全 文 :热带亚热带植物学报 2004,12(5):431—434
Journal ofTropical and SubtropicalBotany
非洲菊查尔酮合酶基因的克隆、序列
分析及在大肠杆菌中的表达
谢修志,陈兆平 ,王小菁
(华南师范大学生命科学学喀,J 东省植物发育生物工程重点实验室,广东广州510631)
摘要:利用 RT.PCR方法,从非洲菊(Gerbera hybrida)花瓣的cDNA中克隆到了查尔酮合酶(Chalcone Synthase,CHS)基
因 CHS,进行了序列分析。结果表明,克隆到的CHS基因全长为 1 197 bps,编码一个南 398个氨基酸残基组成的多肽,
与 Helariuta等发表的非洲菊查尔酮合酶 CHS1基因的 cDNA序列的 CHS基因同源性高达 99%。进一步将该基因克
隆到表达载体 pET32a上,经 IPTG诱导表达,得到高效表达的融合蛋白。
关键词:非洲菊:查尔酮合酶;序列分析;基因表达
中图分类号:Q943.2 文献标识码:A 文章编号:1005—3395(2o04)05—0431-04
Chalcone Synthase Gene Cloning in
Gerbera hybrida and Expression in E.coli
XIE Xiu.zhi, CHEN Zhao-Ping , WANG Xiao-j ing
(Colege ofLife Science,South China Normal University,Guangdong Key Lab ofBiotechnolog) for Hant Development,Guangzhou 510631,China)
Abstract:Chalcone synthase(CHS)gene was cloned from the petals of Gerbera hybrida using RT-PCR method in
our experiment. The sequence of the cDNA coding region was 1 1 97 bps, encoding a protein of 398 amino acids
sharing 99% identical to CHS 1 cDNA reported by Helariutta.The gene was fused in expression vector pET32a and
was eficiently expressed by transforming into E.coli BL2 1(DE3)with IPTG induction.
Key words:Gerbera hybrida;Chalcone synthase;Sequence analysis;Gene expression
花色是大 自然赋予有花植物繁衍后代的重要
特性,在生产中也是花卉品质的重要指标。花色素
苷是类黄酮生化合成的产物,在花色形成中起最主
要的作用[I-3]。
查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)是类黄酮
合成中的第一个特异性酶,它催化丙二酰辅酶 A的
三个乙酸基和对羧基苯丙烯酰辅酶 A的一个乙酸
基缩合成苯基苯乙烯酮 。在大多数的花中,CHS
的表达具有特异性,受不同发育阶段的调控[718]。外
界环境因素如光、温度和植物激素都影响 CHS的表
达,影响花的着色[7,9-12]。在植物中,CHS是一个多基
因家族[1314]。
收稿 13期 :2003—10—10 接受 13期 :2004—02—26
基金项目:J ‘东省 自然科学基金(003062)资助
通讯作者 Corresponding author
非洲菊(Gerbera hybrida)花朵硕大 ,颜色丰富
鲜艳,是世界六大切花植物之一,具有很好的经济
价值。我们以非洲菊花瓣为材料,采用 RT—PCR技
术克隆 CHS1基因,进行序列分析,并使其在大肠杆
菌中高效表达,为进一步研究光、激素、温度等外界
因素对 CHS表达的影响及 CHS对植物花色的影响
奠定基础。
1材料和方法
1.1材料
植物材料 黄色非洲菊(Gerbera hybrida)为华
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432 热带亚热带植物学报 第 12卷
南师范大学生命科学学院实验基地大棚种植,日温
22—26℃,夜温 l5一l8℃。2000年 4月采集刚开放的
花,液氮速冻。.70℃保存备用。
细菌菌株和质粒 大肠杆菌 XL.blue为转化
受体菌,克隆载体为pBluescript(KS),原核表达载体
为pET32a(+1,大肠杆菌 BL2 l(DE3)为表达受体菌。
试剂和酶 逆转录酶 (AMY)为 GmICO产
