的影
响。结果发现 ,菌液浓度太低、侵染时间和共培养时间
太短均不利于农杆菌附着在外植体上 ,影响转化效果 ;
而菌液浓度过高、侵染时间或共培养时间过长则会导
致农杆菌增殖过多 ,在后期培养中难以去除 ,从而造成
外植体腐烂、死亡。关于外植体在转化前是否要进行
预培养 ,研究结果不尽一致 ,一般认为 ,外植体预培养
使细胞处于一种易于接受外来信息的感受状态 ,从而
有利于转化 ,同时可以减轻农杆菌对外植体的伤害 ,提
高转化率[12 ,13 ] 。本研究发现 ,对“早红”草莓外植体进
行预培养是必要的 ,不经预培养直接用农杆菌侵染 ,外
植体会很快褐化、死亡 ;预培养时间过短 (1 d) ,外植体
还未形成感受态细胞 ,转化率较低 ;而预培养时间超过
4 d ,伤口快要愈合 ,农杆菌难以侵染 ,转化效率降低。
本试验建立的适宜草莓“早红”遗传转化的条件是 :预
培养时间 2～3 d、菌液浓度 OD600 013～015、侵染时间
15 min、共培养时间 3 d。
MT在植物体内可能具有和动物类似的合成途径。
在动物中 ,松果腺细胞摄入色氨酸后 ,经过色氨酸羟化
酶的作用生成 52羟色氨酸 ,52羟色氨酸在芳香 L2氨基
酸脱羧酶作用下脱羧形成 52羟色胺。52羟色胺再经N2
乙酰 转 移 酶 ( AANAT) 和 羟 吲 哚2O2甲 基 转 移 酶
(HIOMT)的催化生成 MT[14 ] 。Murch 等人用14 C 标记的
色氨酸饲喂金丝桃试管苗 ,发现被标记的色氨酸被代
谢成吲哚乙酸、色胺、52羟色氨酸和 52羟色胺[15 ] ,而 52
羟色氨酸和 52羟色胺是脊椎动物体内合成 MT的前体
物 ,由此暗示 MT 在植物体内可能具有和动物类似的
合成途径。此外 ,已有研究测定草莓果实中 MT 含量
为 1214 pgΠg[7 ] ,这更进一步说明草莓中存在 MT 合成
的底物 ,因此 ,本试验利用转基因技术将来自人的 MT
合成关键酶基因导入草莓基因组 ,以提高转基因草莓
中 MT含量的设想是切实可行的。
本研究通过农杆菌介导的转基因技术 ,将来自人
的 MT 合成关键酶基因导入草莓基因组 ,优化了草莓
褪黑素基因遗传转化体系 ,获得转基因植株 ,并进行了
初步的分子检测 ,证实外源基因已经整合进草莓基因
177　5 期 根癌农杆菌介导转褪黑素基因草莓的获得
© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
组并在转录水平实现稳定表达 ,但转基因草莓中 MT
含量水平如何 ,及由 MT 含量的变化而引起转基因草
莓的各种生理生化反应 ,还需要进一步的分析 ;同时 ,
全面、系统分析 MT 在植物中的生物功能及其作用机
理 ,包括可能的类生长素功能、抗氧化和清除自由基以
及它在植物抗环境胁迫中的功能等 ,也将是我们未来
的工作重点。
参考文献 :
[ 1 ] 　Lerner A B , Case J D , Takahashi Y. Isolation of melatonin , the pineal
gland factor that lightens melanocytes [J ] . J Am Chem Soc , 1958 , 80
(10) : 2587
[ 2 ] 　PÊggeler B , Thuermann S , Dose A , Schoenke M , Burkhardt S ,
Hardeland R. Melatonin’s unique radical scavenging properties2Roles of
its functional substituents as revealed by a comparison with its structural
analogs[J ] . J Pineal Res , 2002 , 33 (1) : 20 - 30
[ 3 ] 　Tan D X , Reiter R J , Manchester L C , Yan M T , El2Sawi M , Sainz R
M , Mayo J C , Kohen R , Allegra M , Hardeland R. Chemical and
physical properties and potential mechanisms : melatonin as a broad
spectrum antioxidant and free redical scavenger [ J ] . Curr Top Med
Chem , 2002 , 2 (2) : 181 - 197
[ 4 ] 　PÊggeler B , Balzer I , Hardeland R , Lerchl A. Pineal hormone
melatonin oscillatesalso in the dinoflagellate Gonyaulax polyedra [ J ] .
