全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(6)：532-538
Journd ofTropical and Subtropical Botany
蓝猪耳受精生物学研究进展
陈素红 ，田惠桥 ，廖景平
(1．中国科学院华南植物园，广州 510650；2．中国科学院研究生院，北京 100039；3．厦门大学生命科学学院，福建厦门361005)
摘要：蓝猪耳 (Toreniafournieri L．)胚囊半裸露，在光学显微镜下能清楚观察到卵细胞、助细胞及部分中央细胞的形态
结构，有助于原位观察卵细胞在受精前后的变化状态，被认为是研究被子植物体内受精机理的一种模式植物。综述了
蓝猪耳的受精机理：花粉管定向进入胚囊的方式与机理、钙在受精过程中的作用、受精前后胚囊细胞骨架的动态变化。
简要介绍了离体受精技术在蓝猪耳受精生物学中的发展应用。根据前人对蓝猪耳的研究成果并结合我们的研究，指出
蓝猪耳在受精生物学中的应用，特别是借助离体受精技术平台，将具有更大的研究前景。
关键词：蓝猪耳；花粉管；钙：细胞骨架；离体受精；综述
中图分类号：Q944．44 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2006)06—0532—07
Advances in Studies on Fertilization of Torenia fournieri
(Scrophulariaceae)
CHEN Su—hong ， TIAN nui—qiao ， LIAO Jing—ping
(1．South China Botwzical Garden,the Chinese Academy ofSciences，Guangzhou 510650，China；2．Graduate University ofthe Chinese Academy of
Science，Beijing 100039，China；3．School ofLife Sciences，Xiamen University，Xiamen 361005，China)
Abstract：Torenia fournien(Scrophulariaceae)is a suitable experimental plant for studies of angiosperm fertiliza—
tion since it has semi—naked embryo sac within which egg cell，two synergids and part of the central cell are clearly
visible under the light microscope，which facilitates the in situ observation of egg cel before and after fertilization．
Progress in researches on fertilization mechanism of fournieri is reviewed in the folowing aspects：how the
pollen tubes get into the embryo sac， dynamics of calcium in fertilization process， changes in the cytoskeleton of
embryo sacs before and after fertilization．The signifcance of fournieri in the studies of in vitro fertilization is
briefly described．
Key words：Toreniafournieri；Polen tube；Calcium；Cytoskeleton；／n vitro fertilization；Review
受精是生物体世代转换的重要转折点，与有性
生殖有着密切联系。动物和低等植物具有生殖细胞