品;限制性内切酶为 Takara产品;Taq酶、DNA电
泳凝胶回收试剂盒购 自上海生工公司。
1.2 方 法
总 RNA的提取 取经液氮速冻的外轮舌状
花在液氮中研磨成粉末,按申能博彩公司的Triblue
说明书提取总RNA,紫外和电泳检测后,.70~C保存
备用。
cDNA合成与 PCR扩增 以总 RNA为模
板,Oligo(dT)为引物,按照 GIBICO公司逆转录酶
说明书进行逆转录得到单链 cDNA。根据 Helafiu~a
等[15】发表的非洲菊(Gerbera hybrida)查尔酮合酶
CHS1基因的cDNA序列。由上海生工生物技术服
务有限公司合成引物 CHSF:TTGAATTCAGATAA
CAATGGCGTCCTCC和 CHSR:CCGGATCCCAA
ACGTACATTCATTCCAACA。取 l l逆转录物进
行 PCR扩增,两端引物各为 100 pmol,10 mmol/L
dNTPs 2 txl,TaqDNA(5 U txl )聚合酶 l l,加水至
100 l。在 MJ公司 PTC.100型热循环仪上进行
PCR扩增。反应条件:预变性94℃5 min后,94"C变性
30 S,58℃退火 30 S,30个循环,72℃后延伸 120 S。扩
增后电泳检测并用 DNA电泳凝胶回收试剂盒回收
扩增产物。
PCR产物的克隆及序列分析 设计PCR引
物时两端加上了BamHI和EcoR I位点,因此,将纯
化的PCR产物用 BamH I和 I进行双酶切,然
后克隆到 pBluescript(KS)的 BamH I和 EcoR I位
点,转化大肠杆菌 XL.blue感受态细胞,在选择性培
养基上蓝白斑筛选,挑取阳性白色菌落进行 PCR鉴
定、酶切鉴定和测序鉴定(测序送往上海基康生物技
术有限公司,在 3700型测序仪上完成)。
表达质粒的构建 根据测序结果和原核表
达 载体pET32a(+)的酶切 位 点设计 引物TTGGA
TCCATGGCGTCCTCCGTTGACATG;TTGAA TTC
GATGATAAAGTTTAGACGGCAACC,将 CHS基
因克隆到表达载体 pET32a(+1的 BamH I和 EcoR I
位点,转化大肠杆菌 DE3感受态细胞,PCR筛选阳
性克隆。酶切鉴定得到重组克隆 pET.CHS。
表达产物的诱导及 SDS.PAGE胶分析 将
pET.CHS单菌落接种到 3 ml含氨苄青霉素的 LB
培养基中,于37。C培养过夜,取500 Ixl过夜培养液,
加到50 ml含氨苄青霉素的LB培养基中,于37℃
继续培养到OD枷为0.6,加 l mol/L的IPTG至终
浓度为 l mmol/L,20℃低温诱导培养,分别在诱导
2 h、4 h和 6 h时取 1.5 ml样品,离心收集菌体.菌
体 再悬 浮 于 100 Ixl缓 冲 液(5 mmol/L Tris.HC1,
10 mmol/L EDTA,pH8.0,50 mmol/L葡萄糖),加等
体 积 的 2~SDSA 凝 胶 加 样 缓冲 液 ,l00℃ 煮沸
5 min,做 l2%的 SDS—PAGE胶分析。
2结果和讨论
2.1非洲菊总RNA的提取
紫外检测A瑚和A280,A 6o/A280为 1.9,l%琼脂糖
凝胶电泳、溴化乙啶染色,在紫外灯下显示,28S
rRNA的亮度大约是 l8S rRNA的2倍,说明提取的
总 RNA完整,没有发生降解 ,而且没有基因组
DNA污染(图 1),可以用来进行 RT.PCR扩增。
图 l非洲菊总RNA凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoretogram oftotal RNA
isolated from ray florets of Gerbera hybrida
l,2,3:分别代表3个重复 Total RNA ofthree repetitions
2.2 cDNA合成与 PCR扩增
以非洲菊花的总R_NA为模板,Oligo(dT)为引
物合成第一链 eDNA,用 CHSF和 CHSR引物进行
PCR扩增反应,得到 l 200 bps左右大小的片段f图
2),与预测的长度相符。
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第 5期 谢修志等:非洲菊查尔酮合酶基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达 433
bp
2O00——
1O00——
750‘ ——
500—
250..——
2 3
图2CH5基因 PCR产物凝胶电泳
Fig.2 Agarose gel electrophoretogram ofPCR product ofCHS
1.DNA分子量标准物 DL2000 marker;
2,3.CHS基因PCR产物PCRproductofCHS
