全 文 ：热带亚热带植物学报 2004，12(5)：431—434
Journal ofTropical and SubtropicalBotany
非洲菊查尔酮合酶基因的克隆、序列
分析及在大肠杆菌中的表达
谢修志，陈兆平 ，王小菁
(华南师范大学生命科学学喀，J 东省植物发育生物工程重点实验室，广东广州510631)
摘要：利用 RT．PCR方法，从非洲菊(Gerbera hybrida)花瓣的cDNA中克隆到了查尔酮合酶(Chalcone Synthase，CHS)基
因 CHS，进行了序列分析。结果表明，克隆到的CHS基因全长为 1 197 bps，编码一个南 398个氨基酸残基组成的多肽，
与 Helariuta等发表的非洲菊查尔酮合酶 CHS1基因的 cDNA序列的 CHS基因同源性高达 99％。进一步将该基因克
隆到表达载体 pET32a上，经 IPTG诱导表达，得到高效表达的融合蛋白。
关键词：非洲菊：查尔酮合酶；序列分析；基因表达
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2o04)05—0431-04
Chalcone Synthase Gene Cloning in
Gerbera hybrida and Expression in E．coli
XIE Xiu．zhi， CHEN Zhao-Ping ， WANG Xiao-j ing
(Colege ofLife Science，South China Normal University,Guangdong Key Lab ofBiotechnolog) for Hant Development，Guangzhou 510631，China)
Abstract：Chalcone synthase(CHS)gene was cloned from the petals of Gerbera hybrida using RT-PCR method in
our experiment． The sequence of the cDNA coding region was 1 1 97 bps， encoding a protein of 398 amino acids
sharing 99％ identical to CHS 1 cDNA reported by Helariutta．The gene was fused in expression vector pET32a and
was eficiently expressed by transforming into E．coli BL2 1(DE3)with IPTG induction．
Key words：Gerbera hybrida；Chalcone synthase；Sequence analysis；Gene expression
花色是大 自然赋予有花植物繁衍后代的重要
特性，在生产中也是花卉品质的重要指标。花色素
苷是类黄酮生化合成的产物，在花色形成中起最主
要的作用[I-3]。
查尔酮合酶(Chalcone synthase，CHS)是类黄酮
合成中的第一个特异性酶，它催化丙二酰辅酶 A的
三个乙酸基和对羧基苯丙烯酰辅酶 A的一个乙酸
基缩合成苯基苯乙烯酮 。在大多数的花中，CHS
的表达具有特异性，受不同发育阶段的调控[718]。外
界环境因素如光、温度和植物激素都影响 CHS的表
达，影响花的着色[7,9-12]。在植物中，CHS是一个多基
因家族[1314]。
收稿 13期 ：2003—10—10 接受 13期 ：2004—02—26
基金项目：J ‘东省 自然科学基金(003062)资助
通讯作者 Corresponding author
非洲菊(Gerbera hybrida)花朵硕大 ，颜色丰富
鲜艳，是世界六大切花植物之一，具有很好的经济
价值。我们以非洲菊花瓣为材料，采用 RT—PCR技
术克隆 CHS1基因，进行序列分析，并使其在大肠杆
菌中高效表达，为进一步研究光、激素、温度等外界
因素对 CHS表达的影响及 CHS对植物花色的影响
奠定基础。
1材料和方法
1．1材料
植物材料 黄色非洲菊(Gerbera hybrida)为华
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432 热带亚热带植物学报 第 12卷
南师范大学生命科学学院实验基地大棚种植，日温
22—26℃，夜温 l5一l8℃。2000年 4月采集刚开放的
花，液氮速冻。．70℃保存备用。
细菌菌株和质粒 大肠杆菌 XL．blue为转化
受体菌，克隆载体为pBluescript(KS)，原核表达载体
为pET32a(+1，大肠杆菌 BL2 l(DE3)为表达受体菌。
