全 文 ：热带亚热带植物学报　2015， 23(3)： 343 ~ 352
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2014–08–18　　　　接受日期： 2014–11–03
基金项目： 国家自然科学基金项目(41271282，31070548，31170578)资助
作者简介： 韩世忠(1987~ )，男，硕士研究生，主要研究方向为森林生态系统碳氮循环。E-mail: 512073738@qq.com
* 通信作者 Corresponding author. E-mail: r.gao@hotmail.com
中亚热带森林土壤真菌多样性的案例研究
韩世忠1a, 高人1a,1b,2*, 马红亮1a,1b, 尹云锋1a,1b, 司友涛1a,1b, 杨玉盛1a,1b,
陈仕东1a,1b, 陆建芳1a, 刘功辉1a, 李爱萍1a, 郑群瑞3
(1. 福建师范大学， a. 地理科学学院； b. 湿润亚热带山地生态国家重点实验室培育基地， 福州 350007； 2. 福建武夷山森林生态系统国家定位研
究站， 福建 武夷山 354315； 3. 建瓯万木林自然保护区管理站， 福建 建瓯 353105)
摘要： 为了解中亚热带森林土壤的真菌多样性，利用 PCR-DGGE 分子指纹图谱技术对武夷山国家级自然保护区和建瓯万木
林自然保护区内的米槠(Castanopsis carlesii)天然林土壤真菌进行研究。结果表明，中亚热带地区森林土壤真菌群落丰富，土
壤真菌的多样性指数、丰富度指数和均匀度指数分别为 3.37~3.80、 26~29 和 0.977~0.984。经测序及同源性比对，真菌以担子
菌类(Basidiomycota)最多，占总数的 35.9%；其次为子囊菌类(Ascomycota)，占总数的 15.4%；接合菌类(Zygomycota)和半知菌类
(Deuteromycota)分别占总数的 10.3% 和 7.7%。主成分分析表明，地点和土层深度共同影响真菌群落组成，其中由地点引起的
真菌群落组成差异大于土层深度。土壤真菌多样性指数与土壤铵态氮呈显著正相关，与土壤碳氮比呈显著负相关；丰富度指数
和均匀度指数与土壤因子间没有显著的相关性，因此，土壤碳、氮含量是影响土壤真菌群落结构的重要因子。
关键词： 土壤真菌； 米槠天然林； PCR-DGGE； 真菌多样性
doi: 10.11926/j.issn.1005–3395.2015.03.017
Soil Fungal Diversities of Castanopsis carlesii Nature Forests in Mid-
subtropical China
HAN Shi-zhong1a, GAO Ren1a,1b,2*, MA Hong-liang1a,1b, YIN Yun-feng1a,1b, SI You-tao1a,1b, YANG Yu-sheng1a,1b,
CHEN Shi-dong1a,1b, LU Jian-fang1a, LIU Gong-hui1a, LI Ai-ping1a, ZHENG Qun-rui3
(1a. College of Geographical Sciences; 1b. Key Laboratory for Subtropical Mountain Ecology, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 2.
The state Forest Ecosystem Research Station of Wuyi Mountain (Fujian), Wuyishan 354315, China; 3. Administrative Station of Jian’ou Wanmulin
Nature Reserve, Jian’ou 353105, China)
Abstract: In order to understand the soil fungal diversity in mid-subtropical forest, the soil fungal community
structure of Castanopsis carlesii nature forests in Wuyi Mountain and Jian’ou Wanmulin Nature Reserves at
northern Fujian, eastern China was studied by PCR-DGGE molecular fingerprint techniques. The results showed
that the diversity index, richness index and evenness index of soil fungal in the two subtropical forests were
3.37–3.80, 26–29 and 0.977–0.984, respectively, indicating that the natural forest soil fungal communities were
abundant. Thirty-nine fungi species were obtained by sequencing and homologous alignment, among which
Basidiomycota were the most, accounting for 35.9%; followed by Ascomycota for 15.4%, then Zygomycota for
10.3% and Deuteromycota for 7.7%. Principal component analysis showed both soil depth and sample location
were the major factors influencing fungal community composition, and the effect of location was bigger than
soil depth. Correlation analysis showed that soil fungal diversity index had significant positive correlation with
344 第23卷热带亚热带植物学报
土壤真菌作为微生物区系中的主要成分，它
不仅能分解纤维素、半纤维素、木质素、单宁等化
合物，还能更有效地分解众多难分解的凋落物[1–2]，
在推动土壤物质转换、能量流动和生物转化循环
中起着重要的作用 , 是生态系统健康的指示物[3]。
Hawksworth[4]指 出，自 然 界 中 真 菌 大 约 有 150 万
种，但能够被分离和培养的只占总数的 0.17%，这
