全 文 ：鸳鸯茉莉(Brunfelsia acuminata)是茄科(Solan-
aceae)鸳鸯茉莉属常绿矮灌木，花多单生，有时数朵
组成聚伞花序[1]。鸳鸯茉莉具有极高的观赏价值，
初开时为紫色，后变为淡紫色，最后变为白色。由
于开花时间有先后，在同一植株上能同时看到不同
颜色的花，故又得名“双色茉莉”。
鸳鸯茉莉花瓣中的色素主要为花色素苷。花
色素苷作为黄酮的一种[2]，合成受到多个关键酶的
限制。查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)是黄
酮类代谢途径中第二步反应的催化酶，是增加黄酮
鸳鸯茉莉查尔酮异构酶基因(CHI)cDNA的克隆与
生物信息学分析
曹玉婷, 邱栋梁*
(福建农林大学园艺学院，福州 350002)
摘要： 采用 RT-PCR 与 RACE 技术克隆了鸳鸯茉莉(Brunfelsia acuminata)花瓣中查尔酮异构酶基因(CHI)的全长 cDNA，
GenBank 登录号为 JN887637。该基因全长 1051 bp，含有 1 个 792 bp 的开放阅读框，编码 263 个氨基酸，为不稳定蛋白。对保
守区功能区的分析，推导 CHI 蛋白具有查尔酮超级家族的保守结构域，二级结构预测显示其主要以 α 螺旋和 β 折叠为主。氨
基酸同源性分析表明，鸳鸯茉莉 CHI 蛋白与矮牵牛(Petunia hybrida)、金花茶(Camellia nitidissima)、甜樱桃(Prunus avium)、芍药
(Paeonia lactiflora)、牡丹(P. suffruticosa)、菊花(Chrysanthemum morifolium)等植物的同源性分别达到 90%、89%、84%、85%、
84%、80%。因此，CHI 基因可能与鸳鸯茉莉的花色形成有关。
关键词： 鸳鸯茉莉； 查尔酮异构酶； 基因克隆； 生物信息学
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2012.05.008
Cloning and Sequence Analysis of Chalcone Isomerase Gene (CHI)
from Brunfelsia acuminata Flowers
CAO Yu-ting, QIU Dong-liang*
(College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China)
Abstract: The chalcone isomerase gene (CHI) cDNA from Brunfelsia acuminata flowers was cloned by RT-
PCR and RACE, with GenBank accession number JN887637. The full length cDNA of CHI was 1051 bp with an
open reading frame (ORF) of 792 bp, encoding an unstable protein with 263 amino acids. CHI protein from B.
acuminata flower has conserved domain belonging to chalcone superfamily. It was predicted that the secondary
structure of CHI protein dominated by α-coil and β-sheet. The amino acid sequence of CHI from B. acuminata
flowers had homologous to those from Petunia hybrida, Camellia nitidissima, Prunus avium, Paeonia lactiflora, P.
suffruticosa, Chrysanthemum morifolium for 90%, 89%, 84%, 85%, 84% and 80%, respectively. It suggested that
CHI gene related to flower color formation of B. acuminata.
Key words: Brunfelsia acuminata; Chalcone isomerase; Gene clone; Bioinformatics
热带亚热带植物学报　2012， 20(5)： 475~481
Journal of Tropical and Subtropical Botany
收稿日期： 2011–11–20　　　　接受日期： 2012–02–13
基金项目： 福建省自然科学基金项目(2011J01082)资助
作者简介： 曹玉婷(1987~ )，女，硕士生，研究方向为植物生理与分子生物学。E-mail: caoyt87@163.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: qiudl1970@yahoo.com.cn
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醇产物的关键酶之一[3]，它催化查尔酮形成二氢黄
酮，查尔酮由第一步查尔酮合成酶(CHS)催化一个
香豆酰辅酶 A 和三个丙二酰辅酶 A 而形成。
目前，查尔酮异构酶基因在许多植物中已经被
克隆，而鸳鸯茉莉的相关研究鲜见报道。本文通过
RT-PCR 和 RACE 技术，克隆得到鸳鸯茉莉查尔酮
异构酶基因(CHI)的全长 cDNA，对其序列和编码
的蛋白质进行生物信息学分析，以期为鸳鸯茉莉花
色形成的分子机制研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
试验材料鸳鸯茉莉(Brunfelsia acuminata)取自
福建农林大学校内绿化带。采集待开放的花瓣，洗
净后用液氮速冻，–80℃冰箱中保存备用。
多糖多酚植物总 RNA 快速提取试剂盒购于
