全 文 ：肌动蛋白(Actin)是构成细胞骨架的主要成分，
普遍存在于真核生物中，对于生物的形态、组织结
构和生长起着重要作用[1–2]。同时，植物肌动蛋白
还与信号转导、细胞器运动和定位、细胞分裂、细
胞形状、细胞壁的沉积、细胞伸长、顶端生长、生长
素的极性运输等生命活动有关[3–7]，甚至还与雄蕊
花粉的不育和自交不亲和有关[8–10]。目前，在拟南
芥(Arabidopsis thaliana)、水 稻(Oryza sativa)、杨 树
(Populus trichocarpa)、棉花(Gossypium hirsutum)、茶
树(Camellia sinensis)[11]、花生(Arachis hypogaea)[12]、
木薯(Manihot esculenta)[13]以及蚊子(Anopheles gam-
biae)[14]和 对 虾(Penaeus vannamei)[15]中 均 报 道 存
收稿日期： 2013–07–31　　　　接受日期： 2013–11–23
基金项目： 广东省林业科技创新专项基金项目(2011KJCX019)； 桉树生态经营及产业升级关键技术研究项目(201104003)； 湛江市科技计划项
　目(2013A03016)； 湛江市科技计划项目(2012C02139)资助
作者简介： 陈鸿鹏(1979 ~ )，男，博士，助理研究员，主要从事林业生物技术和植物资源应用等方面的研究。E-mail: chenhognpeng007@126.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail：xieyj@21cn.com
热带亚热带植物学报　2014， 22(3)： 242 ~ 249
Journal of Tropical and Subtropical Botany
赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析
陈鸿鹏1, 朱凤云2, 吴志华1, 谢耀坚1*
(1. 国家林业局桉树研究开发中心， 广东 湛江 524022； 2. 黄淮学院生物工程系， 河南 驻马店 463000)
摘要： 为了解赤桉(Eucalyptus camaldulensis)肌动蛋白(Actin)在生长发育过程中的功能，根据赤桉幼苗转录组数据库中的肌动
蛋白基因序列，从赤桉嫩叶中克隆了 2 条 Actin 基因片段，并利用 RACE 技术获得 Actin 基因的全长 cDNA，分别命名为 EC-
ACT1 和 EC-ACT2 基因。生物信息学分析表明，这两条基因的全长 cDNA 分别为 1533 bp 和 1387 bp，均含有 1 个编码 377 个
氨基酸的开放阅读框。经比对分析，赤桉 Actin 蛋白的氨基酸序列与其他植物 Actin 蛋白的具有较高的相似性，并且具有 Actin
蛋白特有的保守序列和相关特征。因此推测这两条基因对桉树的生长发育具有一定的调控作用。
关键词： 赤桉； Actin 基因； 克隆； 生物信息学分析
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2014.03.005
Cloning and Bioinformatics Analysis of ACT1 and ACT2 Genes from
Eucalyptus camaldulensis
CHEN Hong-peng1, ZHU Feng-yun2, WU Zhi-hua1, XIE Yao-jian1*
(1. China Eucalypt Research Center, Zhanjiang 524022, China; 2. Department of Biological Engineering, Huanghuai University, Zhumadian 463000,
China)
Abstract: In order to reveal the biological function of Actin in growth and development of Eucalyptus camaldulensis,
two fragments were cloned from the transcriptome database of E. camaldulensis seedlings at different developmental
stages, named as EC-ACT1 and EC-ACT2, and their full-length cDNA were obtained by RACE method. Bioin-
formatics analysis showed that the full-length cDNA of EC-ACT1 and EC-ACT2 were 1533 bp and 1387 bp,
respectively, and both with 1131 bp ORF encoding 377 amino acids. The amino acid sequence of Actin in E.
camaldulensis had high similarity to those of other plants with typical conserved domains of Actin. Therefore, the
EC-ACT1 and EC-ACT2 genes might play a role in regulating growth and development of E. camaldulensis.