就说明利用传统方法得到的真菌种类和数量，并
不能准确地反映研究地区真菌的原始状况。近年
来，随着一系列分子指纹分析方法的发展，尤其是
PCR-DGGE 技术的运用，为研究微生物群落结构
提供了一个有力的分子指纹标记技术，克服传统培
养方法信息大量丢失的缺点，因而可以更好地揭示
河流[5]、草地[6]、森林[7]以及农田[8]土壤真菌群落结
构的变化。有研究表明，与碱性和中性土壤相比，
真菌更喜好偏酸性土壤[9]，因此，与其它地区相比，
中国南方地区土壤的真菌群落更加丰富[10]。福建
省地处湿润亚热带地区，气候温和、雨量充沛，土壤
高度风化，并且呈现出很强的酸性，其丰富的植物
资源，是研究森林生态系统土壤真菌多样性的理想
场所。近年来，全球温室气体大量排放以及酸雨
和氮硫沉降增加等，土壤环境发生了很大变化，对
该地区森林生态系统造成极大影响，引起土壤真
菌群落结构发生变化[11]。Treseder 等[12]报道，大气
中 CO2 浓度升高对土壤不同菌根的影响不同，推
测 CO2 浓度越高，Acaulospora 属和 Scutellospora
属在菌根区系中所占比例越大。目前对中亚热带
地区的土壤真菌已有研究报道，庄铁诚等[13]对武夷
山不同类型森林土壤丝状真菌进行了研究，认为青
霉 属(Penicillium)、木 霉 属(Trichoderma)和 曲 霉 属
(Aspergillus)是各森林类型土壤中分布广、密度大的
主要优势菌属。宋漳[14]等对闽北常绿阔叶林土壤
微生物学特性的研究表明，受人为干扰破坏的退化
森林(Degraded forest, DF)土壤真菌数量比长期受
保护的中亚热带森林(Conserved forest, CF)多，并且
占土壤微生物总量的比值也较大。吴则焰等[15]运
用 BIOLOG 微平板技术对武夷山国家自然保护区
不同植被类型土壤微生物群落结构和代谢功能多
样性进行了研究，表明不同海拔植被带土壤微生物
群落的功能多样性差异显著。但已有的研究大多
以传统培养筛选的方式对土壤真菌进行分类和鉴
定，而利用分子生物学技术对土壤真菌多样性的研
究报道较少。本文以中亚热带地区典型的阔叶天
然林为研究对象，利用 PCR-DGGE 分子指纹图谱
技术及 PCR 方法，对武夷山国家自然保护区和建
瓯万木林自然保护区内米槠天然林的土壤真菌进
行研究，探讨该地区土壤真菌群落的结构组成及其
影响因子，为研究土壤真菌对森林生态系统物质循
环以及生态环境影响等提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验样地概况和样地设置
试验地分别位于福建省武夷山国家级自然保
护区(27°33′ N，117°27′ E)和建瓯万木林自然保护
区(27°03′ N，118°09′ E)。 武 夷 山 国 家 级 自 然 保
护区为典型中亚热带季风气候，平均海拔 1000~
1100 m，年均气温 19.4℃，年均降水量 1731.4 mm，
ammonium nitrogen content and negative with carbon nitrogen ratio, nevertheless, the community richness index
and evenness index showed no significant relation with the soil factors. So, the carbon and nitrogen contents in
soil were important factors affecting the soil fungal community structure.
Key words: Soil fungi; Castanopsis carlesii nature forest; PCR-DGGE; Fungal diversity
表 1 样地的基本特征
Table 1 Basic characteristics of sampling plots
地点
Position
森林类型
Forest type
密度 Density
(ind. hm–2)
年龄
Age (a)
平均胸径 (cm)
Average DBH
平均树高 Average
tree height (m)
海拔 (m)
Elevation
坡向
Aspect
坡度
Slope
武夷山
Wuyi Mont.
建瓯
Jian’ou
米槠天然林
Castanopsis carlesii
米槠天然林
Castanopsis carlesii
5600
2800
50
200
10.0
15.1
7.4
9.5
610
510
西北
Northwest
西
West
20°
20°
第3期 345
年均蒸发量 1466 mm，相对湿度 81%，全年无霜期
达 277 d，土壤为花岗岩发育的普通山地红壤。建
瓯万木林自然保护区地处武夷山和鹫峰山之间，属
亚热带海洋性季风气候，年均气温 19.3℃，年均降
水量 1600~1800 mm，日照时数 1612 h，无霜期 286 d，
相对湿度 80%，土壤为花岗岩发育的普通山地红
壤。在武夷山国家自然保护区按照上坡、中坡和下
坡分别设置 3 个 10 m×10 m 样地；在建瓯万木林
自然保护区沿等高线设置 9 个 10 m×10 m 样地。
每个样地用尼龙细线隔成25个2 m×2 m的小样方。
试验样地基本概况见表 1，样地中植株密度、平均胸
径和平均高度根据胸径大于 2 cm 的树木计算；年
龄为优势木的平均年龄。
1.2 土壤样品采集与处理
2013 年 4 月在每块样地按照均匀采样法，用土
钻采集 25 钻 0~10 cm 和 10~20 cm 土层土壤，混匀
后用聚乙烯塑料袋封装迅速带回实验室，人工挑除
凋落物、细根和小石块等杂物，过 2 mm 尼龙筛后
一部分土壤样品放在阴凉通风处晾干，用于土壤有
机碳和总氮分析；一部分土壤样品保存在 4℃下用
于土壤微生物生物量碳 / 氮、pH 值、溶解性有机质、
硝态氮、铵态氮等的测定；用于土壤真菌多样性分
析的样品为混合样品，武夷山 9 块样地按照坡位和
土层分别混合形成 6 个样品，建瓯 9 块样地按顺序
相邻 3 块为一组，分别土层混合形成 6 个样品，并
标号(表 2 和图 4)，放入 –20℃低温冰箱保存。土壤
表 2 样地土壤基本理化性质
Table 2 Physical and chemical properties of soil
编号
Code
土层 Soil
depth (cm) pH
总氮 Total
nitrogen (g kg–1)
有机碳 Organic
carbon (g kg–1) C/N
总磷 Total
phosphorus (mg kg–1)
有效磷 Available
phosphorus (mg kg–1)
砂粒
Sand (%)
粉粒
Powder (%)
黏粒
Clay (%)
