全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期，2009 年 6 月 567
收稿 2009-03-13 修定 　2009-04-23
资助 国家自然科学基金(30 6 71 2 4 8)。
* 通讯作者(E-mail : wbshenh@nja u.edu.cn; Tel: 0 25-
8 4 3 9 6 5 4 2 )。
外源一氧化碳对小麦幼苗耐盐性以及根中脯氨酸含量的影响
袁星星, 王娟, 谢彦杰, 沈文飚 *
南京农业大学生命科学学院, 南京 210095
提要: 小麦幼苗经饱和度为50%的一氧化碳(CO)溶液预处理24 h可以缓解随后以200 mmol·L-1 NaCl处理所导致的小麦幼
苗生长的受抑程度和相对含水量的下降。CO预处理还可有效提高盐胁迫下小麦幼苗根中吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)活
性及其基因的表达, 同时抑制脯氨酸脱氢酶(ProDH)活性, 从而诱导脯氨酸的大量合成, 缓解盐胁迫对小麦幼苗的伤害。
关键词: 盐胁迫; 小麦; 一氧化碳; 脯氨酸
Effects of Carbon Monoxide on Salt Tolerance and Proline Content of Roots in
Wheat Seedling
YUAN Xing-Xing, WANG Juan, XIE Yan-Jie, SHEN Wen-Biao*
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: In present study, we discovered that wheat seedlings subjected to 50% CO aqueous solution pre-
treatment for 24 h, led to a significant reversal in dry weight and water loss caused by 200 mmol·L-1 NaCl
treatment. Further analysis showed that CO pretreatment apparently up-regulated Δ1-pyrroline-5-carboxylate
synthetase (P5CS) activity and its related transcripts, and inhibited proline dehydrogenase (ProDH) activity,
thus resulting in the increase of proline content and the alleviation of salinity-induced damage in the root tissues.
Key words: salt stress; wheat (Triticum aestivum); carbon monoxide; proline
在动物体内, 一氧化碳(carbon monoxide, CO)
是一种内源气体信号分子(Verma等1993; Dulak和
Jόzkowicz 2003), 其生理作用与一氧化氮(nitric
oxide, NO)有类似之处。例如, CO 也可以结合可
溶性鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase, GC, EC 4.6.1.
2)蛋白中的血红素铁原子, 并激活 GC 从而提高细
胞内环鸟苷酸(cyclic guanosine monophosphate,
cGMP)的含量。此外, CO 还可能增强 NO 介导的
GC 活化作用(Dulak 和 Jόzkowicz 2003)。1997 年,
Thom等发现, 11~110 nmol·L-1 CO可以渐进方式提
高内皮细胞中 NO 的释放。另一方面, 早在 1959
年Wilks就已发现植物发育进程中有释放CO的现
象。后来 Siegel 等(1962)又报道, 萌发的黑麦、豌
豆、黄瓜和莴苣的种子都可以释放 10~25 μL·L-1
(CO), 而且上述过程并不依赖于光和叶绿素。最
近我们的研究还发现, 150 mmol·L-1 NaCl也能引起
小麦幼苗根部组织中 CO 释放(Xie 等 2008)。
一般来说, 植物盐害包括离子毒害、渗透胁
迫和营养不平衡三个方面。植物耐盐性主要涉及
3个方面, 即维持细胞内稳态(包括离子和渗透两个
方面)、解毒(抗氧化防护等)和生长调节(细胞分裂
和伸展等) (Zhu 2001, 2003)。例如, 作为植物在盐
胁迫下的渗透调节物质之一的脯氨酸不仅可以维持
细胞的膨压, 防止质膜透性增大, 从而保护质膜的
完整性, 而且还能稳定细胞质中酶分子的活性结构,
保护其不受盐离子的直接伤害。正常情况下, 脯氨
酸含量往往很低, 在盐胁迫等逆境条件下才大量合
成, 吡咯啉 -5- 羧酸合成酶(Δ1-pyrroline-5-carboxy-
late synthetase, P5CS, EC 2.7.2.11)和脯氨酸脱氢酶
(proline dehydrogenase, ProDH, EC 1.5.99.8)是控制