试剂和酶 逆转录酶 (AMY)为 GmICO产
品；限制性内切酶为 Takara产品；Taq酶、DNA电
泳凝胶回收试剂盒购 自上海生工公司。
1．2 方 法
总 RNA的提取 取经液氮速冻的外轮舌状
花在液氮中研磨成粉末，按申能博彩公司的Triblue
说明书提取总RNA，紫外和电泳检测后，．70~C保存
备用。
cDNA合成与 PCR扩增 以总 RNA为模
板，Oligo(dT)为引物，按照 GIBICO公司逆转录酶
说明书进行逆转录得到单链 cDNA。根据 Helafiu~a
等[15】发表的非洲菊(Gerbera hybrida)查尔酮合酶
CHS1基因的cDNA序列。由上海生工生物技术服
务有限公司合成引物 CHSF：TTGAATTCAGATAA
CAATGGCGTCCTCC和 CHSR：CCGGATCCCAA
ACGTACATTCATTCCAACA。取 l l逆转录物进
行 PCR扩增，两端引物各为 100 pmol，10 mmol／L
dNTPs 2 txl，TaqDNA(5 U txl )聚合酶 l l，加水至
100 l。在 MJ公司 PTC．100型热循环仪上进行
PCR扩增。反应条件：预变性94℃5 min后，94"C变性
30 S，58℃退火 30 S，30个循环，72℃后延伸 120 S。扩
增后电泳检测并用 DNA电泳凝胶回收试剂盒回收
扩增产物。
PCR产物的克隆及序列分析 设计PCR引
物时两端加上了BamHI和EcoR I位点，因此，将纯
化的PCR产物用 BamH I和 I进行双酶切，然
后克隆到 pBluescript(KS)的 BamH I和 EcoR I位
点，转化大肠杆菌 XL．blue感受态细胞，在选择性培
养基上蓝白斑筛选，挑取阳性白色菌落进行 PCR鉴
定、酶切鉴定和测序鉴定(测序送往上海基康生物技
术有限公司，在 3700型测序仪上完成)。
表达质粒的构建 根据测序结果和原核表
达 载体pET32a(+)的酶切 位 点设计 引物TTGGA
TCCATGGCGTCCTCCGTTGACATG；TTGAA TTC
GATGATAAAGTTTAGACGGCAACC，将 CHS基
因克隆到表达载体 pET32a(+1的 BamH I和 EcoR I
位点，转化大肠杆菌 DE3感受态细胞，PCR筛选阳
性克隆。酶切鉴定得到重组克隆 pET．CHS。
表达产物的诱导及 SDS．PAGE胶分析 将
pET．CHS单菌落接种到 3 ml含氨苄青霉素的 LB
培养基中，于37。C培养过夜，取500 Ixl过夜培养液，
加到50 ml含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃
继续培养到OD枷为0．6，加 l mol／L的IPTG至终
浓度为 l mmol／L，20℃低温诱导培养，分别在诱导
2 h、4 h和 6 h时取 1．5 ml样品，离心收集菌体．菌
体 再悬 浮 于 100 Ixl缓 冲 液(5 mmol／L Tris．HC1，
10 mmol／L EDTA，pH8．0，50 mmol／L葡萄糖)，加等
体 积 的 2~SDSA 凝 胶 加 样 缓冲 液 ，l00℃ 煮沸
5 min，做 l2％的 SDS—PAGE胶分析。
2结果和讨论
2．1非洲菊总RNA的提取
紫外检测A瑚和A280，A 6o／A280为 1．9，l％琼脂糖
凝胶电泳、溴化乙啶染色，在紫外灯下显示，28S
rRNA的亮度大约是 l8S rRNA的2倍，说明提取的
总 RNA完整，没有发生降解 ，而且没有基因组
DNA污染(图 1)，可以用来进行 RT．PCR扩增。
图 l非洲菊总RNA凝胶电泳
Fig．1 Agarose gel electrophoretogram oftotal RNA
isolated from ray florets of Gerbera hybrida
l，2，3：分别代表3个重复 Total RNA ofthree repetitions
2．2 cDNA合成与 PCR扩增
以非洲菊花的总R_NA为模板，Oligo(dT)为引
物合成第一链 eDNA，用 CHSF和 CHSR引物进行
PCR扩增反应，得到 l 200 bps左右大小的片段f图
2)，与预测的长度相符。
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第 5期 谢修志等：非洲菊查尔酮合酶基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达 433
bp
2O00——
1O00——
750‘ ——
500—
250．．——
2 3
图2CH5基因 PCR产物凝胶电泳