WU
WL
JU
JL
0~10
10~20
0~10
10~20
4.85
4.79
4.55
4.54
1.96
1.14
2.14
1.28
33.92
17.62
36.55
21.32
17.30
15.47
16.96
16.37
27.67
23.29
56.23
48.87
6.62
5.71
7.36
6.13
46.3
54.1
22.5
21.8
42.2
33.4
65.1
64.0
11.4
12.5
12.4
14.2
含水量采用铝盒烘干法测定；pH 用玻璃电极 pH 计
测定，水土比 2.5：1 (V/V)；土壤有机碳和总氮采用
CN 元素分析仪(Elementar Vario EL III，Elementar，
德国)测定；硝态氮、铵态氮采用连续流动分析仪
(Skalar san++，荷兰)测定。各样地土壤基本理化性
质见表 2。
1.3 土壤总DNA提取
土壤总 DNA 参照 PowerSoil DNA Isolation Kit
试 剂 盒(MO BIO，美 国)提 取。 提 取 的 DNA 采 用
0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测质量。
1.4 真菌18S rRNA片段的PCR扩增
采用真菌 18S rRNA 部分片段的通用引物 NS1
(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和 GC-Fungi
(5′-GC-clamp-ATTCCCCGTTACCCGTTG-3′)，其中，
GC-Fungi 的 5′ 端 有 一 段 约 40 bp 的 GC 夹 子(5′-
CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGC-
CCCCGCCCC-3′)，以提高 DGGE 的分离效果。PCR
反应体系为 25 μL，包含 1 μL 模板 DNA、2.5 μL 10×
Ex Taq 缓 冲 液(含 20 mmol L–1 Mg2+，TaKaRa)、
2 μL 2.5 mmol L–1 dNTP mixture、1 μL 正反向引物
(10 μmol L–1)、0.25 μL 5 U mL–1 Ex Taq DNA 聚合
酶和 17.25 μL 灭菌双蒸水。PCR 反应程序为：94℃
预变性 5 min；然后 94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 15 s，
共 30 个循环；最后 72℃延伸 10 min[16]。PCR 产物
用 1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测，用 OMEGA 公司的
DNA Gel Extraction Kit 纯化回收。PCR 仪为 Biometra
公司生产的 T-gradient，凝胶成像仪为 Bio-Rad 公司
的 Gel-Doc2000 凝胶成像系统。
1.5 PCR产物的变性梯度凝胶电泳(DGGE)
取 10 μL PCR 产物，用 D-Code 基因突变检测
系 统(Bio-Rad Laboratories Inc，USA)进 行 DGGE
分析，变性梯度为 20%~40%、聚丙烯酰胺凝胶浓度
为 6%，在 1×TAE 缓冲液中 150V 60℃下电泳 8 h。
韩世忠等：中亚热带森林土壤真菌多样性的案例研究
346 第23卷热带亚热带植物学报
1.6 土壤真菌18S rDNA片段的克隆与测序
用灭菌的手术刀切下待回收的 DGGE 条带，采
用 OMEGA 公司的 Poly-Gel DNA Extraction Kit 回
收目的条带。以 2 μL 回收产物为模板，NS1/GC-
Fungi 为引物进行 PCR 扩增，PCR 反应体系以及
扩增程序同上。将重新扩增的 DNA 片段切胶回收、
纯化后，连接到 Pmd18-T 载体上，并转化至大肠杆
菌(Echerichia coli) DH5α 感受态细胞中，筛选阳性
克隆，送北京博友新创生物技术有限公司测序分
析。
1.7 数据处理与统计分析
数据采用 Excel 2007 和 SPSS 17.0 进行统计
分析和作图，不同类型土壤各变量之间的显著性
检验采用单因子方差分析(ANOVA)和最小显著
差异法(LSD)，一元线性回归分析土壤真菌多样
性指数与各因子的相关关系，显著性水平设定为
α=0.05。利用 Quantity One 软件 version 4.6 (Bio-Rad
Laboratories Inc，USA)进 行 DGGE 图 谱 数 字 化
处理和分析，主成分分析采用 Conoco for windows
4.5 软 件 进 行，利 用 NCBI 的 BLAST-N 进 行 序 列
同源性比较。土壤真菌的多样性水平用 Shannon-
Wiener 多样性指数(H´)、Margalef 丰富度指数(S)
和 Pielou 均匀度指数(J)表示。
Shannon-Wiener 多样性指数： H´=–∑pilnpi
Pielou 均匀度指数： J=H´/lnS
其中，pi 为某样品中第 i 个条带的强度占该样品所
有条带总强度的比率，可以用 pi=Ni/N 计算，N 为
DGGE 图谱单一泳道中所有条带的丰度，Ni 为第 i
条带的丰度，S 为某样品中所有条带数目总和。
2 结果和分析
2.1 土壤总DNA提取及PCR扩增
将提取到的土壤总 DNA 用 0.8% 琼脂糖凝胶
进行电泳，获得条带清晰，大小约为 23 kb 的 DNA
片段(图 1)。以提取的 DNA 为模板，采用真菌 18S
rRNA 部分片段通用引物 NS1/GC-Fungi 进行 PCR
扩增，结果在 250~500 bp 处出现一条预期长度约
370 bp 的 DNA 条带(图 2)，该条带清晰，没有出现
引物二聚体和其他非特异性条带，可判断为目的条
带，适宜后续的 DGGE 分析。
2.2 土壤真菌群落结构的DGGE指纹图谱分析
利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对土壤
真菌 18S rRNA 部分片段 PCR 产物进行分离，根
据 DGGE 能分离长度相同而序列不同 DNA 的原
理，每一条带大致与一优势种群或分类操作单元
(OTUs)相对应[17]。DGGE 图谱中不同位置的条带
代表不同的真菌类群，不同泳道同一位置条带的灰
图 1 土壤总 DNA 的琼脂糖凝胶电泳图谱。M: 2000 bp DNA Marker；
WU、WL、JU 和 JL 见表 2。
Fig. 1 Agarosegel electrophoresis of total DNA of soil samples. M:
2000 bp DNA Marker; WU, WL, JU and JL see Table 2.
