全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，14(1)：19—24
Journal ofTropical and Subtropical Botany
厚荚相思树根瘤菌 HJ06菌株的
16S rDNA全序列和n／fa基因片段分析
吕成群a，黄宝灵 ，庄培亮 ，武
(』‘。两大学，a林学院；b．卞命科学与技术学院，南宁 530005)
波b
摘要：对厚英相思∽cacia c icarp0)根瘤菌HJ06菌株的 16S rDNA全序列利n／fA基因片段进行了测定。结果表明，
HJ06菌株在以16S rDNA序列构建的系统发育树状 中位于根瘤菌属(Rhizobium)分支_{1， 根痛菌属各个种的相
似性达 95％以上；从 HJ06菌株克隆 的 585 bp n／fA基 片段与 Klebsiela pneumoniae的l 源性达到 99-3％，与
Klebsiela oxytoca的NifF，Ni正．NifA，NifB蛋白基因的I叫源性为 97．8％。
关键词：厚荑相思i根J留菌；16S rDNA全序列：系统发育：n 基因
中图分类号：Q523．8 文献标识码：A 文章编号：1005—3395(2006)01—0019—06
1 6S rDNA and n／fA Gene Sequence Analysis of Rhizobium
Strain HJ06 Isolated from A cacia crassicarpa
Lfl Cheng．qun ， HUANG Bao．1 i ng ， ZHUANG Pe i一1 i ang ， WU Bo
(a．Forestry Colege，Guangxi University；b．Colege of Life Science atd Technology，Guangxi University，Nanning 530005，China)
Abstract：The determination of ful-length 1 6S rDNA sequence and n／yA gene segments of root nodule bacterium
strain HJ06 isolated from A cacia crassicarpa showed that strain HJ06 had above 95％ similarity with the genus
Rhizobium The n／fA gene segments ofHJ06 have 99．3％isogenesis with n／fa genes ofKlebsiela pneumoniae and
97．8％ isogenesis with genes ofNifF，NifL，NifA and NifB proteins ofK．oxytoca．
Key words：Acacia crassicarpa；Rhizobium；16S rDNA sequencing；Phylogenetic analysis；n／fa gene
相思树是热带亚热带豆科树种，除台湾相思
外，其余大多从澳大利亚、马来西亚等地引入我国。
相思树种生长快、产量高，有根瘤、具固氮作用，可
改良土壤，木材用途广，在我国热带、南亚热带地区
越来越受到重视川，日前已逐渐发展成为华南地区
短周期工业用材林的当家树种之一_2J。因此，有必要
开展对相思树种根瘤菌的生物学特性研究。过去对
根瘤菌的研究大多集中在与农、I 关系密切的豆科
作物、牧草的共生体上，对大量的豆科树种根瘤菌
的研究相对较少【31。而有关厚荚卡甘思根瘤菌的 16S
rDNA全序列测定和分析、n／fA基因的研究目前尚
未见有报道。本文在前期研究工作的基础上，对该
树种根瘤菌的代表菌株HJ06的 16S rDNA全序列
和n／fa基 进行分析，以探讨厚荚相思根瘤菌的系
统发育学地位及 n／fa基因的问源性。
1材料和方法
1．1菌株
供试的根瘤菌菌株 HJ06分 离 自厚英相思
(Acacia crassicarpa A．cunn．ex Benth)根瘤，基因
克隆中的大肠杆菌菌株为 JM109，质粒载 体为
pGEM -3Zf。
收稿日期 ：2005—06—14 接受日期：2005—12—01
基金项目：广西科学基金项目(桂科娃 0448005)；广西 “十五”林业利学研宄项目(林科宁 2002第 19号)资助
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20 热带业热带植物学报