Key words: Eucalyptus camaldulensis; Actin; Clone; Bioinformatics analysis
第3期 243
在肌动蛋白基因，并且多数以基因家族的形式存
在[16–17]。此外，由于肌动蛋白基因表达稳定，在植
物中分布较广，肌动蛋白基因常作为内参基因以衡
量其他基因的表达情况。
桉 树(Eucalyptus sp.)是 重 要 的 用 材、能 源 树
种，用途广泛，经济效益高，为工业发展提供了高质
量的木质原材料，被近百个国家与地区引种，是世
界公认的三大人工林树种之一。本实验室为研究
桉树的生长发育特点，构建了不同发育时期的赤
桉幼苗转录组数据库，并从中获得了一条与 Actin
基因高度同源的基因片段。在此基础上，本研究
采 用 RT-PCR 结 合 RACE 技 术 对 赤 桉(Eucalyptus
camaldulensis)的肌动蛋白基因进行了克隆和生物
信息学分析，为揭示桉树的生长机理和其他相关调
控基因提供理论参考。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
本 研 究 选 用 赤 桉(Eucalyptus camaldulensis
Dehnh)幼苗的嫩叶为材料，采自国家林业局桉树研
究开发中心南方种苗基地，于液氮中保存备用。
Prime-star 高保真酶购自 TaKaRa 公司；感受态
细胞为大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α、dNTPs、
DNase、DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒 等 购 自 Ambio 公
司；cDNA Synthesis Kit 购 自 Thermo 公 司；100 bp
plus DNA Ladder、DNase、Total RNA Purification
System、5′ RACE 以 及 3′ RACE 试 剂 盒 等 购 自
Invitrogen 公司；pEASY-Blunt Simple 载体购自北京
全式金公司；其它生化试剂和常规试剂，如 DEPC、
H2O、Tris、EDTA、无水乙醇、EB、巯基乙醇等均
为分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司。
生物信息学分析软件主要有 Vector NI 11.0、
GENDOC、GeneTree、Chromas、Primer Premier 5.0、
Anthprot 5.0、ClustalX 2.0 以及 MEGA 4.0 等。
1.2 赤桉叶片总RNA的提取与cDNA合成
赤 桉 嫩 叶 在 液 氮 中 研 磨 成 粉 末 状，参 照
Invitrogen 公司试剂盒的操作说明书进行总 RNA
的提取，经电泳检测后，用 cDNA Synthesis Kit 试
剂 盒 将 总 RNA 分 别 反 转 录 成 cDNA、5′ RACE
cDNA 和 3′ RACE cDNA，于 –20℃下保存备用。
1.3 Actin基因保守区片段的克隆
Actin 蛋白是一种在进化上比较保守的蛋白，
尤其是功能性区域，通过将转录组数据库中的 EC-
ACT 基 因 片 段 编 码 的 氨 基 酸 序 列 与 NCBI 数 据
库中 Actin 蛋白的氨基酸序列进行分析和比对，
Actin 蛋白保守区的序列为：PIYEGYALPHAILRL-
DLAGRDLT 和 GIHETTYNSIMKCDVDIRKDLYG-
NIVLSGG。根据保守区序列设计引物：EC-ACT F1
(5′-GTTCCCATTTACGAAGGCTACGCCCT-3′)和
EC-ACT R1 (5′-GTCTTTGCAGTTTCCAACTCCT-
GT-3′)。
以赤桉嫩叶 cDNA 为模板，以 EC-ACT F1 和
EC-ACT R1 为引物对保守区进行 PCR 扩增。PCR
反应体系总体积为 50 μL，包含 0.5 μL Prime-star 聚
合酶(5 U μL–1)，5.0 μL 10 × PCR buffer (含 Mg2+)，
4.0 μL dNTPs (各 2.5 mmol L–1)，2.0 μL cDNA，
1.0 μL EC-ACT F1 (10 μmol L–1)，1.0 μL EC-ACT
R1 (10 μmol L–1)，31.5 μL ddH2O。PCR 扩增条件：
98℃预变性 5 min；然后 98℃变性 10 s，62℃退火
30 s，72℃延伸 1 min，共 5 个循环；98℃变性 10 s，
60℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 5 个循环；98℃
变性 10 s，58℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 25
个循环；最后 72℃延伸 5 min。在 4℃下保温。反