Fig．2 Agarose gel electrophoretogram ofPCR product ofCHS
1．DNA分子量标准物 DL2000 marker；
2，3．CHS基因PCR产物PCRproductofCHS
2．3 PCR产物的克隆及序列分析
将纯化的 PCR产物用 BamH I和 EcoR I进行双
酶切，然后克隆到pBluescript(SK)的BamH I和 o
I位点，转化大肠杆菌 XL—blue感受态细胞，在选择性
培养基上蓝白斑筛选，得到多个阳性克隆，我们对其
中3个阳性克隆进行了酶切分析和序列测定分析，我
们克隆到的CHS基因全长为 1 197 bp，编码一个由
398个氨基酸残基组成的多肽，与Helariuta等 发表
的非洲菊(Gerbera hybrida)查尔酮合酶 CHS1基因的
eDNA序列的CHS基因同源性高达 99％。
bp
2313O
4361
2322
2027
图3阳性克隆pBluescript(SK)一CHS的酶切鉴定
Fig．3 Identifcation ofCHS fragment in pBluescript(SK)-CHS
1．DNA分子量标准物 kDNA／Hind II；2．质粒 pBluescript(SK1的
BamH YEcoR I的双酶切产物 Plasmid pBluescript(SK1 digested by
BamH c0R I；3，4，5．质粒 pBluescript(SK)-CHS的BamHI／＆0R I的
双酶切产物 Plasmid pBluescript(SK)-CHS digested by BamH I／EcoR I；
6．CHS基因的PCR扩增产物 PCR Product ofCHS amplification
2．4 表达质粒 的构建
将 CHS基 因克隆到表达载体 pET32a(+)的
BamH I和 o I位点，转化大肠杆菌 BL21(DE3)
感受态细胞，得到许多阳性克隆，PCR、酶切鉴定阳
性克隆，得到重组克隆pET—CHS，最后选取 3号重
组克隆pET—CHS进行表达。
2 3 4 5
bp
21226
3530
1375
947
564
图4重组克隆 pET—CHS的酶切鉴定
Fig．4 Identification of CHS fragm ent in pET—CHS
1，2，3．PCR扩增产物 PCRproduct；4．质粒 pBluescript(SK)-
CHS的BamH I／EcoR I的双酶切产物 Plasmid pET-CHS digested
by BamH I／EcoR I；5．DNA分子量标准物 kDNA／EcoR l+HindⅢ
2．5表达产物的检测
将含有空载体 PET32a(+．)和克隆质粒 pET．CHS
的大肠杆菌经过 IPTG诱导实现了高效表达，提取
总蛋白进行 SDS—PAGE分析，电泳结果显示出 CHS
基因融合表达的特异条带。CHS蛋白分子量的理论
值是 43 kD，pET—CHS融合蛋白分子量的理论值大
2 3 4 5 6 kD
97．4
66．2
43．0
31．O
2O．1
14．4
图5 CHS1基因在大肠杆菌中表达的SDS．PAGE电泳图
Fig．5 SDS-PAGE ofthe expressed l in E．coli
l，2，3．IPTG诱导2、4、6 h，含质粒 pET的大肠杆菌所表达的
总蛋 白Total proteins of E．coli with pET after IPTG induction for
2，4，6 hours；4，5，6．IPTG诱导 2、4、6 h，含质粒pET．CHS的大肠
杆菌所表达的总蛋白Total proteins ofE．coli with pET．CHS after
IPTG induction for 2，4，6 hours；7．蛋白质分子标准物 Protein
molecular weightmark~．
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434 热带亚热带植物学报 第 12卷
约为 65 kD，与电泳图中显示的结果符合，而且融合
蛋白的表达量随着表达时间的增加而增加。
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60
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《生态环境)TIJ号：ISSN 1672—2175；CN44一l565／X。原刊名为《土壤与环境》，是经国家科技部批准的正式学术期刊，向国内
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