全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 555
收稿 2009-12-22 修定 　2010-04-28
资助 国家高技术研究发展计划(“863”计划) (2007AA10Z113)。
* 通讯作者(E-mail: dluo@sibs.ac.cn; Tel: 021-54924108)。
利用农杆菌介导的瞬时表达系统研究CYC类TCP蛋白的亚细胞定位
李超 1, 许治永 2, 杨军 2, 罗达 1,2,*
1上海交通大学生命科学技术学院, 上海 200240; 2中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所植物分子遗传国家
重点实验室, 上海 200032
提要: CYCLOIDEA (CYC)类 TCP基因在豆科与玄参科植物中都参与了两侧对称花型的发育, 但它们的具体功能有明显的
差异。通过在豌豆花瓣中建立农杆菌EHA105介导的瞬时表达系统, 观察到豆科植物百脉根和玄参科植物金鱼草的CYC类
TCP蛋白亚细胞定位有明显区别。
关键词: 农杆菌; 瞬时表达; CYC类TCP蛋白; 亚细胞定位
Using Agroinjection as a Transient Expression System to Investigate Subcellu-
lar Localization of CYC-like TCP Proteins
LI Chao1, XU Zhi-Yong2, YANG Jun2, LUO Da1,2,*
1School of Life Science and Biotechnology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China; 2National Key Laboratory of
Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy
of Sciences, Shanghai 200032, China
Abstract: CYCLOIDEA-like TCP genes control the floral zygomorphy in both legume and Scrophulariaceae
plants with divergent functions. A transient expression system using agroinjection mediated by Agrobacterium
tumefaciens strain EHA105 was established in petals of pea (Pisum sativum L.), and we found that the subcel-
lular localizations of two homologous proteins, CYCLOIDEA from Antirrhinum majus and LjCYC1 from Lotus
japonicus, are differentially distributed in cells.
Key words: Agrobacterium tumefaciens; transient expression; CYC-like TCP proteins; subcellular localization
两侧对称花型被认为与昆虫传粉密切相关。
在玄参科植物金鱼草(Ant irrh inum majus )中,
CYCLOIDEA (CYC)和 DICHOTOMA (DICH)共同
控制了两侧对称花型的发育(Luo等 1996, 1999)。
在豆科植物百脉根(Lotus japonicus)和豌豆(Pisum
s a t i v u m )中 , C Y C 类 T C P 基因发生了复增
(duplication), 通过分工与合作控制了背腹轴向不同
类型花瓣的发育(Feng等 2006; Wang等 2008)。已
有研究利用基因枪法在洋葱表皮细胞中表达GUS
标记的LjCYC1蛋白时发现融合蛋白主要定位在细
胞核中(Qin等 2004)。但在GFP标记 LjCYC1百脉
根转基因植株中, 却观察到融合蛋白以颗粒状散布
在细胞质中(蔡志刚等未发表资料) , 提示豆科中
CYC类TCP蛋白的定位可能还受到其他蛋白的影
响。为快速高效的研究豆科中参与花型发育的蛋
白的亚细胞定位, 我们以豌豆花瓣为实验材料, 利
用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的瞬时表
达系统研究 CYC和 LjCYC1蛋白的亚细胞定位。
材料与方法
豌豆(Pisum sativum L.)由英国John Innes Cen-
tre豌豆种质中心Mike Ambrose博士提供(种质中心
编号 JI992)。种植于人工气候室, 19~21 ℃, 16 h
(光照)/8 h (黑暗), 光照强度 150 μmol·m-2·s-1。大
肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH5α、农杆菌菌株
EHA105、质粒 pLjCYC1-cDNA、pCYC-cDNA、
pCAMBIA1300和pCAMBIA1301由本试验室提供,
pBS-T购买自 TIANGEN公司, PA7-YFP由中国科