百 泰 克 生 物 技 术(北 京)有 限 公 司；Ex TaqTM 酶，
dNTP，DEPC-H2O，DNA Marker DL2000、X-gal、
IPTG、cDNA 合 成 试 剂 盒 Super SMARTTM PCR
cDNA Synthesis Kit 购 于 Clontech 公 司；cDNA 第
一链合成试剂盒购于 Fermentas 公司；胶回收试剂
盒购于大连宝生物有限公司(Takara)；胰蛋白胨、酵
母提取物购于 OXOID 公司；琼脂糖购于 MDBio 公
司；大肠杆菌(Escherichia coli)感受态 DH5α 购于天
根生化科技(北京)有限公司；其他常规试剂均为国
产分析纯和超纯试剂。
1.2 总RNA提取
称取 100 mg 花瓣，按照百泰克多糖多酚植物
总 RNA 快速提取试剂盒实验操作步骤进行 RNA
制备，制备好的总 RNA 最终溶解于 30 μL DEPC-
H2O 中。
1.3 CHI基因的克隆
参 照 Fermentas 公 司 的 Revert AidTM First
Strand cDNA Synthesis 试 剂 盒，合 成 cDNA 第 一
链。根据 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中
报道的植物 CHI 基因同源性较高的核苷酸序列，
设计保守区简并引物 CHI-conF: 5′-GTSAGAGGB-
HTGGARATYSAAGG-3′ 和 CHI-conR: 5′-GGDGA-
MACDCCWTKYTYCCCDAT-3′，反 应 程 序 为：
94℃ 5 min；94℃ 40 s；51℃ 40 s；72℃ 60 s；35 个循
环；4℃保存。经 1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，将目
的片段回收与 pMD18-T 载体连接，经热激法转化
到大肠杆菌 DH5α 中，用蓝白斑筛选重组子，挑选
阳性克隆的单菌落 37℃培养 12 h，经菌液验证后选
择(2 个以上)扩增出与目的片段一致的条带送上海
博尚生物技术有限公司进行测序。
参照 SMARTTM RACE cDNA Amplification 试剂
盒 说 明 书 合 成 3′RACE 和 5′RACE 的 模 板 cDNA。
并 根 据 测 序 结 果 设 计 3′RACE 特 异 引 物 GSP-
218: 5′-GGAGAAGGTGGCGGAGAATT-3′ 和 GSP-
395: 5′-AGACGATTCGGTAGCTGGCT-3′ 与 UPM:
5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGT-
GGTATCAACGCAGAGT-3′，按照 Advantage® 2 PCR
Kit 说明书进行第一轮和第二轮扩增，对扩增产
物 进 行 测 序，获 得 CHI 基 因 cDNA 的 3′ 末 端
序 列；同 样 设 计 5′RACE 特 异 引 物 GSP-175: 5′-
GTAAATTTCTCAAACGGACC-3′ 和 GSP-46: 5′-
TCGCCGTGAACTTAACAAAC-3′ 与 UPM 进行第
一轮和第二轮扩增，获得 5′ 末端序列。
根据所得的拼接序列在起始密码子和终止密
码 子 附 近 设 计 特 异 引 物 FPF: 5′-ATGTCTCCAT-
TAGTGTCCGTTACTC-3′ 和 FPR: 5′-GTGTCCTA-
ACTAGCCTTTAATTTCTGG-3′，进 行 PCR 扩 增，
得到鸳鸯茉莉 CHI 基因的开放阅读框(ORF)。
1.4 生物信息学分析
测序结果在 GenBank 中进行 Blast 分析。利
用 在 线 软 件 Protparam (http://www.expasy.org)预
测所编码蛋白的分子量和等电点等。蛋白质二
级 结 构 利 用 软 件 Antheprot 6.0 进 行 分 析，利 用
SWISS-MODEL 进行蛋白质三级结构建模。采用
DNAMAN 6.0、ClustalX 1.8 和 MEGA 5.0 软件进
行多序列比对及系统进化分析。
2 结果和分析
2.1 CHI基因cDNA的克隆
利用一对简并引物 CHI-conF 和 CHI-conR 进
行保守区扩增，以逆转录合成的 cDNA 为模板，产
物经琼脂糖凝胶电泳，可见 1 条约 500 bp 的条带
(图 1)，经回收测序，得到一段 494 bp 的 cDNA 序
列，经 过 DNAMAN 6.0 软 件 和 Blast (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/blast)程序分析，该序列为 CHI 基
因 cDNA 的同源片段。
利 用 3′RACE 特 异 引 物 GSP-218 和 GSP-395
第5期 477
与接头引物 UPM，以 3′-cDNA 为模板，进行 PCR
扩增，经过第二轮 PCR 得到一条约 500 bp 的条带，
经回收测序，得到一段长度为 521 bp 的 cDNA 序
列，该片段包含 1 个 16 bp 的多聚腺苷酸 (polyA)尾，
并有 99 bp 与保守区序列重叠。
利用 5′RACE 特异引物 GSP-175 和 GSP-46 与
接头引物 UPM，以 5′-cDNA 为模板，进行 PCR 扩
增，经过第二轮 PCR 得到一条约 300 bp 的条带，经
回收测序，得到一段长度为 306 bp 的 cDNA 序列，
该片段有 176 bp 与保守区序列重叠。
2.2 CHI基因核苷酸序列分析
将 得 到 的 3 个 片 段 进 行 拼 接 整 合，获 得
1051 bp 的 CHI 基因全长序列(图 2)，GenBank 登
图1 鸳鸯茉莉CHI基因的PCR扩增。M: DNA Marker; 1: 保守区; 2: 3′RACE; 3: 5′RACE; 4: 全长cDNA。
Fig. 1 PCR of CHI from Brunfelsia acuminata. M: DNA Marker; 1: Conservative region; 2: 3′RACE; 3: 5′RACE; 4: Full length cDNA.
