全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (2): 167~174 167
收稿 2010-11-22　　修定 2011-01-06
资助 国家高技术研究发展计划(863)项目(2008AA02Z103)、国
家自然科学基金(30671332)和浙江省自然科学基金重点项
目(Z304432)。
* 通讯作者(E-mail: huangrz2001@yahoo.com.cn; Tel: 0571-
86404249)。
油菜BnrbcS基因超表达提高拟南芥种子重量和含油量
吴学龙, 刘智宏, 袁思玮, 黄锐之*
浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所, 浙江省植物代谢基因工程试验基地, 杭州 310021
摘要: 为深入分析光合作用关键酶二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亚基在油菜等“绿色种子”发育过程中的作用, 采用RT-
PCR技术从油菜种胚中克隆了一个含Rubisco小亚基全长编码区的cDNA序列 , 命名为BnrbcS (GenBank登录号
DQ242646)。BnrbcS编码181个氨基酸残基, 其推导的氨基酸序列中包含典型的Rubisco小亚基功能域并与其他高等植物
Rubisco小亚基具有很高的同源性, 暗示BnrbcS基因产物与拟南芥等植物的Rubisco小亚基在结构和功能上可能十分相似。
除了在叶、子叶、角果皮等光合器官中有很高表达外, BnrbcS在贮藏物质高速积累时期的未成熟油菜种子中亦有中等水
平的表达, 且其“钟型”表达模式与一些脂肪酸合成酶系基因的表达模式相类似。将NAPIN启动子驱动的BnrbcS种子特异
超表达结构转入拟南芥, 转化株系的种子含油量和种子重量有一定程度提高, 显示BnrbcS在调控种子油脂等贮藏物质积累
过程中具有作用。
关键词: BnrbcS; 油菜; 拟南芥; 种子重量; 含油量
Seed-Specific Overexpression of BnrbcS from Oilseed Increases Seed Weight
and Oil Content in Arabidopsis thaliana
WU Xue-Long, LIU Zhi-Hong, YUAN Si-Wei, HUANG Rui-Zhi*
Key Laboratory of Plant Metabolic Engineering of Zhejiang Province, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy
of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
Abstract: Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco), which catalyzes the first step of CO2
fixation, is the key photosynthetic enzyme. Yet the role of Rubisco small subunit in fatty acid biosynthesis and
lipid accumulation in oilseeds still remains to be elucidated. To further evaluate the role of Rubisco small sub-
unit during seed filling, a cDNA putative encoding the Rubisco small subunit gene BnrbcS was isolated from
Brassica napus. BnrbcS (GenBank accession no. DQ242646) encoded a polypeptide of 181 amino acids with a
typical domain of the small subunit of Rubisco (amino acids 66–175). Alignments of amino acid sequences
show BnrbcS shares high homologies with other plant rbcS, revealing its evolutionary conservation. RT-PCR
analysis indicated that BnrbcS was preferentially expressed in photosynthetic organs such as leaves and cotyle-
dons. BnrbcS was also expectedly expressed in developing seeds at moderate levels, which indicated its func-
tion in this tissue. The expression of BnrbcS during seed development exhibited a bell-shaped profile and simi-
lar to the temporal pattern of genes encoding core fatty acid synthesis enzymes. Furthermore, overexpression of
the BnrbcS in a seed-specific manner in wild type Arabidopsis resulted in enhanced seed oil and average seed
weight. Thus, the current study suggested a possible function of BnrbcS in augment the lipid content and yield.