脯氨酸合成和降解的关键酶(Yoshiba 和 Kiyosue
1997)。
Xie 等(2008)报道, 150 mmol·L-1 NaCl 胁迫下
的小麦幼苗采用饱和度为50%的CO溶液处理后其
耐盐性明显提高。并认为 CO 的这种保护效应可
能与其上调小麦幼苗根部的抗氧化防护系统和维持
离子稳态有关。胡冰等(2008)也发现CO的供体高
铁血红素可以削弱200 mmol·L-1 NaCl所导致的小麦
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幼苗根部生长受抑程度, 维持根部的离子稳态。但
CO提高小麦耐盐性是否与其对渗透调节起作用有
关还不太清楚。本文以小麦品种 ‘扬麦 158’为材
料, 研究了外源 CO 预处理对盐胁迫下小麦幼苗根
中脯氨酸累积及其代谢酶活性或基因表达的影响。
材料与方法
采用浓硫酸与甲酸共热制备 CO 气体[H2SO4
(液)+ HCOOH (液)→CO (气)+ H2SO4·H2O (液)], 得
到的气体持续通入盛有 Hoagland培养液的玻璃烧
杯中 15 min, 以确保溶液达到饱和, 然后立即用
Hoagland培养液稀释至实验所需要的浓度(50%饱
和度) (Xie 等 2008)。
植物材料为小麦(Triticum aestivum L.)品种
‘ 扬麦 158’。种子用2%NaClO 消毒 5 min 后, 用
蒸馏水漂洗后转入 25 ℃暗处催芽培养 1 d。挑取
大小一致的露白种子移入光照培养箱中培养(光照
强度约为300 μmol·m-2·s-1, 光暗周期为12 h/12 h, 温
度为 25 ℃/18 ℃), 用 Hoagland溶液培养长至两叶
一心期进行各种处理。处理有: (1)对照, 一直用
Hoagland溶液培养(Con → Con); (2)小麦幼苗用含
50%饱和度CO的Hoagland溶液中预处理1 d后, 转
入 Hoagland 溶液中培养(CO → Con); (3)小麦幼苗
用 Hoagland溶液培养 1 d后, 转入含有 200 mmol·L-1
NaCl的Hoagland溶液中培养(Con→S); (4)小麦幼
苗用含 50% 饱和度 CO 的 Hoagland溶液中预处理
1 d后, 转入含有 200 mmol·L-1 NaCl 的 Hoagland溶
液中继续培养(CO → S)。为保持药剂浓度每天更
换处理液, 各处理均重复 3 次。
小麦的总生物量和相对含水量(RWC)的测定
参照Xie等(2008)文中方法, 用干重(DW)表示小麦
的总生物量。处理 3 d 后, 取 30 株各个处理的苗
并分成地上和地下部, 75 ℃下烘至恒重后称重。
脯氨酸含量测定参照 Ruan 等(2004)文中方法。
P5CS 活性测定参照赵福庚和刘友良(2000)文中方
法, 以 0.5ΔA435·g-1(FW)·h-1 为一个酶活力单位(U);
ProDH 活性测定参照赵福庚等(2002)文中方法, 以
0. 01ΔA600·g-1(FW)·min-1 为一个酶活力单位(U)。
总 RNA的提取和半定量 RT-PCR 按照 Trizol
Reagent (Invitrogen, Gaithersburg, MD)说明书, 提
取各个不同处理的幼苗根部组织总 RNA。cDNA
第一条链的合成反应体系为: 20 μL 体系、5 μg
RNA 样品、2.5 U AMV 反转录酶(Takara)、1
μmol.L-1 Oligo-dT 引物。cDNA 在-20 ℃中保存
备用。PCR 反应: 20 μL 体系, cDNA 稀释 2 倍后
取 2 μL, 各个引物终浓度为 10 pmol.L-1, 1 U Taq聚
合酶(Takara); 反应循环参数: 预变性 94 ℃ 5 min;
94 ℃ 35 s, 47~54 ℃ 30 s, 72 ℃ 60 s, 25~35个循环;
72 ℃延伸 5 min。引物设计如下: P5CS (GenBank
登录号为 AF022914)上游引物 5 AGTTGTTATT-
TATGGTGGG 3, 下游引物5 CTCTGAATCGGGT-
GCTGGC 3 (扩增片段长度为 472 bp); 18s rRNA
( G e n b a n k 登录号为 A J 2 7 2 1 8 1 )上游引物 5
CAAGCCATCGCTCTGGATACATT 3, 下游引物5
CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC 3 (扩增片段长度
为 658 bp)。以 18s rRNA 的相对含量作为内参。
在扩增26个循环和25~35个循环后, 10 μL 18s rRNA
和P5CS的扩增产物用1.2% (W/V)琼脂糖凝胶电泳,
再经溴化乙锭染色后检测, 并克隆测序验证。采用
Quantity One 软件对 P5CS 基因相对表达进行定量
条带分析, 为便于比较起见, 还设定对照(Con →
Con)表达量为 1。
数据是至少3次独立实验结果的平均值, 选择
Tukey’s 测验做显著性分析, 不同的字母表示差异
达到 P<0.05 水平。
结果与讨论
1 外源CO对小麦幼苗耐盐性的影响
与不作处理的对照(Con → Con)相比, 小麦幼