1．2根瘤菌 DNA提取
参照Wen&Tsong的快速提取法 提取根瘤菌
DNA。菌株用 YMA液体培养基在 28。C振荡培养至
对数牛长期，10 000xg离心收集菌体，用 l xTE
(10 mmol／L Tris—HC1， pH 7．6；l mmol／L EDTA，
pH 8．0)缓冲液洗涤 2次，用裂解液 (40 mmol／L
1 s-HCI，20 mmol／L NaAc，1 mmol／L EDTA，I％
SDS)破壁，再用 5 mmol／L NaC1沉淀，上清液用等
体币j{的苯酚、苯酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)、氯仿
各抽提 1次 。2倍 体积无 水 乙醇 、0．1倍 体积
3 mmol／L KAc沉淀，真卒干燥，最后溶于 lxTE缓
冲液中。
1．3 16S rDNA的扩增
引物分为正 向引物 F27(5 ．AGAGTTTGAT．
CATGGCTCAG．3’)和反向引物 R1492(5-TACG．
GTTACCTTGTTACGACTT．3 )。
PCR扩增总体积 100 l，其中：l0xPCRBufer
10 Ixl，2．5 mmol／L dNTP 8 l，10~mol／L引物 F27
5 l，10 p~mol／L引物 R1492 5 l，模板 DNA 100 ng，
5 U 酶 1 ILl，ddH2O补 总体积 100 l。
反应条件：95℃预变性 5 min，冉以96~C变性
30 S、55℃退火 45 S、72~C延伸 1．5 rain，30个循环，
72。C延伸 10 min。
1．4n泓 基因的扩增
PCR扩增 治 基因的正向引物 P1：5-ACGG．
TGCTGGTACGCGGC．3’，反 向引物 P2：5-TTCG—
CGCACGTTTCCCGG．3’。
PCR扩增总体积 25 l，其中：10xBufer 2．5 l，
2．5 mmol／L dNTP 2．0 l，10 pmol／L弓I物 P1 1．25 l，
10 pmol／L引物P2 1．25 l，模板DNA 100 ng，5 u
z 酶 0．2 l，ddH2O补至总体积 25 l。
反应条件；94~C预变性 6 rain，再以94℃变性
1 rain、58℃退火 50 s、72。C延伸 1 rain，35个循环 ，
72℃延伸 6rain。
1．5 DNA克隆及测序
电泳回收PCR产物，回收的DNA片段与载体
连接，用电脉冲法转化大肠杆菌 JM109，在加有
x．gal、Amp和IPTG的 LA抗性选择培养基平板上
选择白色转化子。挑取白色转化子，接种在加有
Am p(50 g ml。)的 l0 ml LB液体培养基中，置于
37~C摇床培养过夜。然后重新提取质粒，验证白色
第 l4卷
转化子是否含有 PCR扩增产物。提取质粒 DNA送
上海基康生物公司测序。
1．6 16S rDNA序列分析
将所测定的HJ06菌株的 16S rDNA全序列输
入生物技术信息网页htp：／www．ncbi．nlm．nib．gov／
进 行序 列分 析及 同源 性 比较 ，用 ClustalX 和
Treecovnw软件绘制系统发育树状 。序列相似性
所用参比菌株及相应的索取号来 自GenBank。
1．7 n／fA基因序列分析
将所测定的HJ06菌株的n／fa基因序列输入生
物技术信息网页 htp：／www．ncbi．nlm．nib．gov／进行
序 列分 析及 同源 性 比较 ，序 列相似 性所 用 参
比菌株来 自GenBank，索取号分别为：Klebsiela
pneumoniae(X13303)、K．pneumoniae(X02616)、
K．oxytoca(D00339)。
2结果和分析
2．1 16S rDNA PCR扩增及序列测定结果
菌株 HJ06 PCR扩增所得 1．5 kb左右的 16S
rDNA片段电泳柃测结果见罔 1，测定的全序列
(1 445 bp)结果见图2。
M 1 2 3
0 kb⋯⋯
3 0 kb———
750 bp ． ． ．——
图 l 16S rDNA扩增、连接及 EcoRI酶切结果
Fig．1 The result of 1 6S rDNA PCR 1ink and EcoR I enzyme digestion
M．1 kb Markers；1．16S rDNA扩 增 H 段 16S rDNA PCR