应结束后，对产物进行回收、克隆和测序。
1.4 Actin基因RACE片段的克隆
根据获得的基因片段的序列信息，通过 Primer
Premier 5.0 分别设计了 EC-ACT 基因的 5′ RACE
和 3′ RACE 引物(表 1)，由上海铂尚生物公司合成
并通过 PAGE 方式进行纯化。
以 赤 桉 嫩 叶 5′ RACE cDNA 为 模 板，以 5′
RACE 的引物(5GSP 1、5GSP 3)与 UPM 为引物进
行巢式 PCR 扩增，反应体系同上。以第一轮 PCR
的产物为模板，用 5GSP 2、5GSP 4 与 UPM 进行巢
式第二轮 PCR。RACE 产物经 1.2% 的琼脂糖凝胶
电泳检测，回收目的片段进行克隆，挑选阳性克隆
进行测序。
3′ RACE 扩 增 与 5′ RACE 类 似，以 3′ RACE
cDNA 为 模 板，反 应 体 系 同 上，分 别 用 AUAP 和
3GSP 1、3GSP 3、3GSP 5，以及 AUAP 和 3GSP 2、
3GSP 4、3GSP 6 为引物进行两轮巢式 PCR 扩增。
PCR 扩增条件为：98℃预变性 5 min；然后 98℃变
性 10 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 35 个
陈鸿鹏等：赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析
244 第22卷热带亚热带植物学报
循环；最后 72℃延伸 5 min；于 4℃下保温。RACE
产物经 1.2% 的琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片
段进行克隆，挑选阳性克隆进行测序。
1.5 EC-ACT基因的生物信息学分析
对 EC-ACT 基因保守区片段、5′ 端和 3′ 端序
列进行拼接，获得 EC-ACT 基因的全长 cDNA，通
过网上资源和生物信息学软件对基因的开放阅读
框(ORF)、功能以及其他特性进行分析和预测。
2 结果和分析
2.1 总RNA的提取
总 RNA 提取后，取 3 µL 的 RNA 样品进行琼
脂糖水平电泳检测，采用凝胶成像系统观察 RNA
条带的清晰度和完整性。由图 1 可以看出，赤桉嫩
叶中所提取的总 RNA 效果较好，其电泳条带清晰
整齐，无拖尾，而且 28S 条带的亮度约为 18S 的两
倍。 经 NanoDrop2000 检 测，OD260/OD280 的 比 值
为 1.95，OD260/OD230 的比值为 2.20，说明所获得的
RNA 具有较高的纯度和完整性，可以用于后续试
验。
2.2 EC-ACT基因保守区片段的克隆和测序
以反转录的 cDNA 为模板，用 EC-ACT F1 和
EC-ACT R1 为引物进行 PCR 扩增，得到 1 条长度
约为 400 bp 的片段(图 2)。将此片段进行回收、克
隆和测序。经由 Vector NTI 11.0 和 NCBI BLAST
进行比对分析，确认此片段是 Actin 基因的保守区
部分片段。
表 1 EC-ACT 基因的 RACE 特异引物
Table 1 RACE primers for EC-ACT genes
基因 Gene 编号 No. 序列 Sequence
5′ RACE EC-ACT 1 5GSP 1 5′-CAGCTGAACTTGTCTTTGCAGTTTCCA-3′
5GSP 2 5′-GTAGTGAAAGAATAGCCACGCTCA-3′
EC-ACT 2 5GSP 3 5′-GCAGAGCTAGACTTGGCTGTCTCCA-3′
5GSP 4 5′-GGATCTTCATCAAATGATCAGTGA-3′
UPM 5-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3
5-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3
3′ RACE EC-ACT 1 3GSP 1 5′-GAGCGTGGCTATTCTTTCACTACCACT-3′
3GSP 2 5′-CTGCAAAGACAAGTTCAGCTGTTGA-3′
EC-ACT 2 3GSP 3 5′-CTCACTGATCATTTGATGAAGATCCTCA-3′
3GSP 4 5′-GCTGGCTTACATTGCCCTTGACTA-3′
AUAP 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′
图 1 赤桉总 RNA 的电泳图谱
Fig. 1 Electrophoretogram of total RNA of Eucalyptus camaldulensis
图 2 EC-ACT 基因保守区片段的 PCR 扩增。M: DNA 分子标记。
Fig. 2 PCR amplification of EC-ACT conserved fragment. M: DNA
marker.