图2 CHI基因的cDNA序列及推导的氨基酸序列。ATG : 起始密码子; TAG : 终止密码子; AATAA : 加尾信号。
Fig. 2 Full length of nucleotide and deduced amino acid sequence of CHI. ATG : Start codon; TAG : Stop condon; AATAA : Polyadenylation signal.
曹玉婷等：鸳鸯茉莉查尔酮异构酶基因(CHI) cDNA的克隆与生物信息学分析
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录号为 JN887637。该 cDNA 序列包含 1 个 792 bp
的完整开放阅读框，与以 CHI 基因 cDNA 第一链
为模板，利用引物 FPF 和 FPR 扩增该基因的 ORF
的长度相同，并且经DNAMAN 6.0比对后序列相同。
通过与 GenBank 中其他植物的 CHI 基因进行
Blast 比较，结果表明，鸳鸯茉莉与矮牵牛(Petunia
hybrida: Y00852.1)、金 花 茶(Camellia nitidissima:
HQ269805.1)、甜樱桃(Prunus avium: GU990525.1)、
杜 鹃 花(Rhododendron pulchrum: AB289600.1)、牡
丹(Paeonia suffruticosa: JN105297.1)、芍药(Paeonia
lactiflora: JN119872.1)、菊花(Chrysanthemum morifo-
lium: JF834891.1)的同源性分别达到 83%、76%、
73%、75%、73%、72%、71%。
2.3 CHI蛋白质结构分析
通过 Protparam 软件对鸳鸯茉莉 CHI 蛋白进
行在线分析，结果表明，792 bp 的 CHI 基因 ORF
核苷酸共编码 263 个氨基酸，推测 CHI 蛋白的分子
量和等电点分别为 28.54 kD 和 4.91，为不稳定蛋白。
利用 Antheprot 6.0 软件和 Garnier 算法对 CHI
蛋白的二级结构进行预测，结果表明，CHI 蛋白中
α-螺旋为 55%、β- 折叠为 28%、β- 转角为 5%、其
他松散结构为 13%。在 CHI 蛋白中，α-螺旋和 β-
折叠为最主要的结构元件，而 β-转角和松散结构则
散布于蛋白中。
将 CHI 基因编码的氨基酸序列提交 SWISS-
MODEL[4–6] 在线分析软件，预测蛋白质的三级结
构，预测结果表明，CHI 蛋白含有大量的 α-螺旋
和 β-折叠，与二级结构的预测结果相符(图 3)。由
图 3 可以看出，鸳鸯茉莉 CHI 蛋白的三级结构是由
一个大的 β-折叠和由 3 个短的 β-折叠形成的 α-螺
旋在大 β-折叠的背面形成一个核心区，CHI 蛋白
质呈现三明治状，CHI 蛋白的空间结构与 Jez[7]和
Micheal[8]的研究结果相符。
利用 ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)
分析程序的 Kyte and Doolittle 算法对鸳鸯茉莉查
尔酮异构酶蛋白进行亲水 / 疏水性分析。结果表明，
在 245~251 区域的亲水性最强，在 48~53 区域的疏
水性最强。由图 4 可见，查尔酮异构酶的亲水区域
大于疏水区域，所以该蛋白属于亲水蛋白。
图 4 CHI 的亲水性 / 疏水性分析
Fig. 4 Hydrophilicity/ Hydropholocity analysis of CHI protein from
Brunfelsia acuminata
2.4 CHI蛋白质同源性分析
将 CHI 基因编码的氨基酸序列进行 Blast 分
析，结果表明，CHI 推导的氨基酸序列与矮牵牛、
金花茶、甜樱桃、芍药、牡丹、菊花的同源性分别达
到 90%、89%、84%、85%、84%、80% (图 5)。
利 用 ClustalX 1.8 和 MAGA 5.0，对 目 前 已 经 克
隆的 CHI 基因推测的氨基酸序列进行比对，构建
Neighbor-Joining 系统进化树，并进行 Bootstrap 分
析。结果(图 6)表明，鸳鸯茉莉 CHI 蛋白与矮牵牛
与烟草归到同一分支上，与矮牵牛与烟草非常接
近。这与实验预期相符合，也在一定程度上说明了
克隆得到的基因为 CHI 基因。
2.5 CHI基因保守区预测与分析
将鸳鸯茉莉 CHI 基因编码的氨基酸序列提交
NCBI 的 Protein conserve domain (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)进 行 保 守 区 分
图 3 CHI 蛋白的三级结构预测
Fig. 3 Tertiary structure prediction of CHI
第5期 479
图5 不同植物CHI的氨基酸序列分析。矮牵牛: P11650.1; 金花茶: ADZ28513.1; 甜樱桃: ADZ54781.1; 芍药: AEK32592.1; 牡丹: AEK70330.1; 菊
花: AEP37358.1。
Fig. 5 Multiple alignment of predicted amino acid sequences of CHI from different plants. Petunia hybrida: P11650.1; Camellia nitidissima:
ADZ28513.1; Prunus avium: ADZ54781.1; Paeonia lactiflora: AEK32592.1; P. suffruticosa: AEK70330.1; Chrysanthemum morifolium: AEP37358.1.