图 2 真菌 18S rRNA 部分片段的 PCR 扩增
Fig. 2 PCR amplification of fragment in fungi 18S rRNA
第3期 347
度值则反映该真菌类群在不同土样中的相对丰度，
通过对比分析 DGGE 图谱中不同泳道中条带的数
量和灰度值，即可判断不同土壤样品中真菌群落结
构以及种群丰富度状况。采用 Quantity One 分析
软件对 DGGE 胶图进行条带识别和图谱分析(图 3:
A)，可以看出，各样地的真菌群落组成丰富，每个土
壤样品均可以分离出 25~32 条带，其中 WL 土壤样
品分离的数量最多，JU 和 JL 次之，WU 最少，说
明在武夷山样地，真菌丰富度深层土壤高于表层，
而建瓯样地则是表层土壤高于深层。根据泳道比
较图(图 3: B)可知，在不同类型的土壤中，分离出的
条带数量和灰度值均有差异，灰度值高，说明该真
菌数量较多，为该地区的优势种群。在所有真菌群
落中有 5 个真菌种群在每个土壤样品中都有分布
(箭头所示)，说明这些种群属于生态幅比较广的基
本微生物类型，广泛存在于各类土壤样品中，但同
一条带的灰度值在不同土壤样品中差异较大，说明
这些种群在数量分布上有一定的差别。
2.3 土壤真菌群落主成分分析
为了进一步了解不同样地土壤真菌群落组成
的差异，根据 DGGE 图谱中各条带的峰密度和 Rf
值(Relative front)，对不同样地土壤真菌类群进行主
成分分析(图 4)。结果表明，第一和第二主成分分
别解释了真菌群落组成变化的 24.9% 和 14.6%，第
三主成分解释了 13.4%，第四主成分解释了 10.6%，
前 4 个主成分累计解释了真菌群落组成变化的
63.6%。从图 4 可知，武夷山自然保护区土壤样品
主要在第一和第四象限，建瓯万木林自然保护区土
壤样品都集中在第三象限。在纵向坐标轴上，武夷
山自然保护区 0~10 cm 土壤样品大部分位于坐标
轴中轴线的上方，而大部分 10~20 cm 土壤样品和
所有的建瓯万木林自然保护区土壤样品都位于坐
标轴中轴线的下方，表明在第一主成分中，真菌群
落组成的差异由不同地点和土层深度共同影响。
在横向坐标轴上，武夷山自然保护区土壤样品都位
于坐标轴中轴线的右侧，而建瓯万木林自然保护区
图 3 18S rRNA 部分片段 DGGE 分离图谱(A)和泳道比较图(B)。百分数表示各泳道与第 1 条泳道的相似性。
Fig. 3 DGGE profile of 18S rRNA fragment (A) and electrophoretic comparison chart (B). Percentage showed similarity of each lane compared to the
first lane.
韩世忠等：中亚热带森林土壤真菌多样性的案例研究
348 第23卷热带亚热带植物学报
土壤样品都位于坐标轴中轴线的左侧，表明在第二
主成分上，真菌群落组成的差异主要由地点的不同
引起。
图 4 土壤真菌 DGGE 图谱主成分分析
Fig. 4 Principal component analysis of soil fungi DGGE patterns
2.4 土壤真菌的多样性
由表 3 可知，不同样地土壤真菌的多样性指
数、丰富度指数和均匀度指数均有差异，平均值分
别为 3.3736~3.7991、26~29 和 0.977~0.984。武夷
山国家自然保护区样地，0~10 cm 土层的真菌多样
性指数、丰富度指数和均匀度指数都低于 10~20 cm
土层；而建瓯万木林自然保护区样地，0~10 cm 土
层的真菌多样性指数低于 10~20 cm，丰富度指数
和均匀度指数则高于 10~20 cm 土层。
同样是 0~10 cm 土层，武夷山国家自然保护
区样地多样性指数和丰富度指数低于建瓯万木林
自然保护区样地，均匀度指数则高于建瓯万木林自
然保护区样地；而在 10~20 cm 土层上，武夷山国家
自然保护区样地多样性指数低于建瓯万木林自然
保护区样地，丰富度指数和均匀度指数高于建瓯万
木林自然保护区样地。对土壤真菌群落指数与土
壤理化性质进行相关分析，结果表明(表 4)，土壤真
菌的多样性指数与铵态氮呈显著正相关(r =0.609，
P<0.05)，与 碳 氮 比 呈 显 著 负 相 关(r=–0.674，P<
0.05)，与其他土壤理化性质的相关性不显著；丰富
度指数和均匀度指数与各土壤理化性质均没有显
著的相关性。
2.5 土壤真菌DGGE条带基因片段的测序
对 DGGE 图谱中 39 条已经标记的差异条带
进行测序分析(表 5)，结果表明，真菌群落中以担子
菌类(Basidiomycota)的数量最多，共 14 个，占总数
的 35.9%；其次为子囊菌类(Ascomycota)，共 6 个，
占总数的 15.4%；接合菌类(Zygomycota)有 4 个，占
表 3 土壤真菌的多样性、丰富度及均匀度指数
Table 3 Diversity index, richness index and evenness index of soil fungi
样地 Sample 土层深度 Soil depth (cm) 多样性指数 Diversity index (H′) 丰富度指数 Richness index (S) 均匀度指数 Evenness index (J)
WU
WL
JU
JL
0~10
10~20
0~10
10~20
3.37
3.78
3.74
3.80
26
29
28
27
0.983
0.984
0.982
0.977
表 4 土壤真菌群落指数与理化参数的相关性分析
Table 4 Pearson correlation analysis for soil fungal community indices against physicochemical parameters
pH 含水量 Water content 总氮 Total nitrogen 有机碳 Organic carbon C/N 硝态氮 Nitrate nitrogen 铵态氮 Ammonium nitrogen
H′
S
J
–0.365
–0.056
0.419
–0.177
–0.213
0.300
–0.350
–0.339
0.202
–0.432
–0.351
0.182
–0.674*　
–0.310　
0.010　
–
–
–
0.609* 　　　　
–0.037 　　　　
–0.453 　　　　
*: P<0.05; n=12
第3期 349
表 5 DGGE 条带的序列比对分析
Table 5 Sequence alignment of DGGE
条带
Band
碱基对
Base pairs
最相近种属(GenBank 登录号)
Closest species or genera (GenBank accession No.)