第3期 245
以 5′ RACE cDNA 为模板，用 5′ RACE 引物和
UPM 为引物进行 PCR 扩增。PCR 产物经 1.2% 的
琼脂糖凝胶检测，获得了条带清晰特异，大小分别
为 700 bp 和 650 bp 左右的条带(图 3)。同样，利用 3′
RACE cDNA 为模板，用 3′ RACE 引物和 UPM 为
引物进行 PCR 扩增。PCR 产物经 1.2% 的琼脂糖
凝胶电泳检测，获得了条带清晰特异，大小分别为
490 bp 和 470 bp 左右的条带(图 4)。
图 3 5′ RACE PCR 产物。M: DNA 分子标记 ; A: EC-ACT 1; B: EC-
ACT 2。
Fig. 3 PCR production of 5′ RACE. M: DNA marker; A: EC-ACT 1; B:
EC-ACT 2.
图 4 3′ RACE PCR 产物。M: DNA 分子标记 ; A: EC-ACT 1; B: EC-
ACT 2。
Fig. 4 PCR production of 3′ RACE. M: DNA marker; A: EC-ACT 1; B:
EC-ACT 2.
2.4 生物信息学分析
2.4.1 EC-ACT 基因的全长 cDNA 序列分析
去 除 5′ RACE 和 3′ RACE 片 段 中 的 载 体 序
列部分，与保守区片段进行拼接，分别获得了 EC-
ACT1 和 EC-ACT2 基因的全长 cDNA。通过 Vector
NTI 11.0 软件分析，EC-ACT1 基因的 cDNA 全长
为 1533 bp，包括 5′ 端非编码区 88 bp、3′ 端非编码
区 311 bp 和 1 个长度为 1131 bp 的编码区，起始密
码子为 ATG，终止密码子为 TAA，推测其开放阅读
框编码 377 个氨基酸。EC-ACT2 基因的 cDNA 全
长为 1387 bp，包括 5′ 端非编码区 53 bp、3′ 端非编
码区 200 bp 和 1 个长度为 1131 bp 的编码区，起始
密码子为 ATG，终止密码子为 TAA，推测其开放阅
读框编码 377 个氨基酸。
2.4.2 EC-ACT 蛋白的序列结构分析
应 用 Vector NTI 11.0 软 件 将 EC-ACT 基 因
的 ORF 翻译成氨基酸序列，并与其它不同来源的
Actin 蛋白进行比对(图 6)，结果表明赤桉的 Actin
蛋白与其他物种的 Actin 蛋白具有较高的同源性，
均达 90% 以上，由此可推测该基因是 Actin 基因。
Actin 氨基酸序列的 N 端和 C 端部分缺乏明显的
同源性，但中部的序列相对保守，EC-Actin 具有
和其他物种 Actin 特有的高度保守区：肌动蛋白
(Actin)的特征信号序列 YVGDEAQSKRG (55 ~ 65)
和 WISKGEYDE (358 ~ 366)，以及肌动蛋白和肌动
蛋白类似蛋白(Actin and Actin-like protein)的特征
序列 LLTEAPLNPKANR (106 ~ 118)。
2.4.3 分子系统进化聚类分析
为探讨 EC-ACT 基因与其他植物同类基因的
亲缘关系和可能的作用方式，应用 Clustal X 2.0
和 MEGA 4.0 软件对该基因编码的氨基酸与柠条
锦 鸡 儿(Caragana korshinskii)、欧 洲 草 莓(Fragaria
vesca)、大豆(Glycine max)等物种的 Actin 氨基酸序
列进行比对。结果表明(图 7)，Actin 是一种在进
化上非常保守的蛋白质，整个进化树的遗传距离为
0.02 ~ 0.0133，种间遗传距离为 0.020 ~ 0.0104；大
豆 和 绿 豆(Vigna radiata)的 Actin 同 EC-Actin 2 聚
为一类，之后再与 EC-Actin 1 聚在一起。同时 EC-