Naturwissenschaften , 1991 , 78 (6) : 268 - 269
[ 5 ] 　Manchester L C , PÊeggeler B , Alvares F L , Ogden G B , Reiter R J .
Melatonin immunoreactivity in the photosynthetic prokaryote ,
Rhodospirillum rubrum : implications for an ancient antioxidant system
[J ] . Cell Mol Biol Res , 1995 , 41 (5) : 391 - 395
[ 6 ] 　Hardeland R , Poeggeler B. Non2vertebrate melatonin[J ] . J Pineal Res ,
2003 , 34 (4) : 233 - 241
[ 7 ] 　Hattori A , Migitaka H , Ligo M , Itoh M , Yamamoto K, Ohtani2Kaneko
R , Hara M , Suzuki T , Reiter R J . Identification of melatonin in plants
and its effects on plasma melatonin levels and binding to melatonin
receptors in vertebrates[J ] . Biochem Mol Biol Int , 1995 , 35 (3) : 627
- 634
[ 8 ] 　Manchester L C , Tan D X , Reiter R J , Park W , Monis K, Qi W B ,
Tan D X. High levels of melatonin in the seeds of edible plants Possible
function in germ tissue protection. Life [J ] . Science , 2000 , 67 (25) :
3023 - 3029
[ 9 ] 　Chen G, Huo Y, Tan D X , Liang Z , Zhang W , Zhang Y. Melatonin in
Chinese medicinal herbs[J ] . Life Sci , 2003 , 73 (1) : 19 - 26
[10 ] 　Reiter R J , Manchester L C , Tan D X. Melatonin in walnut : Influence
on levels of melatonin and total antioxidant capacity of blood [ J ] .
Nutrition , 2005 , 21 (9) : 920 - 924
[11 ] 　秦永华 , 张上隆. 影响根癌农杆菌介导的丰香草莓遗传转化因
素分析[J ] . 核农学报 , 2007 , 21 (5) : 461 - 465
[12 ] 　Clark M S. 植物分子生物学实验手册[M] . 顾红雅 , 瞿礼佳 , 编
译. 北京 : 高等教育出版社 , 1998 , 627
[13 ] 　朱海生 , 潘东明 , 林义章 , 张志忠 , 温庆放. 根癌农杆菌介导草
莓遗传转化的研究[J ] . 核农学报 , 2008 , 33 (1) : 36 - 40
[14 ] 　Sugden D. Melatonin biosynthesis in the mammalian pineal gland [J ] .
Experimentia , 1989 , 45 (10) : 922 - 932
[15 ] 　Murch S J , Krishna Raj S , Saxena P K. Tryptophan is a precursor for
melatonin and serotonin biosynthesis in vitro regenerated St . John’s wort
( Hypericum perforatum cv. Anthos) plants [J ] . Plant Cell Rep , 2000 ,
19 (7) : 698 - 704
更正
我刊 2009 ,23 (4)第 660 页 ,袁玉伟等人撰写的文章“氮稳定同位素的印迹规律与有机食品鉴别”中 ,“112 　计
算方法”第 6 行“常采用δ值来表示同位素的丰度 ,定义为样品 (sq) 的同位素比值 Rsq与某标准物质 (st) 的同位素
比值 (Rst )比较 ,用公式表示 :δ( ‰) Rsq - RstRst ×100。”应改为“常采用δ值来表示同位素的丰度 ,定义为样品 (sq)
的同位素比值 Rsq 与某标准物质 (st)的同位素比值 (Rst)比较 ,用公式 (1) 表示 :δ( ‰) = Rsq - RstRst ×1000。”特此
更正。
277 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (5) :766～772