Key words: BnrbcS; Brassica napus; Arabidopsis thaliana; seed weight; oil content
油菜、大豆、拟南芥等植物种子发育的一定
时期呈绿色, 因而被称为“绿色种子”。虽然这类绿
色种子总体上仍是异养的库组织, 但它们的叶绿
体拥有类囊体结构并具有与叶片相同的叶绿素蛋
白复合体(Ruuska等2004), 因此这些绿色种子仍具
有一定的光合固碳能力(Eastmond等1996; Goffman
等2005)。但与叶片相比, 种胚中的叶绿体类囊体
中基粒垛叠的比例更高, 光合固碳能力也明显较
低(Asokanthan等1997)。这些结果显示, 种胚叶绿
体可能具有与叶片叶绿体不同的其他功能。
Rubisco是植物光合作用中的关键酶, 油菜、
拟南芥种子发育过程中, 在转录水平和蛋白质水
植物生理学报168
平都能检测到Rubisco小亚基基因的表达(White等
2000; Ruuska等2004; Hajduch等2006; Niu等
2009)。种胚光合能力的峰值与种子油脂快速积累
时期相契合(Molina等2008), Ruuska等(2004)对拟
南芥种子发育过程基因表达的芯片分析结果显示
Rubisco小亚基基因的“钟型”表达模式(bell-shaped
profile)与一些脂肪酸合成酶系的基因表达模式类
似。Schwender等(2004)发现Rubisco在油菜种子中
参与一种新的生物化学通道, Rubisco可独立于Cal-
vin循环发挥作用, 使脂肪酸合成过程中产生的CO2
得以再循环。该代谢通道相对于糖酵解而言使碳
源转化为酰基-CoA的效率提高20%、释放的CO2
减少40%, Rubisco的这一功能使油菜等绿色种子
更为高效的将碳源转化成脂肪酸, 同时产生更少
的CO2。
上述研究揭示了Rubisco在 “绿色种子”油脂
等贮藏物质积累中的重要作用, 那么, 是否有可能
通过对Rubisco基因的表达调控来提高植物种子产
量和含油量? 高等植物的Rubisco全酶是由8个叶
绿体基因组编码的大亚基和8个核基因组编码的
小亚基所构成, 小亚基跨膜运输进入叶绿体基质
与大亚基组装成有活性的Rubisco全酶(陈根云等
1998; Yong等2006)。该酶的活化位点及底物结合
位点均位于大亚基上, 小亚基主要起调节作用, 能
促进CO2与Mg
2+对酶的活化, 维持和稳定酶的活化
构象, 影响催化效率和CO2/O2特异性(Genkov和
Spreitzer 2009)。Rubisco大、小亚基的表达受多种
机制的协同调控(Winter和Feierabend 1990; Roder-
mel等1996; Houtz等2008; Genkov和Spreitzer
2009)。这种复杂的调控机制一定程度上使修饰与
改造Rubisco以提高CO2同化效率成为植物基因工
程中最富于挑战性的研究之一(陈根云2002), 同时
也为通过对Rubisco小亚基的表达调控提高Rubis-
co活性、进而提高作物产量和品质提供了理论依
据。
本研究从油菜种胚中克隆了含Rubisco小亚基
全长编码区的cDNA序列BnrbcS, 对其表达特性进
行了初步的分析, 将BnrbcS种子特异超表达结构转
入模式植物拟南芥, 提高了转化植株的种子重量
和含油量, 显示了BnrbcS表达调控在油料作物产量
和品质性状基因工程改良中的潜力。
材料与方法
1 植物材料
为含油量超过50%的双低、高油甘蓝型油菜
品系‘HO1’ (Brassica napus L. car. HO1), 由浙江省
农业科学院病毒学与生物技术研究所选育, 为田
间正常生长材料。生长发育期油菜种子取样方法
为: 在油菜盛花期某一天选择长势均匀的植株, 对
当天开的花进行标记。在开花后各个时期分别取
油菜荚果, 冰上取出油菜种子, 分装后-80°C冰箱
保存, 用于提取RNA。拟南芥(Arabidopsis thali-
ana)野生型为哥伦比亚生态型(Col 0), 生长在人工
培养室中, 光周期为16 h光照、8 h黑暗, 培养室温
度为22 °C, 湿度为60%。
2 菌株
本研究所用大肠杆菌(E.coli) DH5α、根癌农
杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105和种子
特异表达植物转化载体pNAPIN-FGC由本实验室
保存, pNAPIN-FGC中的种子特异表达启动子为
NAPIN启动子(谭小力等2005, GenBank登录号为
AF420598)。
3 油菜种胚表达Rubisco小亚基基因全长编码区
cDNA序列克隆
以拟南芥Rubisco小亚基基因mRNA全长序列
对GenBank中EST数据库和Brassica DB (http://