离体程度高的优越性，因此目前在生殖机理的研究
上较为深入。而高等植物独具的双受精过程因发生
在深藏于花器官组织中的雌配子体内，加大了对这
一 系列严格有序的时空发育特征研究的难度，至今
对高等植物受精机理的认识还很有限。如花粉管如
收稿 日期 ：2006．02．27 接受 日期：2006．05．30
基金项目：国家自然科学基金 (30170060，30370099，40332021)资助
通讯作者 Coresponding author
何将雄配子输送到胚囊，雌、雄配子之间是否有识
别至特异结合，受精激活卵细胞的机理是什么等等
有趣的双受精问题仍待深入研究。为了克服被子植
物雌配子体难研究的缺陷，寻找一种具特殊胚囊结
构、便于观察受精过程的植物势在必行。
蓝猪耳 (Toreniafournieri)是玄参科 (Scrophu—
lariaceae)蝴蝶草属 (ToreniaL．)植物。其胚囊结构
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第 6期 陈素红等：蓝猪耳受精生物学研究进展 533
特殊：成熟胚囊在珠孔端裸露出卵细胞、助细胞及
一 半中央细胞，这为受精生物学研究提供了很大方
便。再者蓝猪耳是草本植物，总状花序，花期长达 6—
7个月，给试验者提供充裕的实验材料。由于蓝猪耳
易培养，花的数量多，花期长，特别是具有半裸露的
胚囊结构，因而许多科研人员对蓝猪耳的受精机理
进行了大量的深入研 ”]，并认为蓝猪耳是研究被
子植物受精生物学的一种模式植物。本文对蓝猪耳
受精生物学近几十年的研究加以总结和讨论，同时
结合我们的研究工作寻找一条对蓝猪耳受精研究
的新途径。
1蓝猪耳的花粉管定向进入胚囊的研究
Higashiyama等【 ]通过对蓝猪耳半裸露胚囊结
构的研究得到了受精全过程的大致时刻表，这就为
深入研究花粉管如何进入胚囊和两个精细胞如何
与各自的靶细胞相结合建立了离体体系。针对花粉
管是否随机进入胚囊这一问题，Higashiyama等[2]以
蓝猪耳为材料，将其萌发的花粉管与胚珠共培养发
现：半离体培养的花粉管比离体萌发的花粉管能更
精确有效地通过助细胞丝状器进入胚囊；没能顺利
进入胚囊的花粉管在珠孔处打个卷后仍会进入同
一 丝状器；花粉管只能进入完整、未受精的胚囊，而
不会进入受热处理或助细胞已损坏的胚囊。从而得
出结论：在离体条件下，花粉管只进入具活性助细
胞且未受精的胚囊。在绝大多数具有助细胞的被子
植物中，花粉管都是经助细胞将两精细胞释放到受
精靶区。雄配子的运输载体花粉管与助细胞之间存
在怎样的关系?Higashiyama等[3]在已建立的蓝猪耳
离体体系上采用激光消除胚囊内雄性性细胞的方
法证实助细胞对花粉管具有特异吸引的功能。他们
认为，存在一个具有功能的助细胞就有能力产生吸
引花粉管的信号，存在两个则可以增强这个信号；
但在已受精的胚囊内，即使宿存一完整助细胞，也
不再具有吸引花粉管的能力，这种吸引能力的中止
可能就是打破多精入卵的主要原因。
被子植物从授粉到受精需经历两个阶段：花粉
粒萌发长出花粉管，花粉管被吸引进入胚囊；花粉
管在胚囊内释放两个精细胞，它们分别与卵细胞和
中央细胞融合完成受精。前一阶段的关键在于花粉
管能否准确无误地从珠孔端经过助细胞进入胚囊。
由于助细胞是花粉管进入胚囊的必经途径，因此才
被认为具有吸引花粉管的功能。直到 Higashiyama
等建成蓝猪耳离体体系后，采用激光消除细胞法才
真正证实了花粉管是被助细胞吸引进入胚囊的。但
花粉管对两个助细胞是有选择地进入还是随机进
入尚不清楚。研究者在烟草 (Nicotiana tabncum L．)
和矮牵牛 (Petunia hybrida L．)中发现姊妹助细胞
中钙含量差异明显[12-13]，其中烟草退化助细胞中的
钙含量高于宿存助细胞【 ]。之后，Tian和 Russel研
究证实，花粉管正是进入钙含量较高的退化助细胞
中【 。然而，在 小麦 (Triticum aestivum L．)、珍珠
谷 (Pennisetum glo~cum L．)、向 日葵 (Helianthus