分类
Taxonomy
界
Kingdom
相似性
Identity (%)
1 351 Arthromyces matolae (EU708331) Basidiomycota Fungi 99
2 351 Multiclavula mucida (AF026613 Basidiomycota Fungi 99
3 345 Lasiosphaeris hispida (JN938597) Ascomycota Fungi 94
4 351 Tricholoma viridiolivaceum (JF706318) Basidiomycota Fungi 99
5 352 Gliophorus laetus (DQ440640) Basidiomycota Fungi 97
6 350 Mortierella indohii (EU736291) Zygomycota Fungi 98
7 350 Uncultured fungus clone (JN559245) Environmental samples Eukaryota 98
8 352 Umbelopsis isabellina (AF545632) Zygomycota Fungi 99
9 346 Trichoderma harzianum (JF499072) Deuteromycetes Fungi 99
10 350 Mortierella verticillata (AB016017) Zygomycota Fungi 98
11 347 Cryptococcus humicolus (AB035583) Basidiomycota Fungi 92
12 350 Uncultured Sarcosomataceae (EF023647) Ascomycota Fungi 98
13 345 Alatospora acuminata (AY204583) Deuteromycota Fungi 99
14 351 Mycena amabilissima (DQ457647) Basidiomycota Fungi 99
15 351 Lactarius lignyotus (DQ457626) Basidiomycota Fungi 99
16 347 Aspergillus terreus (GU573850) Deuteromycota Fungi 97
17 347 Pseudofusicoccum stromaticum (EU673146) Ascomycota Fungi 99
18 351 Uncultured Auriculariaceae (EF023716) Basidiomycota Fungi 99
19 342 Uncultured eukaryote (HQ999394) Eukaryote Fungi 96
20 345 Coniochaeta ligniaria (AY198389) Ascomycota Fungi 98
21 350 Pleurocybella porrigens (GU187660) Basidiomycota Fungi 97
22 353 Geastrum saccatum (AF026620) Basidiomycota Fungi 97
23 348 Penicilliopsis clavariiformis (AB003946) Ascomycota Fungi 98
24 346 Aspergillus terreus (GU573850) Ascomycota Fungi 99
25 358 Uncultured fungus (JX126759) Environmental samples Eukaryota 99
26 354 Mycena aurantiidisca (DQ457694) Basidiomycota Fungi 96
27 358 Uncultured Banisveld eukaryote (EU091841) Environmental samples Eukaryota 95
28 351 Pluteus petasatus (HM562273) Basidiomycota Fungi 99
29 357 Megaselia scalaris (KC177299) Arthropoda Metazoa 99
30 367 Arthropoda environmental sample (AY496484) Arthropoda Metazoa 92
31 365 Gehypochthonius urticinus (EU433994) Arthropoda Metazoa 99
32 363 Craterellus fallax (AY771604) Basidiomycota Fungi 97
33 351 Sinella curviseta (DQ016565) Arthropoda Metazoa 99
35 379 Camponotus laevigatus (AY218314S1) Arthropoda Metazoa 99
36 370 Phyllopertha horticola (EF487722) Arthropoda Metazoa 99
37 361 Theristus agilis (AY284693) Nematoda Metazoa 99
38 350 Achaeta unibulba (GU901858) Annelida Fungi 98
39 352 Mortierella minutissima (EU736292) Zygomycota Metazoa 99
韩世忠等：中亚热带森林土壤真菌多样性的案例研究
350 第23卷热带亚热带植物学报
总数的 10.3%；半知菌类(Deuteromycota)有 3 个，占
总数的 7.7%；还有未知属名的菌株 4 个，占总数的
10.3%。此外，有 8 个条带与后生动物(Metazoa)的
同源性较高，目前关于后生动物对森林土壤影响的
报道较少。
3 结论和讨论
土壤真菌作为森林土壤微生物的重要组成
部分，其适宜的群落结构组成对于森林生态系统
物质循环和能量转换具有重要的促进作用。本
研究利用 PCR-DGGE 分子指纹图谱技术分析了
中亚热带地区两个自然保护区内米槠常绿阔叶
天然林土壤的真菌群落结构多样性，结果表明，
该地区土壤真菌群落结构十分丰富，各样地土壤