brassica.bbsrc.ac.uk/BrassicaDB)进行Blast分析, 获
得多条甘蓝型油菜和其他芸薹属植物与拟南芥
Rubisco小亚基基因具有较高同源性的mRNA和
DNA序列, 在此基础上设计引物对BnrbcSF (5′-
CATGGCTTACTCTATGCTCTCC-3′)和BnrbcSR
(5′-CATGGCTTACTCTATGCTCTCC-3′), 以开花后
20天的油菜未成熟种子cDNA为模板进行PCR扩
增。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成,
总RNA采用TRIZOL (Invitrogen)试剂法提取, 具体
操作按公司说明书。反转录用M-MLV逆转录酶
(Promega)进行。PCR产物连接到pMD18-T载体
(TaKaRa)后转化大肠杆菌(E. coli) DH5α感受态, 转
化克隆用BnrbcSF和BnrbcSR引物对PCR验证, 挑
取3个检测阳性克隆交上海生工生物工程技术服
务有限公司进行测序 , 获得中间载体 p M D -
BnrbcS。克隆的基因所编码的蛋白质分子量、等
电点等基本性质用Compute p I /MW (h t tp : / /
吴学龙等: 油菜BnrbcS基因超表达提高拟南芥种子重量和含油量 169
cn.expasy.org/tools/)预测。信号肽、蛋白质亚细胞
定位和功能域分别采用SignalP 3.0 (http://www.
cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、chlorop v1.1 (http://
www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/)和Motif Scan
(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)程序分
析。序列同源性比对采用ClustalW (http://www.
ebi.ac.uk/Tools/clustalw/)程序。
4 BnrbcS种子特异超表达载体构建
以本实验室自行构建的带NAPIN启动子的通
用种子特异表达植物转化载体pNAPIN-FGC为起
始载体, 该载体带有bar植物筛选标记。以pMD-
BnrbcS质粒为模板, 用引物对BnrbcSF2 (5′ CA-
CAGGATCCATGGCTTACTCTATGCTCTCC 3′)和
BnrbcSR2 (5′ CACAGGATCCATGGCTTACTC-
TATGCTCTCC 3′)进行PCR扩增, PCR条件为: 94
℃预变性5 min; 94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 50 s, 共
30个循环; 最后72 ℃延伸10 min。获得5′和3′-端均
带有BamHI酶切位点的BnrbcS基因全长编码区片
段, PCR产物用BamHI酶切, 与经BamHI酶切和脱
磷处理的pNAPIN-FGC载体连接, 构建成NAPIN启
动子驱动的BnrbcS基因植物表达载体pNAPIN::
BnrbcS, 用于植物转化。
5 拟南芥转化及筛选
拟南芥转化采用花序浸渍法(Clough和Bent
1998), 用Basta抗性筛选和PCR鉴定转基因植株, 拟
南芥Basta抗性筛选采用李志邈等(2005)方法, 拟南
芥基因组DNA的提取采用Kasajima等(2004)方
法。PCR检测所用引物对为napinF (5′ GATCGC
CATGCAAATCTC 3′)和BnrbcSR, 其中引物napinF
对应于pNAPIN::BnrbcS载体中NAPIN启动子中的
部分序列, PCR扩增条件为: 94 ℃预变性5 min; 94
℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共30个循环; 最后
72 ℃延伸10 min。
6 BnrbcS表达分析
BnrbcS在油菜中的表达谱分析: 将油菜不同
组织器官和不同发育时期的未成熟种子总RNA以
Oligo (dT)18为引物用M-MLV逆转录酶反转录成
cDNA, 用actin2引物(Broun等2004) Actin2F (5′
AGAGATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC 3′)
和Actin2R (5′ AACGATTCCTCCACCTG CCT-
CATCATACTC 3′)对各cDNA样品进行PCR扩增,
将cDNA样品浓度均一化。然后用引物对BnrbcSF
和BnrbcSR对各样品进行RT-PCR扩增, 每个基因
重复3次。
BnrbcS在拟南芥转化植株中的表达分析: 用