Actin 1 位于系统进化树的前端，处于较原始的地
位；EC-Actin 2 位于系统进化树的最后面，处于最
进化的地位，这与它们序列上的差异有一定的关
系。
2.4.4 EC-Actin 的理化特性分析
运 用 生 物 软 件 Antheprot 5.0 和 网 上 数 据
库 资 源 对 EC-Acin 蛋 白 质 进 行 理 化 性 质 的 分
析 和 预 测。 结 果 表 明，EC-Acin 1 的 分 子 式 为
陈鸿鹏等：赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析
246 第22卷热带亚热带植物学报
图 6 EC-Actin 与其它植物 Actin 的氨基酸序列的比较。CK: 柠条锦鸡儿； FV: 欧洲草莓； GM: 大豆； JC: 麻疯树； LE: 番茄； PT: 杨树； RC: 蓖麻；
VR: 绿豆。
Fig. 6 Alignment of amino acid sequences of EC-Actin and Actins from other plants. CK: Caragana korshinskii; FV: Fragaria vesca; GM: Glycine
max; JC: Jatropha curcas; LE: Lycopersicum esculentum; PT: Populus trichocarpa; RC: Ricinus communis; VR: Vigna radiate.
图 7 EC-Actin 与其他植物 Actin 的系统进化树
Fig. 7 Phylogenetic tree of EC-Actin and Actins from other plants
第3期 247
C1851H2919N491O561S21，分子量约为 41.70 kDa，理论等
电点 5.155。其中正电荷氨基酸残基数目为 38，负
电荷氨基酸残基数目为 50，蛋白质不稳定系数为
36.12，亲水指数为 –0.175，属于一种亲水性的稳定
蛋白质。
EC-Acin 2 的 分 子 式 为 C1852H2917N493O561S21，
分子量约为 41.74 kDa，理论等电点 5.225。其中
正电荷氨基酸残基数目为 38，负电荷氨基酸残基
数目为 50，蛋白质不稳定系数为 35.38，亲水指数
为 –0.192，属于一种亲水性的稳定蛋白质。
利用 Softberry (http://linux1.softberry.com/berry.
phtml)在线工具对 EC-Actin 1 和 EC-Actin 2 的亚
细胞定位进行预测，结果表明这两种蛋白质主要定
位于细胞质中(表 2)，这与其在细胞质中发挥作用
相一致。
通过 Antheprot 5.0 软件分析表明 , EC-Actin 1
和 EC-Actin 2 蛋白不具备明显的跨膜区(图 8)，说
明 EC-Actin 蛋白不是膜结合蛋白，这与 EC-Actin 1
表 2 EC-Actin 蛋白的亚细胞定位预测
Table 2 Sub-cellular localization of EC-Actin proteins
目的蛋白 Target protein 定位 Location 同源性 Homology 理论 Theory 神经性 Nerve 相似性 Similar 综合 Integration
EC-Actin 1 细胞质 Cytoplasm 10.00 3.00 2.58 5.11 9.89
EC-Actin 2 细胞质 Cytoplasm 10.00 3.00 2.59 5.19 9.95
图 8 EC-Actin 跨膜结构域的预测。A: EC-Actin 1; B: EC-Actin 2。
Fig. 8 Prediction of transmembrane domain in EC-Actin. A: EC-Actin 1; B: EC-Actin 2.