真菌多样性指数、丰富度指数和均匀度指数平均
数 量 分 别 为 3.37~3.80、26~29 和 0.977~0.984。
测 序 及 同 源 性 比 对 结 果 表 明，真 菌 群 落 中 以 担
子 菌 类(Basidiomycota)数 量 最 多，其 次 为 子 囊 菌
类(Ascomycota)、接 合 菌(Zygomycota)和 半 知 菌
(Deuteromycota)，分 别 占 总 数 的 35.9%、15.4%、
10.3% 和 7.7%。赵志祥等[18]对海南热带雨林土壤
的真菌群落进行研究，认为该地区森林土壤中子囊
菌最为丰富(占克隆文库的 64.7%)，担子菌次之(占
15.5%)。王继伟等[2]对甘肃小陇山日本落叶松(Larix
kaempferi)人工林的研究表明，该地区子囊菌纲的
青霉属和丝孢纲的曲霉属最为丰富。董爱荣等[19]
对小兴安岭红松(Pinus koraiensis)林土壤真菌多样
性的研究表明，接合菌纲的被孢霉属(Mortierella)、
子囊菌纲的青霉属以及丝孢纲的木霉属和轮枝孢
属(Verticilium)是该地区土壤真菌的优势种群。贾
丽等[1]对天水小陇山白皮松(Pinus bungeana)林的
土壤真菌多样性进行研究，认为不同样地真菌的多
样性指数差异较大，以青霉属和曲霉属为优势菌
群，均与本研究结果不同，可能是本研究所在的中
亚热带地区气候温和且高湿，森林生长旺盛，枯枝
落叶等凋落物较多，有机质含量高，导致腐生担子
菌大量繁殖，从而使担子菌种类较多[20]；此外，真菌
引物的选择往往起着关键作用，由于引物扩增具有
一定的偏爱性，对某一类或几类真菌特异性较高，
不同的引物扩增出来的真菌种类会有所差异。本
研究选用的引物是真菌 18S rRNA 部分片段通用引
物 NS1/GC-Fungi，该引物对担子菌的特异性相对较
高，这也可能是本研究得到担子菌种类最多的原因
之一。如果能够结合该地区真菌种类的特点，设计
具有针对性的引物，同时与 T-RFLP、FISH 等分子
生物学方法结合，将有助于更全面了解该地区真菌
群落的组成。
氮源参与蛋白质、核酸等大分子物质的合成，
是微生物生长和代谢所必需的大量元素，氮素的供
给直接影响着微生物活性的高低。有研究表明[21]，
土壤中氮素含量的变化会引起土壤微生物生物量、
活性和群落组成的变化。喻国策等[22]对一种能够
降解木质素的真菌进行研究，结果表明在一定范围
内，氮源的增加能够促进木质素过氧化氢酶的产
生，说明氮素能够增加真菌的代谢活性，促进对木
质素等大分子物质的分解。刘丽等[23]的研究表明，
不同发育阶段杉木(Cunninghamia lanceolata)人工
林的土壤真菌群落多样性和丰富度均与土壤中氮
素含量显著相关，土壤中的氮素含量是生物生长的
限制因子。本研究相关分析表明，土壤真菌群落多
样性与土壤中的氨态氮呈显著正相关，这是否与土
壤中参与物质分解与转换的真菌功能群有关，还有
待进一步研究。土壤 C/N 是影响土壤微生物群落
结构变化的重要因子之一[24]，适宜的 C/N 不仅能
促进真菌的生长，而且还能影响生防真菌孢子的萌
发[25]。有研究表明[26–27]，与细菌相比，真菌对有机
底物的利用率更高，在相同底物数量时，真菌比细
菌能够形成更多的生物量，因此，在偏酸性、养分
有效性低、难分解底物和 C/N 较高的土壤中，真菌
生长更加旺盛。本研究样地的土壤 C/N 为 15.47~
17.30，这远高于杉木人工林(11.13~12.39)[24]。相关
分析表明，土壤真菌群落多样性与 C/N 呈显著负相
关，说明土壤中高的 C/N 虽然有利于真菌生物量的
增加，但降低了真菌群落的多样性。
本研究还分离出了 5 种真菌优势种群，分别为
Trichoderma harzianum、 Cryptococcus humicolus、
Coniochaeta ligniaria、Mycena aurantiidisca 和 Pluteus
petasatus。这些优势种群几乎在所有土壤样品中都
有分布，属于生态幅比较广的基本微生物类型。其
中的 26 号条带与担子菌门口蘑科(Tricholomataceae)
小菇属(Mycena)的同源性较高。有研究表明[28]，土
壤凋落物中的木质素为天然大分子物质，不易降
解，严重影响着土壤碳循环，漆酶广泛存在于自然
界的多种植物和真菌中，该酶能将土壤凋落物中的
木质素彻底分解为水和 CO2，而能够分泌漆酶的真
第3期 351
菌主要是担子菌门。陈香碧等[29]对亚热带森林土
壤担子菌漆酶基因的多样性进行研究，认为 4 个克
隆库中含漆酶基因的担子菌在目水平上均以伞菌
目(Agaricales)占绝对优势，克隆子绝大部分与小菇
属的相似性在 70% 以上。9 号条带与木霉属哈茨
木霉(Trizhoderma harzianum)的同源性最高，该条
带亮度较高，属于该地区的真菌优势种群。木霉菌
属于半知菌亚门丝孢纲(Hyphomycetes)丛梗孢科
(Moniliaceae)，是一类普遍存在的真菌，常见于土壤
中，是土壤微生物的重要类群，具有很强的拮抗活
性和分解纤维素的能力[30–31]，而哈茨木霉是一种重
要的生物防治菌，它可以通过重寄生、抗生作用、营
养和空间竞争以及提高植物抗性等机制来防治多
种土传、气传植物病害[32]，对保持森林生态系统稳
定性具有重要作用。有研究表明[33]，哈茨木霉能诱
导产生一系列几丁质酶和 β-1,3 葡聚糖酶，这两种
酶对病原真菌细胞壁降解有重要作用，从而抑制病
原菌孢子萌发，最终导致菌丝和孢子的崩溃。目前，
对中亚热带地区森林土壤真菌多样性的研究还比
较薄弱，对该地区真菌种群的认识还十分有限，本
研究利用 PCR-DGGE 分子指纹图谱技术获得了几
种能够有效分解木质素、纤维素等大分子物质以及
具有生物防治功能的真菌，如果能够对这些功能真
菌进一步研究，了解其生物学特性，应用于森林生
态系统物质循环与调控，土壤病虫害研究等方面，
将具有十分重要的意义。
参考文献
[1]　 Jia L, Feng K K, Wang Q H, et al. Preliminary study on the diversity
of soil fungi in Pinus bungeana on Xiaolongshan, Tianshui [J]. J
Fujian For Sci Techn, 2006, 33(4): 53–57.