于表达分析的是2个纯合、独立遗传的pNAPIN::
BnrbcS拟南芥转化株系, 以Col 0野生型为对照。分
别收取各株系开花后7~12 d的荚果, 提取总RNA后
反转录成cDNA, 用actin2引物对进行PCR扩增后,
将cDNA样品浓度均一化。用引物对BnrbcSF和
BnrbcSR进行半定量RT-PCR, 分析各样品总Rubisco
小亚基表达水平。为检测BnrbcS在拟南芥转化植
株中的表达情况, 选择BnrbcS与拟南芥Rubisco小
亚基基因同源性最低的区域设计反向引物Bnrbc-
SR3 (5′ ACCAAAGGGAAAAGAAACAGA 3′)与引
物BnrbcSF配对进行RT-PCR, 扩增条件为: 94 ℃预
变性5 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共30
个循环; 72 ℃延伸10 min。各引物对重复扩增3
次。
7 拟南芥转化株系种子性状分析
拟南芥野生型和10个pNAPIN::BnrbcS T3代纯
合转化株系用于种子重量和含油量分析。每株系
各10个单株混合收获种子, 野生型和各转化株系
均设置3个重复。含油量采用索氏抽提法测定。
种子重量分析为每一样品数200粒种子后称重, 重
复测定3次取平均值。种子的形态采用荧光体视
镜(莱卡Leica M165FC)观察。
结果与讨论
1 甘蓝型油菜种子表达Rubisco小亚基基因BnrbcS
全长cDNA克隆及其序列分析
Niu等(2009)的结果显示开花后17~21 d是油
菜种子向库器官转化的关键时期, 本研究以开花
后20 d的未成熟油菜种子cDNA为模板, 采用RT-
PCR方法扩增获得了约670 bp的单一条带, 与预期
的cDNA片段大小一致, 克隆测序后证明与拟南芥
Rubisco小亚基的核苷酸序列同源性达89%, 并覆
盖了Rubisco小亚基基因编码区全长cDNA, 将其命
名为BnrbcS (Brassica napus chloroplast ribulose-1,
5-bisphosphate), 并提交GenBank数据库, 登录号为
DQ242646。
BnrbcS全长671 bp, 编码区长度为543 bp, 编
植物生理学报170
码181个氨基酸残基, 该蛋白质的理论分子量为
20.26 kDa, 等电点为8.23。BnrbcS包含有典型的
Rubisco小亚基保守域(66~175位氨基酸, 图1-A),
因此可以推断, BnrbcS编码了一个Rubisco小亚
基。Blast分析结果表明, BnrbcS与GenBank中登录
的其他植物的Rubisco小亚基序列也高度同源(表1,
图1-B), 特别是与同属十字花科的拟南芥(Arabi-
dopsis thaliana)和萝卜(Raphanus sativus)的Rubisco
小亚基序列同源性高达93%, 即使与水稻(Oryza
sativa)、玉米(Zea mays)等单子叶植物Rubisco小亚
基的序列同源性也超过了60%。这种序列上的相
似性, 显示了Rubisco小亚基在进化上的高度保守,
也暗示了油菜BnrbcS基因产物与拟南芥等植物
Rubisco小亚基在结构和功能上可能十分相似。
2 BnrbcS基因产物亚细胞定位预测和RNA表达特
性分析
核编码的质体定位蛋白质按其是否具有可被
剪切的信号肽而分成两类(Keegstra和Cline 1999),
在大多数情况下, 核编码的叶绿体定位蛋白质在
其N-端具有可剪切的信号肽(Lee等2008), 拟南芥
Rubisco小亚基信号肽中的多个功能域独立地控制
依赖于叶绿体外膜易位子(translocon at the outer
envelope membrane of chloroplasts, TOC) Toc159的
蛋白质向叶绿体的转运过程(Lee等2009)。采用
SignalP 3.0对BnrbcS编码的氨基酸序列分析, 发现
存在叶绿体定位信号肽。采用SignalP 3.0中隐马
尔可夫模型(Hidden Markov Model, HMM) 预测表
明BnrbcS存在信号肽的可信度为0.978; 其可能的
剪切位点位于N-端起第18和19位氨基酸之间(图
1-C), 可信度为0.912。采用Chlorop v1.1程序分析
的结果显示BnrbcS叶绿体定位的可信度为0.575。
生物信息学的分析结果进一步显示了BnrbcS虽然
克隆自种子这一贮藏器官, 但类似于植物其他光
合器官中的Rubisco小亚基, 其成熟肽可以在叶绿
体中行使生物学功能。
BnrbcS在叶、子叶等光合器官中表达最高,
在茎和角果皮表达也很强, 而在根、花等非绿色
器官的表达很弱(图2), 这种转录表达模式与拟南
芥(Arabidopsis thaliana)、马铃薯(Solanum tubero-