苗受 200 mmol.L-1 NaCl胁迫后(Con→ S)生长明显
受抑制并产生倒伏现象; 而以50%饱和度的CO溶
液预处理(CO → S)后上述现象则显著得到缓解(P<
0.05), 例如维持了较高水平的地上部和地下部的干
重以及相对含水量, 小麦幼苗的耐盐性也得到了提
高(图 1 和表 1)。
2 外源CO对小麦幼苗根部脯氨酸含量的影响
50% 饱和度的 CO 溶液预处理 24 h 可有效提
高小麦幼苗根中的脯氨酸含量(P<0.05) (图 2)。盐
胁迫处理(Con→ S)后 48 h之内脯氨酸含量呈现逐
渐上升趋势, 48 h 与 72 h 之间相对比较稳定。而
50% 饱和度的 CO 溶液预处理 24 h 后转入 200
mmol·L-1 NaCl 胁迫条件下(CO → S)之后又进一步
提高。这与已有报道中以 NO 供体硝普钠和盐胁
迫共处理的结果(Ruan 等 2004)类似。
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3 外源CO对P5CS活性和转录本表达以及ProDH
活性的影响
小麦幼苗根部经外源 CO 溶液预处理 24 h 后
转入 200 mmol.L-1 NaCl 胁迫条件下(CO → S) 12 h
后的 P5CS 活性比盐胁迫条件下(Con→ S)的高(P<
0.05, 图 3-a), P5CS 基因表达也较强(图 4), 48 h 的
PSCS 活性达到最大值, 72 h 时的其活性与 48 h 的
相对比较稳定。另一方面, 200 mmol.L-1 NaCl (Con
→S)明显抑制小麦幼苗根中ProDH活性, 并且随着
时间进程而加剧(图 3-b)。与盐胁迫下的(Con→S)
相比, 50%饱和度的CO溶液预处理的ProDH活性
明显受抑制(P<0.05)。据此, 可以推测, 这可能是
50%饱和度的CO溶液预处理诱导小麦幼苗根中脯
氨酸迅速累积(图 2)的直接原因之一。
另外, Xie 等(2008)曾报道, 外源NO的清除剂
和合成抑制剂可阻断CO诱导的小麦幼苗耐盐性的
图 1 CO 溶液预处理对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响
Fig.1 Effects of CO solution pretreatment on the growth of wheat seedlings under salt stress
比例尺为 1 0 cm。
表 1 CO 溶液预处理对盐胁迫下小麦幼苗的干重和相对含水量的影响
Table 1 Effects of CO solution pretreatment on the dry weight and relative water content of wheat seedlings under salt stress
　处理
小麦幼苗地上部 　　小麦幼苗地下部
干重 /g.(30 株)-1 相对含水量 /% 干重 /g·(30 株)-1 相对含水量 /%
Con → Con 3.45±0.015a 86.8±1.0a 0.264±0.006a 82.2±0.5a
CO → Con 3.38±0.003a 85.6±0.9a 0.248±0.015a 80.6±0.7a
Con → S 2.49±0.003c 72.4±0.6c 0.180±0.003c 67.2±0.9b
CO→ S 3.18±0.012b 83.9±1.1b 0.237±0.019b 79.3±1.0a
不同小写字母表示差异达到 P<0.05 水平。下图同此。
图 2 CO 溶液预处理对盐胁迫下小麦幼苗根中
脯氨酸含量的影响
Fig.2 Effect of CO solution pretreatment on proline content
of wheat seedling roots under salt stress
植物生理学通讯 第 45 卷 第 6 期，2009 年 6 月570
图 4 CO 溶液预处理对盐胁迫下的小麦幼苗
根中 P5CS 基因表达的影响
Fig.4 Effect of CO solution pretreatment on the express of
P5CS gene in wheat seedling roots under salt
提高, 并且 CO 能诱导 NO 的迸发, 因此他们推测
NO很可能是CO提高植物耐盐性信号途径下游中
的一个组分。Ruan等(2004)也报道, 低浓度 NO可
激活脯氨酸合成酶 P 5 C S 的活性而抑制降解酶
ProDH的活性, 从而诱导盐胁迫下小麦幼苗叶中脯
氨酸的累积, 并认为这可能是NO改善植物耐盐性
的原因之一。由此看来, 在 CO诱导小麦幼苗根中
脯氨酸积累, 并进而提高其耐盐性的过程中, 是否
也有 NO 信号的参与, 值得进一步研究。
参考文献
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图 3 CO 溶液预处理对盐胁迫下小麦幼苗根中 P5CS 和 ProDH 活性的影响
Fig.3 Effects of CO solution pretreatment on the activities of P5CS and
ProDH in wheat seedling roots