贾丽, 冯克宽, 王勤花, 等. 天水小陇山白皮松林土壤真菌多样
性的初步研究 [J]. 福建林业科技, 2006, 33(4): 53–57.
[2]　 Wang J W, Ju T Z, Cao C, et al. The diversity discusse on soil
dominant fungi in the pure Larix kaempferi plantations of Xiaolong-
shan of Tianshui City in Gansu [J]. J Arid Land Res Environ,
2013, 27(3): 173–176.
王继伟, 巨天珍, 曹春, 等. 甘肃小陇山日本落叶松人工林土
壤优势真菌多样性探讨 [J]. 干旱区资源与环境, 2013, 27(3):
173–176.
[3]　 Vandenkoornhuyse P, Baldauf S L, Leyval C, et al. Extensive fungal
diversity in plant roots [J]. Science, 2002, 295(5562): 2051–2051.
[4]　 Hawksworth D L. The fungal dimension of biodiversity: Magnitude,
significance, and conservation [J]. Mycol Res, 1991, 95(6): 641–
655.
[5]　 Nikolcheva L G, Cockshutt A M, Bärlocher F. Determining diversity
of freshwater fungi on decaying leaves: Comparison of traditional
and molecular approaches [J]. Appl Environ Microb, 2003, 69(5):
2548–2554.
[6]　 Li G, Fan B L, Wendu R L, et al. Analysis of soil fungal community
structure of stipa steppes in Hulunbuir, Inner Mongolia [J]. Acta
Pedol Sin, 2011, 48(5): 1096–1102.
李刚, 范宝莉, 文都日乐, 等. 呼伦贝尔针茅草原土壤真菌群落
结构分析 [J]. 土壤学报, 2011, 48(5): 1096–1102.
[7]　 Klamer M, Roberts M S, Levine L H, et al. Influence of elevated
CO2 on the fungal community in a coastal scruboak forest soil
investigated with terminal-restriction fragment length polymorphism
analysis [J]. Appl Environ Microb, 2002, 68(9): 4370–4376.
[8]　 Meng P P, Liu X, Qiu H Z, et al. Fungal population structure and
its biological effect in rhizosphere soil of continuously cropped
potato [J]. Chin J Appl Ecol, 2012, 23(11): 3079–3086.
孟品品, 刘星, 邱慧珍, 等. 连作马铃薯根际土壤真菌种群结构
及其生物效应 [J]. 应用生态学报, 2012, 23(11): 3079–3086.
[9]　 Xue L, Kuang L G, Chen H Y, et al. Soil nutrients, microorganisms
and enzyme activities of different stands [J]. Acta Pedol Sin,
2003, 40(2): 280–285.
薛立, 邝立刚, 陈红跃, 等. 不同林分土壤养分、微生物与酶活
性的研究 [J]. 土壤学报, 2003, 40(2): 280–285.
[10]　 Wu Y P, Ma B, Zhou L, et al. Changes in the soil microbial
community structure with latitude in eastern China, based on
phospholipid fatty acid analysis [J]. Appl Soil Ecol, 2009, 43
(2/3): 234–240.
[11]　 Smlander A, Kurka A, Kitunen V, et al. Microbiomass C and N
and respiratiory activity in soil of repeatedly limed and N and P
fertilized Norway Spruce stands [J]. Soil Biol Biochem, 1994,
26(8): 957–962.
[12]　 Treseder K K, Egerton L M, Allen M F, et al. Alteration of soil
carbon pools and communities of mycorrhizal fungi in chaparral
exposed to elevated carbon dioxide [J]. Ecosystems, 2003, 6(8):
786–796.
[13]　 Zhuang T C, Lin P, Chen R H. A preliminary investigation on
dominant genera of heterotrophic bacteria and filamentous fungi
in soils under different types of forest on Wuyi Mountain, Fujian
[J]. Acta Pedol Sin, 1998, 35(1): 119–123.
庄铁诚, 林鹏, 陈仁华. 武夷山不同类型森林土壤细菌、丝
状真菌优势菌属的初步研究 [J]. 土壤学报, 1998, 35(1): 119–
123.
[14]　 Song Z, Zhu J M, Yang Y S. Studies on soil microbiological
characteristics of evergreen broad-leaved forest in northern
Fujian Province [J]. J Fujian Coll For, 2000, 20(4): 317–320.
宋漳, 朱锦懋, 杨玉盛. 闽北常绿阔叶林土壤微生物学特性的
研究 [J]. 福建林学院学报, 2000, 20(4): 317–320.
[15]　 Wu Z Y, Lin W X, Chen Z F, et al. Characteristics of soil microbial
community under different vegetation types in Wuyishan National
韩世忠等：中亚热带森林土壤真菌多样性的案例研究
352 第23卷热带亚热带植物学报
Nature Reserve, East China [J]. Chin J Appl Ecol, 2013, 24(8):
2301–2309.
吴则焰, 林文雄, 陈志芳, 等. 武夷山国家自然保护区不同植
被类型土壤微生物群落特征 [J]. 应用生态学报, 2013, 24(8):
2301–2309.
[16]　 Luo J, Ran W, Hu J, et al. Application of bio-organic fertilizer
significantly affected fungal diversity of soils [J]. Soil Sci Soc
Amer J, 2010, 74(6): 2039–2048.
[17]　 Wang Q Z, Xu Q F, Jiang P K, et al. DGGE analysis of PCR of
16S rDNA V3 fragments of soil bacteria community in soil under
natural broadleaf forest invaded by Phyllostachy pubescens in
Tianmu Mountain Nature Reserve [J]. Acta Pedol Sin, 2009,
46(4): 662–669.
王奇赞, 徐秋芳, 姜培坤, 等. 天目山毛竹入侵阔叶林后土壤细
菌群落16S rDNA V3区片段PCR的DGGE分析 [J]. 土壤学报,
2009, 46(4): 662–669.