sum)、大豆(Glycine max)、矮牵牛(Petunia hybri-
da)等其他植物Rubisco小亚基总体相类似(Fluhr等
1986; Sugita和Gruissem 1987; Dedonder等1993; 贺
超英等2001)。BnrbcS在种子发育时期有表达, 并
在开花后23~26 d出现表达峰值, 其后表达水平迅
速下降, 到开花后32 d已检测不到BnrbcS的表达,
这种 “钟型 ”表达模式与拟南芥种子发育时期
Rubisco小亚基和脂肪酸合成酶系基因的表达模式
接近(Ruuska等2002)。在Niu等(2009)的研究中, 油
菜种子发育期Rubisco小亚基基因的表达峰值出现
在开花后25 d, 到开花后31 d虽有下降, 但表达水
平仍较高, 表达峰值出现时期较本研究略迟。Niu
等(2009)研究所用油菜品种‘沪油15’全生育期238
天左右, 而本研究所用油菜材料全生育期约为225
天, 种子发育进程也较‘沪油15’整体加速, 这可能
是导致本研究BnrbcS表达峰值出现时期较Niu等研
究提前的原因。
3 BnrbcS基因种子特异超表达可提高拟南芥种子
重量和含油量
Schwender等(2004)的研究显示Rubisco在油
菜种子将碳源高效转化成脂肪酸的过程中具有重
表1 BnrbcS与其他物种Rubisco小亚基氨基酸同源性比较
Table 1 Identity between the amino acid sequences of BnrbcS and other Rubisco small subunit proteins
序列 GenBank 登录号 物种 同源性/%
BnrbcS_rape ABB51649 甘蓝型油菜(Brassica napus) 100
ATS1B_At NP_198659 拟南芥(Arabidopsis thaliana) 93
RsrbcS_radish P08135 萝卜(Raphanus sativus) 93
GhrbcS_cotton P31333 棉花(Gossypium hirsutum) 79
GmrbcS_soybean AAG24882 大豆(Glycine max) 75
NtrbcS_tobacco AAP03874 烟草(Nicotiana tabacum) 68
ZmrbcS_Zm CAA70416 玉米(Zea mays) 62
OsrbcS_rice NP_001066559 水稻(Oryza sativa) 61
吴学龙等: 油菜BnrbcS基因超表达提高拟南芥种子重量和含油量 171
图1 BnrbcS与不同物种Rubisco小亚基氨基酸序列同源性比较
Fig.1 Alignment of deduced amino acids of BnrbcS
A: BnrbcS包含有典型的Rubisco小亚基结构域; B: BnrbcS及其同源基因所编码的氨基酸序列比对; C: BnrbcS蛋白信号肽预测结果。
植物生理学报172
高34.50%, 粒重最大的株系OBnR-22较野生型提
高70.0%; 10个转化株系的含油量平均值较野生型
提高21.7%, 其中含油量最高的株系OBnR-22较野
生型提高37.8% (图4-A和B)。值得注意的是除了
株系OBnR-22种子粒重和含油量提高幅度均最高,
其余各转化株系粒重和含油量提高幅度并不呈线
性关系, 显示BnrbcS的种子特异超表达可增加种子
贮藏物质的积累, 种子粒重增加的部分原因是由
于种子油脂积累的提高。各转化株系的成熟种子
均表现正常, 其中OBnR-71较野生型种子宽度略有
增加(图4-C)。虽然NAPIN启动子活性很强, 但由
其控制GUS等外源基因在转基因拟南芥种子中的
超量表达, 并未造成转基因拟南芥种子重量和含
油量的实质性改变(未发表的结果), 因此可以推测
本研究pNAPIN::BnrbcS拟南芥转化植株种子重量
和含油量的增加是由于BnrbcS种子特异超表达结
构的导入所致。
本研究用于BnrbcS种子特异超表达载体构建
的NAPIN启动子表达模式与拟南芥At2S3启动子
图2 BnrbcS在油菜不同的器官中的转录模式分析
Fig.2 Transcriptional pattern analysis of BnrbcS in different
organs of rapeseed
A: BnrbcS在油菜多种器官中表达, B: BnrbcS在种子发育期的
转录模式分析。其中C: 子叶; R: 根; St: 茎; L: 叶; F: 花; P: 角果皮;
DAA: 开花后时间。
图3 BnrbcS基因种子特异超表达载体pNAPIN::BnrbcS构建
Fig.3 BnrbcS seed specific expression vector construction