陈鸿鹏等：赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析
图 9 EC-Actin 的三维立体结构图。绿色： α-螺旋； 黄色： β-折叠； 青色： 转角。
Fig. 9 Theoretical 3D structure of EC-Actin. Green: α-Helix; Yellow: β-Sheet; Cyan: Turn.
248 第22卷热带亚热带植物学报
和 EC-Actin 2 蛋白在细胞质中行使功能的特点相
符合。
采用 Antheprot 5.0 和 SingalP 软件(http://www.
cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽的预测，结
果表明在 EC-Actin 1 的氨基酸序列中，原始剪切位
点的最高分值(C score)在第 22 个氨基酸位置上，分
值为 0.121，综合剪切点分值(Y score)在第 22 个氨
基酸处最大，只有 0.107，信号肽最大分值(S score)
在第 57 个氨基酸位置上，为 0.114，第 1 ~ 21 个氨
基酸的平均 S score 为 0.094，因此推断 EC-Actin 1
蛋白没有明显的信号肽剪切位点，为非分泌性蛋
白。
同理，在 EC-Actin 2 的氨基酸序列中，原始剪
切位点的最高分值(C score)在第 22 个氨基酸位
置，分值为 0.122，综合剪切点分值(Y score)在第 22
个氨基酸处最大，只有 0.106，信号肽最大分值(S
score)在第 57 个氨基酸位置，为 0.115，第 1 ~ 21 个
氨基酸的平均 S score 为 0.092，因此推断 EC-Actin
2 蛋白没有明显的信号肽剪切位点，也是非分泌性
蛋白。
采 用 Swissmodel Server 和 VMD1.8.5 软 件 进
行分析，EC-Actin 1 和 EC-Actin 2 经过多次折叠后，
结构非常相似，形成了具有活性催化功能的三维立
体结构(图 9)，并且主要以 α- 螺旋和 β- 折叠为主，
其间由转角等结构连接起来。三维立体结构中形
成了 1 个 ADP-Mg2+ 结合区以及酪氨酸磷酸化位
点(LAR)，从而使 Actin 蛋白在细胞运动、细胞生长
以及信号转导等方面具有关键的活性功能。
3 讨论
肌动蛋白作为一种重要的结构蛋白，广泛存在
于生物的各种组织细胞中，并参与许多重要的生命
活动。高等植物的肌动蛋白一般由 375 ~ 377 个
氨基酸组成，具有高度的保守性和同源性，这与肌
动蛋白作为细胞骨架的保守功能是一致的，也表明
Actin 作为看家基因在植物生命活动过程中起着非
常重要的作用[18]。
高等植物的 Actin 基因也是一个包含有多种
类型的基因家族，现已发现拟南芥、棉花、杨树、水
稻 等 植 物 中 分 别 有 15 个、20 个、22 个 和 18 个
Actin 基因[17–20]。本研究通过构建不同发育时期的
赤桉幼苗的转录组数据库，并克隆了两条 Actin 基
因，其编码的蛋白由 377 个氨基酸构成。生物信息
学分析表明 EC-Actin 1 和 EC-Actin 2 蛋白与其他
植物的 Actin 蛋白具有高度的保守性和同源性，也
具有 ADP-Mg2+ 结合区和 LAR 等活性位点，能够
在一定浓度 Mg2+ 存在的条件下聚合成微丝，从而
参与细胞骨架的构成，维持细胞形态以及其他的细
胞活动。所以，本研究所获得的基因为 Actin 基因，
对于桉树的生长发育可能具有一定的调控作用。
在后续的研究中，我们将继续克隆和分析 Actin 基
因家族中其它的成员，并系统研究他们所属的类
型，以及这些基因的功能和在桉树生长发育中的作
用。此外，Actin 基因作为一种重要的内参基因，
还可以用来分析和研究其他基因的定量表达情况。
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陈鸿鹏等：赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析