2.3 PCR产物的克隆及序列分析
将纯化的 PCR产物用 BamH I和 EcoR I进行双
酶切,然后克隆到pBluescript(SK)的BamH I和 o
I位点,转化大肠杆菌 XL—blue感受态细胞,在选择性
培养基上蓝白斑筛选,得到多个阳性克隆,我们对其
中3个阳性克隆进行了酶切分析和序列测定分析,我
们克隆到的CHS基因全长为 1 197 bp,编码一个由
398个氨基酸残基组成的多肽,与Helariuta等 发表
的非洲菊(Gerbera hybrida)查尔酮合酶 CHS1基因的
eDNA序列的CHS基因同源性高达 99%。
bp
2313O
4361
2322
2027
图3阳性克隆pBluescript(SK)一CHS的酶切鉴定
Fig.3 Identifcation ofCHS fragment in pBluescript(SK)-CHS
1.DNA分子量标准物 kDNA/Hind II;2.质粒 pBluescript(SK1的
BamH YEcoR I的双酶切产物 Plasmid pBluescript(SK1 digested by
BamH c0R I;3,4,5.质粒 pBluescript(SK)-CHS的BamHI/&0R I的
双酶切产物 Plasmid pBluescript(SK)-CHS digested by BamH I/EcoR I;
6.CHS基因的PCR扩增产物 PCR Product ofCHS amplification
2.4 表达质粒 的构建
将 CHS基 因克隆到表达载体 pET32a(+)的
BamH I和 o I位点,转化大肠杆菌 BL21(DE3)
感受态细胞,得到许多阳性克隆,PCR、酶切鉴定阳
性克隆,得到重组克隆pET—CHS,最后选取 3号重
组克隆pET—CHS进行表达。
2 3 4 5
bp
21226
3530
1375
947
564
图4重组克隆 pET—CHS的酶切鉴定
Fig.4 Identification of CHS fragm ent in pET—CHS
1,2,3.PCR扩增产物 PCRproduct;4.质粒 pBluescript(SK)-
CHS的BamH I/EcoR I的双酶切产物 Plasmid pET-CHS digested
by BamH I/EcoR I;5.DNA分子量标准物 kDNA/EcoR l+HindⅢ
2.5表达产物的检测
将含有空载体 PET32a(+.)和克隆质粒 pET.CHS
的大肠杆菌经过 IPTG诱导实现了高效表达,提取
总蛋白进行 SDS—PAGE分析,电泳结果显示出 CHS
基因融合表达的特异条带。CHS蛋白分子量的理论
值是 43 kD,pET—CHS融合蛋白分子量的理论值大
2 3 4 5 6 kD
97.4
66.2
43.0
31.O
2O.1
14.4
图5 CHS1基因在大肠杆菌中表达的SDS.PAGE电泳图
Fig.5 SDS-PAGE ofthe expressed l in E.coli
l,2,3.IPTG诱导2、4、6 h,含质粒 pET的大肠杆菌所表达的
总蛋 白Total proteins of E.coli with pET after IPTG induction for
2,4,6 hours;4,5,6.IPTG诱导 2、4、6 h,含质粒pET.CHS的大肠
杆菌所表达的总蛋白Total proteins ofE.coli with pET.CHS after
IPTG induction for 2,4,6 hours;7.蛋白质分子标准物 Protein
molecular weightmark~.
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434 热带亚热带植物学报 第 12卷
约为 65 kD,与电泳图中显示的结果符合,而且融合
蛋白的表达量随着表达时间的增加而增加。
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60
欢迎订阅 2005年《生态环境》
《生态环境)TIJ号:ISSN 1672—2175;CN44一l565/X。原刊名为《土壤与环境》,是经国家科技部批准的正式学术期刊,向国内
外公开发行。被评选为全国中文核心期刊、中国科技核心期刊、中国自然科学核心期刊,广东省优秀期刊、广东省优秀科技期刊、
全国优秀农业期刊 (一等奖)、中国学术期刊 (光盘版)规范优秀期刊;入选 《中文核心期刊要目总览》(2004年最新版)、中国
科技论文统计源期刊、中国科学引文数据库。主要刊登国内外环境科学、生态学及相关领域具有创新性的重要研究论文,以及
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