segment；2重纠质粒 Recombinant plasmid；3．重细体质粒 ／EcoR I
Recombinant plasmid／EcoR I．
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第1期 吕成群等：厚荚相思树根瘤菌HJ06菌株的 16S rDNA全序列和．／fa基凶片段分析 2l
1 AGAGTTTGAT CA丁GGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCAGGC TTAACACATG CAAGTCGAGC
6 1 GCCCCGCAAG GGGAGCGGCA GACGGGTGAG TAACGCGTGG GAATCTACCT TTTGCTACGG
1 21 AATAACGCAG GGAAACTTGT GCTAATACCG TATGTGTCCT TCGGGAGAAA GATTTATCGG
1 8 1 CAAGAGATGA GCCCGCGT TG GATTAGCTAG TTGGTGGGGT AAAGGCCTAC eAAGGCGACG
24 AACCATAGCT GGTCTGAGAG GATGATCAGC CACATTGGGA CT《≥AGACACG GCCCAAACTC
301 CTACGGGAGG CAGCAGTGGG GAATATTGGA CAATGGGCGC AAGCCTGATC CAGCCATGCC
36 1 GCGTGAGTGA TGAAGGCCCT AGGGTTGTAA AGCTCTTTCA CCGGAGAAGA TAATGACGGT
42 1 ATCCGGAGAA GAAGCCCCGG CTAACTTCGT GCCAGCAGCC GCGGTAATAC GAAGGGGGCT
48 1 AGCGTTGTTC GGAATTACTG GGCGTAAAGC GCACGTAGGC GGATCGATCA GTCAGGGG丁G
54 1 AAATCCCAGG GCTCAACCCT GGAACTGCCT TTGATACTGT eGATCTGGAG TATGGAAGAG
601 GGGAGTGGAA TTCCGAGTGT AGAGGTGAAA TTCGTATATA TTCGGAGGAA CACCAGTGGC
66 1 GAAGGCGGCT AACTGGTCCT TTTCTGACGC TGAGGTGeGG AAGCGTGGGG AGCAAAeAGG
72 1 ATTACATACC CTGGTAGTCC ACGCCGTAAA CGATGAATGT TAGCCGTCGG GCAGTATACT
78 t GTTGGGGGGC GCATTTAACG CATTAAACAT TCCGeeTGGG GAGTACGGTC GCAAGATTAA
841 AACTCAAAGG AAT下GAeGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT AATTCGAAGC
901 AACGCGCAAA ACCTTACCAG CCCTTGACAT CCTGTGTTAC CACTAGAGAT AGTTGGTCCA
96 1 CTTCGGTGGC GCAGAGACAG GTGCTGCATG GCTGTCGTCA GCTeGTGTeG TGAGATGTTG
1 021 GGTTAAGTCC CGeAACGAGC GCAACCCTCG CCCTTAGTTG CCAGCATTTA GTTGGGCACT
1 08 I CTAAGGGGAC TGCCGGTGAT AACCCGAGAG GAAGGTGGGG ATGACGTCAA GTCCTCATGG
1 I 41 CCCTTACGGG CTGGGCTACA CACGTGCTAC AATGGTGGTG ACAGTGGGCA GCGAGCAe6C
1 201 GAGTGTGAGe TAATCTCCAA AAGeCATeTC AGTTCGGACT GCAeTCTGCA ACTCGAGTGC
1 26t ATGAAGTTGG AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCATGCCG CGGTGAATAC GTTCCCGGGC
1 321 CTTGTACACA CCGCCCGTCA CAeCATGGGA GTTGGTTTTA CCCGAAGGTA GTGCGCTAAC
1 38 I CGCAAGGAGG CAGCTAACCA CGGTAGGGTC AGCGACTGGG GTGAAGTCG丁 AACAAGGTAA