帆凡u L．)和油菜 (Brassica napus L．)的成熟胚囊
中，姊妹助细胞的钙含量没有明显差异，但在传粉
后，向日葵退化助细胞中的钙含量剧增，油菜两个
助细胞中钙沉淀颗粒大小显示出差异【 5-20]。这些结
果表明，花粉管在进入助细胞时可能存在着选择
性，两个助细胞中钙含量的差异可能是花粉管选择
性进入的依据。根据助细胞吸引花粉管的有关研究
推测，花粉管很可能只从含钙量高的完整助细胞进
入胚囊。未受精的胚囊中助细胞产生吸引花粉管的
信号，花粉管就向胚珠珠孔端生长，在珠孔处花粉
管选择从含钙量高的助细胞进入胚囊；在人为破坏
一 个助细胞的未受精胚囊中，另一个完整助细胞仍
能产生吸引花粉管的信号，花粉管生长到珠孔处，
完整的助细胞较已破坏的助细胞含钙量高，花粉管
选择从完整的助细胞中进入胚囊；在已受精的胚囊
中，宿存的助细胞也能产生吸引花粉管的信号，但
由于退化的助细胞较宿存的助细胞含钙量高，因而
花粉管不会选择从宿存助细胞进入胚囊，因此打破
了多精入卵。在助细胞吸引花粉管进入胚囊这个现
象中，助细胞中的钙一直行使着调节功能，使花粉
管能顺利地完成输送精子的使命。这一推测需要选
择蓝猪耳这种具特殊胚囊结构的植物，应用细胞学
和分子生物学方法深入研究加以证明。
2蓝猪耳受精过程中钙的研究
钙作为第二信使在植物信号转导中的作用，一
直是植物生理学、细胞生物学和发育生物学研究的
热点，对于被子植物双受精的研究也不例外。目前，
钙在胚囊 中分布 的研 究方法有 x射线 能谱法
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热带亚热带植物学报 第 14卷
(energy-dispersive X-ray analysis，EDXA)、金霉 素
法 (CTC)和焦锑酸钾沉淀法。焦锑酸钾沉淀法不
仅可以原位定位钙 ，还可用于钙沉淀的数量统
计[14-1521]，是 目前研究雌蕊中钙分布 的常用方法 。
Krist6f等采用焦锑酸钾沉淀法研究了蓝猪耳从授
粉到受精期间胚珠中钙分布变化。蓝猪耳受精前，
大量的钙主要分布在胚囊表层、胚囊内粘质和卵器
细胞间的胞外区域，少量钙仅在胚囊周围的珠心细
胞和中柱及珠柄的表皮细胞内有；授粉后，钙大量
分布在珠孔表层处由珊瑚状细胞壁构成的迷路结
构中，花粉管进入胚囊后退化助细胞中钙含量增加
且主要分布在退化助细胞的液泡中 。目前，对蓝猪
耳受精过程中钙动态分布研究还比较浅显，加之采
用焦锑酸钾沉淀法研究钙动态分布具一定的局限
性，因而对钙在受精中信号转导的研究还需注重对
游离钙时空动态分布的研究。
被子植物胚囊深藏于胚珠珠心组织内，在双受
精时期直接研究钙的动态分布存在很大难度。欲取
得钙在助细胞退化与吸引花粉管、雄配子释放与转
移等方面的确切实证，则应选择具裸露胚囊的蓝猪
耳这种材料为研究对象，研究其中[Ca2+]c的变化规
律。Han等首次将蓝猪耳精细胞提取物注入成熟的
中央细胞后，发现有明显的游离钙浓度增加，这种
钙浓度增加延续 20 min达到最高峰，接着平稳下
降，然而高钙水平可持续 40 min；同时他们将玉米
(Zea mays L．)精子提取物和肌醇三磷酸分别注入
蓝猪耳中央细胞中，发现玉米精子提取物不能诱导
中央细胞中『Ca2qc增加，肌醇三磷酸虽可诱导[Ca2qc
增加，但波峰出现快，高钙水平仅持续 300 S。这些结
果说明精细胞内可能存在某些专一因子直接诱导
钙的增加，并且提示精子提取物引起钙增加可能与
肌醇三磷酸途径有关[81。
目前为止，针对被子植物双受精过程中直接测
定游离钙的动态变化仅限于玉米精、卵细胞体外融
合实验[231。对体内受精过程游离钙的研究资料还十
分欠缺。蓝猪耳这种具有透明胚珠的材料，可尝试
研究其从授粉到受精过程中各个生殖细胞内游离
钙的动态变化，以期更深入地解释受精机理问题。
3蓝猪耳胚囊中细胞骨架的研究
植物细胞骨架的研究自80年代开始成为细胞
生物学研究的热点。维持植物细胞空间结构的细胞
骨架包括微管、微丝和中间纤维三种类型，它们参
与植物细胞的分裂机制、细胞运动及细胞器运动、
细胞的极性以及物质运输等活动，可能还与信息传
递有关【24J。近年对细胞凋亡信号转导的研究发现，三