学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所薛红
卫研究员惠赠。重悬液: B5 大量元素、微量元
素、维生素的浓度均减半, 10 g·L- 1蔗糖、100
μmol·L-1 acetosyringone (As), pH 5.8。固定液: 3.7%
甲醛和 50 mmol·L-1 PIPES, pH 6.8。
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月556
构建双元表达质粒, 对目的片段 PCR扩增后,
连接到pBS-T载体; SalI和SmaI双酶切后连接到中
间载体 PA7-YFP, 再用HindIII/EcoRI双酶切, 与
pCAMBIA1300 (PC1300)双元载体连接(图 1)。之
后将构建好的双元表达质粒及pCAMBIA1301 (35S::
GUS)通过热激法导入农杆菌 EHA105。
数材料中观察到GUS基因的表达(图 2-A、B)。注
射后继续培养 3~4 d时, 绝大部分叶片染色结果都
为阳性, 而大部分的花瓣凋谢枯萎, 因此并未列入
统计。
图 1 双元表达质粒结构示意图
Fig.1 Diagram of binary expression vectors
表 1 农杆菌注射法侵染后不同时间进行GUS
染色的叶片和花瓣
Table 1 Leaves and petals GUS-stained in different
day after agroinjection
　 叶片数量 /片 花瓣数量 /片
1 d 2 d 3 d 4 d 1 d 2 d
GUS染色阳性 0 7 1 1 1 1 2 1 0
GUS染色检测 1 2 1 2 1 2 1 2 1 0 1 0
农杆菌活化后, 接种到 5 mL含卡那霉素 50
mg·L-1的YEB培养基, 28 ℃ 200 r·min-1培养 12 h;
加入As至终浓度为 100 μmol·L-1, 28 ℃ 200 r·min-1
继续培养 4 h。1 000×g离心 10 min, 去上清, 重悬,
并用重悬液稀释至OD600 0.5~0.7。选取 10 mm左
右的豌豆花蕾或 3~4 cm长、浅绿色的柔嫩叶片,
用注射器针头在花瓣或叶片背面扎2~3个孔, 然后
用注射器将菌悬液通过针孔注射到叶片或花瓣中,
具体注射方法参考 Sparkes等(2006)。
使用固定液固定 2~3 h后, 用 50 mmol·L-1
PIPES缓冲液(pH 6.8)漂洗 20 min。GUS染色参
照 Jefferson等(1987)方法。显微镜型号Olympus
FLUOVIEW FV1000, 物镜 20×(0.75), YFP激发光
515 nm, 带宽 530~630 nm; DAPI激发光 405 nm,
带宽 425~499 nm。
结果与讨论
1 注射后继续培养不同时间后GUS的表达
表 1结果显示, 注射已导入 pCAMBIA1301质
粒的农杆菌后, 至少须继续培养2 d, 才能在绝大多
2 荧光蛋白的观察和定位
为排除农杆菌注射法对植物组织造成损伤而
导致自发荧光对观察结果的干扰, 首先对豌豆花蕾
注射已导入pCAMBIA1301质粒的农杆菌, 2 d后将
旗瓣分为两部分, 分别进行GUS染色及固定。选
GUS染色为阳性的样品对应的另一部分作为阴性
对照在显微镜下观察, 调节参数, 使在注射过的区
域内观察不到信号。另选花蕾注射已导入 YF P
(PC1300)质粒的农杆菌, 2 d后将旗瓣固定, 在已调
好参数的显微镜下观察, 可在部分细胞中观察到
YFP荧光信号在细胞质和细胞核内都有分布(图2-
C、D)。
3 融合蛋白的定位
融合蛋白CYC-YFP和LjCYC1-YFP分子量较
大, 分别为 59 kDa和68 kDa, 通过扩散进入细胞核
的可能性较低(Nigg 1997), 但CYC和LjCYC1均含
有核定位信号(Cubas等 1999; Qin等 2004)。分别
对豌豆花蕾注射已导入 LjCYC1-YFP (PC1300)和
CYC-YFP (PC1300)质粒的农杆菌。结果(图 3、表
2)显示, 大多数细胞中, CYC-YFP的荧光信号在与
DAPI重合, 并在细胞核内的某一点较为集中(图3-
I~L), 与预测相符; LjCYC1-YFP的荧光信号呈点状
分布在细胞质中(图3-A~D), 与蔡志刚等(未发表资
料)所观察到的LjCYC1-GFP百脉根转基因植株中
荧光信号的分布类似, 以上实验结果说明该系统可
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月 557
图 3 农杆菌注射法侵染后花瓣细胞中 LjCYC1-YFP和CYC-YFP荧光信号较为典型的分布类型
Fig.3 Representative distribution patterns of LjCYC1-YFP and CYC-YFP in petal cells after agroinjection
“YFP”和 “DAPI”分别指示在显微镜 YFP通道和 DAPI通道观察到的图像, “YFP+DAPI”指示YFP通道与 DAPI通道信号重合
后的图像, “Merge” 指示 YFP通道、DAPI 通道及透射光通道信号重合后的图像; A~D、E~H 分别对应表 2 中 LjCYC1-YFP分布