1 441 CCGTA
2 HJ06 16S rDNA全序列
Fig．2 Full—length 1 6S rDNA sequence ofstrain HJ06
2．2 HJ06菌株 16S rDNA全序列的相似性和系统
发育
通过系统发育学分析得出各菌株问相似性及
系统发育树状罔 (图3)。从图 3中可以看出在系统
发育树-IJ土壤杆菌属 (Agrobacterium)与根瘤菌属
(Rhizobium)的不 同种在系统发育上 有交叉。
已知 的根瘤 菌 属 、种 隶属 丁 0l变 形杆 菌 纲
(A1phaproteobacteria)的6个属中，包括：根瘤菌属
(Rhizobium)，L}I华根瘤菌属 (Sinorhizobium)，中慢
牛 根瘤 菌 属 (Mesorhizobium)，慢 牛 根 瘤 菌 属
(Bradyrhizobium)，固氮根瘤菌属 (Azorhizobium)
和另类根瘤菌属 (Alorhizobium)[5J。本研究得 的
系统发育图基本与这 分类结果相符合，可以将根
瘤菌及上壤杆菌分成七个分支。菌株 HJ06位r十
壤杆菌属与根瘤菌属交义的这一分支中，并与 ．
genosp．、R．tropici和A grob~u：terium rhizogenes构成
一 个小分支。HJ06与Agrobacterium、Rhizobium』声；
各种的相似性分别为 98．72％(Rhizobium genosp．)、
98．32％ ． tropici)、 97．78％ (／1． rhizogenes)、
96．82％ ( ． 1eguminosarum)、 96．56％ (冗． etli)、
95．57％ ( ．g~dlicum)、95．42％ (冗．mongolense)、
95．33％( ．yanglingen．se)、95．05％( indigoferae)、
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热带业热带植物学报 第 14卷
3根 闲系统发f『恻 佚
¨B 3 Dcndrogl。㈣ 1(]r rlaizt~bi zd phylo~cn3
一
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第 1刘 吕成群等：厚荚相思树根瘤菌HJ06菌株的 16S rDNA全序列和n弘 基因片段分析 23
95．22％ (R．hainanense)、94．78％ ( ．albertimagni)、
93．52％ ( ．rubi)、92．35％ (R．undicola)、93．14％
( ．vitis)、94．14％ (R．huautlense)、 95．92％ (R．
giardinii)。
以16S rDNA序列的相似性为划分属的标准，
属内相似性不低于 95％t~，因此可以确定菌株 HJ06
为隶属于Rhizobium属的种。
中华根瘤 菌属 (Sinorhizobium)的 8个种 s．
medicae、S．meliloti、S．fredi、S．terangae、S．
saheli、S．kostiense、S．arboris、S．xinjiangensis构成
一 个分支。
Mesorhizobium amorphae、 M． huakuii、
medherraneum M．ciceri、M．1oti、M．chacoense、M．
tian~shanense 7种构成一个独立分支，形成叶】慢生根
瘤菌属。
4种慢生根瘤菌构成慢生根瘤菌属(Bradyrhi
zobium)分支，包括 B．genosp．、B．1iaoningense、B．
canariense、B．japonicum。
固氮根瘤菌属 zorhizobium)的A．caulinodans
构成一个独立分支。
最 近 的 研 究 发现 了第 四个 根 瘤 菌 分 支
4．0 kb———
3．0 kb—
1．5 kb ⋯
750 bp——
500 bp——
M l 2 3
图4．ifA基因的扩增、连接及 EcoRI酶切结果
Fig．4 The result ofn PCR，link and EcoR I enzyme digestion
M．1 kb marker；1．HJ06 DNA 扩 增 片段 HJ06 DNA PCR
segment；2．莺组质粒 Recombinant plasmid；3重组体质粒 ／EcoR I