种细胞骨架在凋亡过程中变化非常活跃，它们在细
胞内的状态直接影响凋亡信号的终止，这表明细胞
骨架可能是信号转导的空问调控者和功能性分
子[251。据此，研究植物细胞骨架对揭示植物细胞生命
活动中的细胞学事件具有重要作用。
大多植物的胚囊深藏于胚珠珠心组织内，难以
直接观察雌配子的生命活动。目前，植物细胞骨架
领域的研究多集中在花粉管中，对受精过程微管、
微丝骨架研究较少。现多用冰冻包埋，结合免疫细
胞化学技术等方法开展植物细胞骨架的研究，在白
花丹 (Plumbago zeylanica L．)，烟草和玉米中都取
得了一些研究成果。然而，蓝猪耳半裸露胚囊的特
殊结构为借助荧光反应物直接观察细胞骨架的动
态分布提供了可能。目前，对蓝猪耳受精过程的细
胞骨架研究也取得了一些成果。蓝猪耳胚囊的珠孔
端有大量的微丝分布，且微丝呈帽状，这个帽状的
微丝结构在开花前两天出现，但花粉管进入胚囊时
即消失，因此推测丝状器附近的微丝可能与分泌吸
引花粉管的向化性物质使花粉管进入有关[7】。同时
还发现蓝猪耳助细胞的合点端和卵细胞中的微丝
多随机分布，而中央细胞的微丝呈网状分布，且在
其膜下有很多的微丝束[726]。通常认为蓝猪耳助细胞
中微丝的变化与授粉无关，助细胞在开花后就退
化，显微注射标记的微丝同时解聚，肌动蛋白聚集
在合点端7】。但卵细胞的微丝在授粉后发生很大的
变化，首先是珠孔端的膜下微丝片段化和解聚，最
后聚集成一条明显的肌动蛋白带，推测这条带应是
冠状带的一个组成部分，但它由胞内微丝组成，与
授粉有关。在花粉管释放内含物后，冠状带变得更
浓密[7261。近年来在中央细胞也发现类似的变化，这
种肌动蛋白的动态变化可能涉及次生核的移动。对
蓝猪耳中央细胞受精过程不同阶段的微丝动态变
化研究表明，成熟的中央细胞在开花后微丝分布成
网状，特别多的微丝束环绕在次生核周围，大量微
丝束连接着次生核膜，并延伸到珠孔端的膜下，这
可能与次生核在受精时向珠孔端移动有关【Ⅷ。
选用蓝猪耳这种特殊材料较便于研究细胞骨
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鹭6期 翥红等：蓝耕 受精牛物学研究进牌
架在乍命活动 I一的苇婴功能，从而解释情物整个屯
活 划发生各式各样的事件 在被子植物戳受精过
程中细胞骨架起到了不口取代的作用，例如在花粉
管[!『i笈、牛 长过程 胞骨絮竣牛怎样的动态变
化 在跟受精过程-} 细胞骨架与细胞核迁移、胞质
重组以及细胞情 转导存在怎样的关系。这些川题
都宵待进行深入曲探讨 j研究
4蓝猪耳生殖细胞的分离及离体受精
技术平台的建立
a 一
状态两大优点。因此选择一种模式植物研究受精生
物学相当必要 篮猪耳园其特殊的胚囊结构及自身
生活特性适宜丁离体受精体系的建立，FL日前在受
精生物学研究上也已奠定了 ‘定基础。
八十年代末，Keijzer等 。i提出造J_Ij显微操作技
l术将分离出的精纽J胞注射到胚囊tlI．完成离体祭件
下的受精过矬。他 选J_{=】肝囊半裸露的监猜耳为实
验材料．直接萄发花粉粒，将花粉莆t11分离I’ 精细
胞从t¨ 尖细胞 侧沌射到 囊 注入的梢郛1船与
卵纲廿包融合的次数极少．结果并不 想 这条缝径
虽来成功+lf1 Keijzer指；“J 显微撵作技术对受精
j_=』羁 研究的重要意义：(1)研究锓微注射 损伤
胞的 {i理变化：(2)研究科，内或科- 分-商的精细胞
被注射到完蜒胁’囊后 卵细胞融台的命运：f 3)成
功地完成离体受鞴，可扶似新的种M杂叟I 1：．I1此，
近几 年来 ．试 应 显微操作技术在靛 l r受精
㈠_1口研究u三屡见小鲜 雌配f体抒离 与而，最例
Ke~zer从临猜 花鼢粒I晰发的花粉骨 l-舒离1l 精
圳胞： 后 Pal V(igi 研究雄 r仲发舟过 tl-遁
羽活体 一高体法 【Shivanna)分离 f 1地⋯：瞄、鬃
红等 不仪从个K佬托K 的花粉管：l1分离到人齄
的成埘精 胞，嗬 分川收镟剑韬细胞的1 个群
体。雌 r体分离疗liI1，MnI 光运川耐 浊分离靛
猪 囊．f『]没f】榆验 ⋯”iKrist6f和 [rare川酶