pNAPIN: NAPIN启动子; OCS3′: OCS终止子; pMAS1′: 甘露碱合成酶基因启动子; MAS 3′: 甘露碱合成酶基因终止子; LB: 左边界;
RB: 右边界。
表达模式很接近, 在开花后5~13 d的拟南芥未成熟
种子中均可以有较高水平表达; 由于开花后7~12 d
也是拟南芥种子脂肪酸合成代谢基因高表达期
(Ruuska等2002; Kroj等2003), 本研究采用RT-PCR
的方法分析了开花后7~12 d拟南芥pNAPIN::
BnrbcS转化株系OBnR-22、OBnR-71和Col 0野生
型植株中BnrbcS基因和总的Rubisco小亚基基因的
表达水平, 结果显示外源BnrbcS基因在2个转化株
系中均有表达, 在野生型植株中未检测到表达, 同
时2个BnrbcS超表达株系的总Rubisco小亚基基因
表达水平均有一定程度提高(图4-D)。
由于拟南芥等植物中Rubisco小亚基基因存在
多个拷贝, Rubisco大、小亚基分别由叶绿体基因
组和核基因组编码并在细胞的不同区域翻译, 并
且大、小亚基均受转录后调控(陈根云等1998; 贺
超英等2001; Rodermel等1996; Houtz等2008, Genk-
ov和Spreitzer 2009), 这种复杂的调控机制使诸多
对Rubisco基因的表达调控以提高Rubisco作用效
率的研究中Rubisco基因表达水平的提高与转化植
要作用。为进一步研究BnrbcS在种子油脂合成代
谢中的功能, 构建了NAPIN启动子驱动的BnrbcS
种子特异超表达载体pNAPIN::BnrbcS (图3), 经
PCR、酶切和测序对该载体进行验证后, 采用花序
浸泡法转化拟南芥, 经除草剂Basta抗性筛选、
PCR检测, 获得20个pNAPIN::BnrbcS表达结构稳定
遗传的拟南芥转化株系, 选择其中10个纯合(或后
代无分离)的株系用于后续分析。
在正常生长条件下, 拟南芥pNAPIN::BnrbcS
转化植株与野生型的营养生长无明显区别(结果未
显示)。对成熟种子含油量和单粒种子重量的测定
结果显示, 各转化株系的粒重和含油量均有不同
程度的提高, 10个转化株系的平均粒重较野生型提
吴学龙等: 油菜BnrbcS基因超表达提高拟南芥种子重量和含油量 173
图4 pNAPIN::BnrbcS拟南芥转化植株种子
含油量和重量提高
Fig.4 Comparison of the seed weight and oil content of the
pNAPIN::BnrbcS transgenic plants
A: 拟南芥野生型和转化株系单粒成熟种子重量比较; B: 拟南
芥野生型和转化株系种子含油量比较; C: 野生型和转化株系成熟
种子形态比较, 标尺=0.234 mm; D: 拟南芥野生型和转化株系荚果
中BnrbcS和总rbcS表达水平比较。OBnR-22和OBnR-71是2个独立
遗传的pNAPIN::BnrbcS拟南芥转化株系, 用于表达分析的是开花
后7~12 d的荚果。
株光合效率等表型的变化并不完全一致。Zhang
等(2002)将烟草rbcS的编码序列定点整合到质体
基因组, 极大的提高了转化植株rbcS基因表达, 但
并未增加Rubisco小亚基或Rubisco蛋白的量, 也没
有促进转化植株的生长和光合作用。Suzuki等
(2007)在水稻中表达rbcS正义序列, 提高了转基因
水稻中Rubisco含量, 但并未促进转化植株的光合
作用。在本研究中, BnrbcS超表达植株的含油量
和粒重均有提高, 但与rbcS的表达水平也不呈线性
关系。
迄今的研究证明了Rubisco大亚基起催化作
用, Rubisco固定CO2的活性位点就位于大亚基, 因
而叶绿体编码的rbcL成为提高光合作用中净CO2
固定的重要基因工程靶点。而小亚基具有调控
Rubisco活性的功能, 并影响其碳同化的效率(Gen-
kov和Spreitzer 2009)。对Rubisco组装的研究也显
示了分别由叶绿体和核编码的Rubisco大、小亚基
之间具有协同调控的特性 ( J i ang和Roderme l
1995)。本研究在拟南芥中种子特异超表达BnrbcS
基因, 增强了拟南芥荚果总的Rubisco小亚基基因
表达水平, 有效地增加了拟南芥种子油脂等贮藏
物质的积累并提高了种子重量和含油量。研究结
果显示了通过BnrbcS基因的时空特异表达调控提
高作物产量和油料作物含油量的潜力。
参考文献
陈根云(2002). 高光效作物基因工程中的几个问题. 植物生理学通
讯, 38 (6): 541~544
陈根云, 颇日辉, 李立人(1998). 水稻Rubisco小亚基前体cDNA的
克隆及其产物向豌豆叶绿体的运输. 植物生理学报, 24 (3):
293~299
贺超英, 王伟权, 东方阳, 张劲松, 盖钧镒, 陈受宜(2001). 大豆1,5-