[18]　 Zhao Z X, Xiao M, Zheng F, et al. Diversity analysis of soil
fungal communities in tropical rain forest by 18S rRNA gene
cloning [J]. J Anhui Agri Sci, 2012, 40(11): 6378–6382.
赵志祥, 肖敏, 郑芬, 等. 热带雨林土壤真菌18S rRNA基因多
样性分析 [J]. 安徽农业科学, 2012, 40(11): 6378–6382.
[19]　 Dong A R, Lü G Z, Wu Q Y, et al. Diversity of soil fungi in
Liangshui Natural Reserve, Xiaoxing’anling Forest Region [J]. J
NE For Univ, 2004, 32(1): 8–10.
董爱荣, 吕国忠, 吴庆禹, 等. 小兴安岭凉水自然保护区森林土
壤真菌的多样性 [J]. 东北林业大学学报, 2004, 32(1): 8–10.
[20]　 Zang M. Taxonomy, mycogeography and ecto-mycorrhizal
association of the boletales from China:Ⅰ. Family Strobilomyce-
taceae [J]. Mycosystema, 1997, 16(3): 192–196.
[21]　 Sarathchandra S U, Ghani A, Yeates G W, et al. Effect of nitrogen
and phosphate fertilizers on microbial and nematode diversity in
pasture soils [J]. Soil Biol Biochem, 2001, 33(7/8): 953–964.
[22]　 Yu G C, Wen X H, Li D F, et al. Formation of the ligninolytic
enzymes by Phanerochaete chrysosporium under various
ammonium nitrogen concentrations [J]. Acta Sci Circum, 2003,
23(6): 802–806.
喻国策, 文湘华, 李东锋, 等. 黄孢原毛平革菌在多种氨氮浓
度下木质素降解酶的产生 [J]. 环境科学学报, 2003, 23(6):
802–806.
[23]　 Liu L, Duan Z H, Wang S L, et al. Effects of Cunninghamia
lanceolata plantations at different developmental stages on soil
microbial community structure [J]. Chin J Ecol, 2009, 28(12):
2417–2423.
刘丽, 段争虎, 汪思龙, 等. 不同发育阶段杉木人工林对土壤
微生物群落结构的影响 [J]. 生态学杂志, 2009, 28(12): 2417–
2423.
[24]　 Myrold D D. Transformations of nitrogen [C]// Sylvia D M,
Fuhrmann J J, Hartel P G, et al. Principles and Applications of
Soil Microbiology. Upper Saddle River, New Jersey: Prentice
Hall, 1998: 259–294.
[25]　 Gao L, Liu X Z, Zong Z F. Effects of carbon concentration
and carbon-to-nitrogen ratio on spore germination of several
biocontrol fungi [J]. Acta Phytophylac Sin, 2009, 36(1): 93–94.
高利, 刘杏忠, 宗兆锋. 碳浓度及碳氮比对几种生防真菌孢子
萌发的作用 [J]. 植物保护学报, 2009, 36(1): 93–94.
[26]　 Sakamoto K, Oba Y. Effect of fungal to bacterial biomass
ratio on the relationship between CO2 evolution and total soil
microbial biomass [J]. Biol Fert Soils, 1994, 17(1): 39–44.
[27]　 Högberg M N, Högberg P, Myrold D D. Is microbial community
composition in boreal forest soils determined by pH, C-to-N
ratio, the trees, or all three? [J] Oecologia, 2007, 150(4): 590–
601.
[28]　 Xu Y, Lan J. Advances in the research of fungal laccase [J]. Acta
Edul Fungi, 2005, 12(1): 57–64.
许颖, 兰进. 真菌漆酶研究进展 [J]. 食用菌学报, 2005, 12(1):
57–64.
[29]　 Chen X B, Su Y R, He X Y, et al. Basidiomycetous laccase gene
diversity in two subtropical forest soils [J]. Chin J Appl Ecol,
2011, 22(10): 2699–2704.
陈香碧, 苏以荣, 何寻阳, 等. 亚热带两种森林土壤担子菌漆酶
基因多样性比较 [J]. 应用生态学报, 2011, 22(10): 2699–2704.
[30]　 Xiao X L, Yang H T, Xia X Z, et al. Identification and
classification of Trichoderma spp. by morphology and soluble
protein gel electrophoresis analysis [J]. Shandong Sci, 2002,
15(1): 5–12.
肖性龙, 杨合同, 夏贤志, 等. 木霉菌的形态学和可溶性蛋白质
电泳鉴定与分类 [J]. 山东科学, 2002, 15(1): 5–12.
[31]　 Zhang H, Yan Y W, Xian H Q. The research of classification of
Tichoderma species in Shandong Peninsul [J]. Chin Agri Sci
Bull, 2011, 27(9): 184–190.
张红, 颜艳伟, 咸洪泉. 山东半岛地区土壤中木霉菌资源分类
研究 [J]. 中国农学通报, 2011, 27(9): 184–190.
[32]　 Yin G L, Wang W M, Sha S, et al. Isolation and sequence analysis
of Tri101 gene from Trichoderma harzianum [J]. J Chin Univ
Metrol, 2010, 21(2): 133–139.
尹国良, 王为民, 沙莎, 等. 哈茨木霉菌Tri101基因的克隆与序
列分析 [J]. 中国计量学院学报, 2010, 21(2): 133–139.
[33]　 Chen Y X, Chen B, Pan Z D, et al. Application and studies on
plant-growth promoting rhizobacteria [J]. Chin J Biol Control,
1985, 1(2): 22–23.
陈延熙, 陈璧, 潘贞德, 等. 增产菌的应用与研究 [J]. 生物防治
通报, 1985, 1(2): 22–23.