类型 I和类型 II的描述; I~L、M~P分别对应表 2中 CYC-YFP分布类型 I和类型 II的描述。比例尺长度为 10 μm。
图 2 农杆菌注射法侵染后报告基因在叶片和花瓣中的表达
Fig.2 Expression of reporter genes in leaves and petals after agroinjection
A、B: GUS染色时呈阳性的叶片和花瓣; C、D: YFP在旗瓣细胞质和细胞核中的定位。比例尺长度为 20 μm。
准确反映 CYC和 LjCYC1的亚细胞定位。少数细
胞中出现的不规则形状分布的LjCYC1-YFP或细胞
质内分布的 CYC-YFP (图 3-E~H、M~P), 可能是
过量表达导致目标蛋白运输异常的结果(Berg和
Beachy 2008)或细胞内其他机制对蛋白亚细胞定位
的调节。
植物生理学通讯 第 46卷 第 6期, 2010年 6月558
参考文献
Berg RH, Beachy RN (2008). Fluorescent protein applications in
plants. Methods Cell Biol, 85: 153~177
Cubas P, Lauter N, Doebley J, Coen E (1999). The TCP domain:
a motif found in proteins regulating plant growth and
development. Plant J, 18 (2): 215~222
Feng X, Zhao Z, Tian Z, Xu S, Luo Y, Cai Z, Wang Y, Yang J, Wang
Z, Weng L et al (2006). Control of petal shape and floral
zygomorphy in Lotus japonicus. Proc Natl Acad Sci USA, 103
(13): 4970~4975
Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW (1987). GUS fusions:
beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion
marker in higher plants. EMBO J, 6 (13): 3901~3907
Luo D, Carpenter R, Copsey L, Vincent C, Clark J, Coen E (1999).
Control of organ asymmetry in flowers of Antirrhinum. Cell,
99 (4): 367~376
Luo D, Carpenter R, Vincent C, Copsey L, Coen E (1996). Origin
of floral asymmetry in Antirrhinum. Nature, 383 (6603):
794~799
Nigg EA (1997). Nucleocytoplasmic transport: signals, mecha-
nisms and regulation. Nature, 386 (6627): 779~787
Qin LJ, Guo XZ, Feng XZ, Weng L, Yan J, Hu XH, Luo D (2004).
Cloning of LjCYC1 gene and nuclear localization of LjCYC1
protein in Lotus japonicus. J Plant Physiol Mol Biol, 30 (5):
523~532
Sparkes IA, Runions J, Kearns A, Hawes C (2006). Rapid, transient
expression of fluorescent fusion proteins in tobacco plants
and generation of stably transformed plants. Nat Protoc, 1
(4): 2019~2025
Wang Z, Luo Y, Li X, Wang L, Xu S, Yang J, Weng L, Sato S, Tabata
S, Ambrose M et al (2008). Genetic control of floral zygo-
morphy in pea (Pisum sativum L.). Proc Natl Acad Sci USA,
105 (30): 10414~10419
表 2 农杆菌注射法侵染后花瓣细胞中 LjCYC1-YFP和CYC-YFP荧光信号的分布类型
Table 2 Distribution patterns of LjCYC1-YFP and CYC-YFP in petal cells after agroinjection
　 类型 I 类型 II 类型 III
　 定位 比率 定位 比率 定位 比率
LjCYC1-YFP 细胞质中刻点状 17/24 细胞质中不规则形状 4/24 细胞质中刻点状及不规则形状 3/24
CYC-YFP 只在细胞核中 13/17 细胞核及细胞质 4/17 只在细胞质中 0/17
　　比率值表示为具有该类荧光信号分布模式的细胞数量 / 观察到的有荧光信号表达的细胞数量。