二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的转录表达分析. 科学通报,
46 (16): 1375~1380
李志邈, 张海扩, 曹家树, 何祖华(2005). 拟南芥激活标记突变体库
的构建及突变体基因的克隆. 植物生理与分子生物学学报, 31
(5): 499~506
谭小力, 张志燕, 伍娟, 李家洋(2005). 油菜种子特异表达启动子
NAPN的功能鉴定. 中国油料作物学报, 27 (4): 85~88
Asokanthan PS, Johnson RW, Griffith M, Krol M (1997). The photo-
synthetic potential of canola embryos. Physiol Plantarum, 101
(2): 353~360
Broun P, Poindexter P, Osborne E, Jiang CZ, Riechmann JL (2004).
WIN1, a transcriptional activator of epidermal wax accumulation
in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 4706~4711
Clough SJ, Bent AF (1998). Floral dip: a simplified method for
Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thali-
ana. Plant J, 16: 735~743
Dedonder A, Rethy R, Fredericq H, Van Montagu M, Krebbers E
(1993). Arabidopsis rbcS genes are differentially regulated by
light. Plant Physiol, 101: 801~808
Eastmond PJ, Kolacna L, Rawsthorne S (1996). Photosynthesis by
developing embryos of oilseed rape (Brassica napus L.). J Exp
Bot, 47: 1763~1769
Fluhr R, Kuhlemeier C, Nagy F, Chua NH (1986). Organ-specific and
植物生理学报174
light-induced expression of plant genes. Science, 232 (4754):
1106~1112
Genkov T, Spreitzer RJ (2009). Highly conserved small subunit resi-
dues influence rubisco large subunit catalysis. J Biol Chem, 284
(44): 30105~30112
Goffman FD, Alonso AP, Schwender J, Shachar-Hill Y, Ohlrogge JB
(2005). Light enables a very high efficiency of carbon storage in
developing embryos of rapeseed. Plant Physiol, 138: 2269~2279
Hajduch M, Casteel JE, Hurrelmeyer KE, Song Z, Agrawal GK,
Thelen JJ (2006). Proteomic analysis of seed filling in Brassica
napus. Developmental characterization of metabolic isozymes
using high-resolution two-dimensional gel electrophoresis. Plant
Physiol, 141: 32~46
Houtz RL, Magnani R, Nayak NR, Dirk LMA (2008). Co- and post-
translational modifications in Rubisco: unanswered questions. J
Exp Bot, 59 (7): 1635~1645
Jiang CZ, Rodermel SR (1995). Regulation of photosynthesis during
leaf development in RbcS antisense DNA mutants of tobacco.