Recombinant plasmid／EcoR I．
CTCACTATAG GGCl AATTGG GCCCGACGTC GCATGCTCCC GGCCGCCATG GCGGCCGCGG
C徂ATTCG TT ／TTCGCGCAC GTTTCCCGGC CAGCTGTACT CCATC．AGCAG GCGAGTCGCC
CCATCGCTGA TGCGCAGCGT TCGCCCCTGG CTGTGGGCGA TTTTTCGCAC CAGAAAIBTGC
GCCAGCTCGG CGATATCCTC CTGGCGCTCG CGcAGCGGCG GCAGCGCGAT AGGTATTACG
TTCAGGCGGT AGTATAGATC CTCGCGGAAA TGACCCAGCT GcACC丁CCTC TTCCAGATGG
CGGTTGGTCG CCGCGATAAT GCGCACGTTG ACCCGCAGGG TTTCG1ICGCC GCCGACGCGC
TCCATCTCCC CCTCTTGCAG AATACGCAGT AGCTTAGCCT GAAACGAGGC GCTGCTTTCG
CCGATCTCAT CGAGGAATAA GGTGCCGCCG TCCGCCAGCT C AGCGGCC TTTCCGCTGG
CTCACCGCGC CGGTAAACGC GCCTTTCTC．A TGACCAAACA GCTCGCTCTC CAGCAGGTTG
TCCGGCAGCG CCGCGCAGTT AAATTTGACG AACGCCGCGG CGGCGCGCGG AGAATTATGG
TGGATGGCGT TGGCGATGAG CTCTTTCCCG GTGCCGCTCT eGCCGCGTAC CAGCACCGT／
AATCACTAGT e TTCGCGG CCGCCTGCAG GTCGACCATA TGGGAGAGCT CCCAACGCGT
TGC徂TGCATA GCTTGAGTAT TCTATAGTGT C：ACCTAAA1-A GCTTGGCGTA ATCATGGTCA
TAGCTGTTTC CTGTGTGAAA TTGTTATCCG CTCACAATTC CACACAACAT ACGAGCCGGA
AGCATAAAGT GTAAAGCCTG GGGTGCCTAA TGAGTGAGCT AACTCACATT AATGGCGTGG
CGCTCACTGC CCGCTTTCCA GTCGGGAAAC CTGTCGTGC
图5 HJ06菌株 n 基因片段序列
Fig．5 Sequence ofHJ06 DNA segment
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24 热带亚热带植物学报
Protebacteria门 Ot．亚纲 Methylobacterium(甲基杆
菌属)系统发育分支，此分支新种 MethylobacteriUm
nodulans能利用甲醇生长，这在根瘤菌中是独 一无
二的_7J。
另类根瘤菌属 (Alorhizobium)仅 R．undicola
一 种 ，在系 统 发育 树 中处 于 土壤 杆 菌属
(Agrobacterium)与根瘤菌属 (Rhizobium)的交叉
分支中。
2．3 HJ06菌株n／ya基因片段PCR扩增结果和分析
从 HJ06菌株中扩增出585 bp芹有的 n／fA基
因PCR产物，电泳结果如图 4。 n／fA基冈 DNA片
段序列见图5。
用 BLAST程序对 HJ06的．,／fa基因片段 DNA
序列和 GenBank中己登录的n／fa基因 DNA序列
进行核苷酸同源性比较，结果发现 HJ06的n／Ja基
因片段 DNA 序列 分别 与 Klebsiela pneumoniae
(X13303)、Klebsiela pneumoniae(X02616)的同
源性达到 99．3％；与 Klebsiela oxytoca(D00339)的
NifF．NifL，NifA NifB蛋白基冈的 源性为 97．8％。
n 肇囚系指在结构和功能 与白生固氮的肺
炎克氏杆菌 (Klebsiela pneumoniae)的 20个 n 基
因具有同源性的基因。n／yA基因作为同氦墓囚的
调节基因，已经从 10多种固氮微生物巾克隆 来
并完成了序列测定嘲，但厚荚相思根瘤菌的 n／fa
因克隆和序列测定尚属首次。
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