辫浊成功地分离 _r蓝猜耳的 活U 、斑 ：此 ．他
根据渗透』L 技育阶段n 牛¨ 关’ ，利川通 J一再个
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阶段渗透丌{义逐渐降低 q ⋯葡分离慵猜L1 li10 u乜
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FIu0r ce【n diacelale IFDA)【e ol isohated two sperm cel s from 7 lⅢh~zi r#zierilx l cl(HJ)
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536 热带亚热带植物学报 第 14卷
度的酶液对卵细胞会产生较大的不良影响，因此迫
切需要改进分离方法。
离体受精技术在被子植物有性生殖的研究中
具有重要意义，它不仅可排除体细胞组织的干扰来
探索精、卵细胞的识别和合子的激活问题，还可能
作为单倍体育种、远缘杂交等应用领域的技术手
段 。因此，我们试图建立蓝猪耳 (具半裸露胚囊)
的离体受精技术平台。目前，我们已成功地分离出
最接近受精前的生活精细胞 (图 la，b)，并能收集
大量的 Sua和 Svn群体1361。对于被子植物较难分离
的雌配子体，我们 已用解剖法分离出生活的卵细
胞【41l。蓝猪耳的精、卵细胞的分离操作都己获得成
功，接着我们将进行体外融合及合子的体外微培
养。培养蓝猪耳的再生植株为双子叶植物体外融合
合子培养再生植株的成功开创先例。
5结束语
受精作用在有性生殖过程中始终占有中心的
位置【42】。对高等植物双受精作用的研究主要表现在：
细胞骨架在花粉管萌发、生长及生殖细胞发育中的
功能，钙在植物受精过程中的作用，配子融合机理
和植物离体受精在有性生殖研究中的应用。近二、
三十年来，在被子植物受精作用的这几个重要研究
方面取得了惊人的进展。在细胞生物学方面，在采
用超微结构观察方法的同时，还发展了三维重构、
图象分析、免疫化学和荧光探针技术等精密方法，
揭示了雄性生殖单位、精子二型性、选择性受精等
现象。形成的新概念如雄性生殖单位、精子二型性
等在胚胎学文献中已确认，并揭示了配子体的细胞
骨架分布规律，融合中雄配子体的状态及细胞质的
参与；对精细胞的运动与传递，细胞质的遗传方式
有了新的理解。在生理生化方面，最突出的是采用
分子生物学技术研究花粉发育、花粉与雌蕊组织间
的识别反应、配子间的识别反应的分子生物学基
础，从而对受精机理的许多问题提升到从基因表达
和调控的水平去理解。在实验研究方面，采用性细
胞的分离和培养技术，在单子叶植物玉米中实现了
真正的离体受精，并获得了相当丰富的有关玉米受
精过程的新信息。然而，目前迫切需要在高等植物，
尤其是在双子叶植物中开展离体受精的研究，以验
证高等植物受精机理的普遍性。
图2 离体受精技术平台在植物有性生殖研究中的应用
Fig 2 In vitro fertilization used in the research ofplant sexual reproduction as a technique platform
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第 6期 陈素红等：蓝猪耳受精生物学研究进展 537
高等植物受精作用的研究在迅速发展，并不断
出现新成果。国际上已陆续出现反映受精动态的研
究论文，特别是有关性细胞的分离和离体受精方面
的进展突飞猛进。但被子植物的离体受精难度在于
胚囊外有厚的珠心包被。而玄参科植物蓝猪耳具有
独特的胚囊结构，利于离体受精的研究，被视为受
精生物学研究的模式植物。因此，建立蓝猪耳离体
受精的实验体系，研究受精生物学问题具有深远的
意义。离体受精作为技术平台在有性生殖研究中的
深入发展如图2所示。即借助离体受精技术平台从
细胞、分子两方面更深入地研究高等植物生殖生物
学的机理。
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