Plant Physiol, 107 (1): 215~224
Kasajima I, Ide Y, Ohkama-Ohtsu N, Hayashi H, Yoneyama T, Fuji-
wara T (2004). A protocol for rapid DNA extraction from Arabi-
dopsis thaliana for PCR analysis. Plant Mol Biol Rep, 22: 49~52
Keegstra K, Cline K (1999). Protein import and routing systems of
chloroplasts. Plant Cell, 11: 557~570
Kroj T, Savino G, Valon C, Giraudat J, Parcy F (2003). Regulation of
storage protein gene expression in Arabidopsis. Development,
130: 6065~6073
Lee DW, Kim JK, Lee S, Choi S, Kim S, Hwang I (2008). Arabidop-
sis nuclear-encoded plastid transit peptides contain multiple se-
quence subgroups with distinctive chloroplast-targeting sequence
motifs. Plant Cell, 20: 1603~1622
Lee DW, Lee S, Oh YJ, Hwang I (2009). Multiple sequence motifs in
the rubisco small subunit transit peptide independently contrib-
ute to Toc159-dependent import of proteins into chloroplasts.
Plant Physiol, 151 (1): 129~141
Molina I, Ohlrogge JB, Pollard M (2008). Deposition and localiza-
tion of lipid polyester in developing seeds of Brassica napus and
Arabidopsis thaliana. Plant J, 53 (3): 437~449
Niu Y, Wu GZ, Ye R, Lin WH, Shi QM, Xue LJ, Xu XD, Li Y, Du
YG, Xue HW (2009). Global analysis of gene expression profiles
in Brassica napus developing seeds reveals a conserved lipid
metabolism regulation with Arabidopsis thaliana. Mol Plant, 2
(5): 1107~1122
Rodermel S, Haley J, Jiang CZ, Tsai CH, Bogorad L (1996). A mecha-
nism for intergenomic integration: abundance of ribulose bispho-
sphate carboxylase small-subunit protein influences the transla-
tion of the large-subunit mRNA. Proc Natl Acad Sci USA, 93 (9):
3881~3885
Ruuska SA, Girke T, Benning C, Ohlrogge JB (2002). Contrapuntal
networks of gene expression during Arabidopsis seed filling.
Plant Cell, 14: 1191~1206
Ruuska SA, Schwender J, Ohlrogge JB (2004). The capacity of green
oilseeds to utilize photosynthesis to drive biosynthetic processes.
Plant Physiol, 136: 2700~2709
Schwender J, Goffman F, Ohlrogge JB, Shachar-Hill Y (2004). Rubis-
co without the Calvin cycle improves the carbon efficiency of
developing green seeds. Nature, 432: 779~782
Sugita M, Gruissem W (1987). Developmental, organ-specific, and
light-dependent expression of the tomato ribulose-1,5-bisphos-
phate carboxylase small subunit gene family. Proc Natl Acad Sci
USA, 84: 7104~7108
Suzuki Y, Ohkubo M, Hatakeyama H, Ohashi K, Yoshizawa R,
Kojima S, Hayakawa T, Yamaya T, Mae T, Makino A (2007). In-
creased Rubisco content in transgenic rice transformed with the
sense rbcS gene. Plant Cell Physiol, 48 (4): 626~637
White JA, Todd J, Newman T, Focks N, Girke T, de Ilarduya OM,
Jaworski JG, Ohlrogge JB, Benning C (2000). A new set of Ara-
bidopsis expressed sequence tags from developing seeds. The
metabolic pathway from carbohydrates to seed oil. Plant Physiol,
124: 1582~1594
Winter U, Feierabend J (1990). Multiple coordinate controls contrib-
ute to a balanced expression of ribulose-1,5-bisphosphate car-
boxylase/oxygenase subunits in rye leaves. Eur J Biochem, 187
(2): 445~453
Yong ZH, Chen GY, Shi JN, Xu DQ (2006). In vitro reassembly
of tobacco ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
from fully denatured subunits. Acta Bioch Bioph Sin, 38 (10):
737~745
Zhang XH, Ewy RG, Widholm JM, Portis AR Jr (2002). Comple-
mentation of the nuclear antisense rbcS-induced photosynthesis
deficiency by introducing an rbcS gene into the tobacco plastid
genome. Plant Cell Physiol, 43 (11): 1302~1313