析，结果表明，鸳鸯茉莉 CHI 蛋白质保守区域是属
于查尔酮超级家族区域。
3 讨论
查尔酮异构酶是类黄酮和异黄酮生物合成中
的关键酶，主要催化查尔酮(4,2′,4′,6′-四羟基查尔酮)
或 6′-脱氧查尔酮(4,2′,4′-三羟查尔酮)，发生分子内
环化形成 (2S)-黄烷酮(5,7,4′-三羟查尔酮) 或 (2S)-5-
脱氧黄烷酮(7,4-二羟查尔酮)[9]。
目前 CHI 基因已经在矮牵牛、大丽花、翠菊、
菊花、芍药、牡丹等多种花卉中得到克隆。CHI 基
因 cDNA 序列的同源性很低，一般只有 42%~65%，
即使在同一物种间的差异也比较大[10]，所以给同源
克隆造成了一定的难度。本实验运用 RT-PCR 和
RACE 技术克隆得到 CHI 基因的全长，说明只要设
计出合理的引物，同源性很低的物种也能克隆得到
全长。
从矮牵牛中克隆得到的两个查尔酮异构酶基
因 CHI-A 和 CHI-B，经研究表明，在植物的不同组
织中，这两个基因的表达具有特异性[11]。本文克隆
得到的 CHI 基因与矮牵牛 CHI-A 基因的同源性最
高，CHI-A基因在雄蕊和花冠中表达，CHI-B 基因
在未成熟的花药中表达[12]。
查尔酮异构酶基因在植物中表达量的多少，影
响黄酮类化合物在植物中的积累。目前，通过直接
改变 CHI 基因来改变花色的研究较少。但是，有
曹玉婷等：鸳鸯茉莉查尔酮异构酶基因(CHI) cDNA的克隆与生物信息学分析
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研究表明，洋葱(Allium cepa)查尔酮异构酶的失活，
其花的颜色变为金色[13]；将 CHI 基因与 CHS 基因、
DFR 基因同时转化至马铃薯(Solanum tuberosum)
中，使这些基因过量表达，提高了花色素苷等黄酮
类化合物的含量[14]；通过实时荧光定量 PCR (RQ-
PCR)对银杏(Ginkgo biloba)叶片进行分析，查尔酮
异构酶活性与 CHI 基因的转录水平和叶片中的黄
酮类物质的积累相关[15]；甘草(Glycyrrhiza uralensis)
的 根 毛 用 酵 母 提 取 物 和 PEG8000 处 理，以 提 高
CHI 基因的表达，结果甘草根毛中的类黄酮有明
显 增 加[16]；使 黄 岑(Scutellaria baicalensis)根 毛 部
的 CHI 基因沉默后，黄酮类物质的积累也随之减
少 [17]。这些研究在一定程度上说明了 CHI 基因的
表达量会影响到花的颜色变化。
本实验首次克隆了鸳鸯茉莉查尔酮异构酶基
因(CHI)的全长 cDNA，其长度为 1051 bp，包含 1
个 792 bp 的开放阅读框，共编码 263 个氨基酸，并
对其进行生物信息学分析，预测查尔酮异构酶的分
子量大小和等电点分别为 28.54 kD 和 4.91，为不稳
定的亲水蛋白；二级结构中以 α-螺旋和 β-折叠为
主，其保守结构域是属于查尔酮超级家族区域。应
用生物信息学方法对鸳鸯茉莉查尔酮异构酶基因
编码的蛋白质进行比对、分析，从而对其结构和功
能进行推断和预测，为该基因的功能研究提供科
学依据。
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