全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (4): 343~346 343
收稿 2012-12-26　　修定 2013-01-28
资助 国家国际科技合作项目(2011DFA30490)和国家十二五科
技支撑课题(2012BAD01B07)。
* 共同通讯作者(E-mail: fzq_76@126.com; Tel: 0571-
63105093; E-mail: honglishang0507@163.com; Tel: 133-
88190639)。
山茶‘耐冬’愈伤组织诱导与植株再生
吴斌1,2, 李纪元2, 范正琪2,*, 商宏莉1,*
1四川师范大学生命科学学院, 成都610101; 2中国林业科学研究院亚热带林业研究所, 浙江富阳311400
摘要: 以‘耐冬’子叶为外植体, 对其愈伤组织途径再生植株进行了研究。以MS基本培养基, 添加0.5 mg∙L-1 2,4-D+2.0 mg∙L-1
6-BA诱导愈伤组织, 诱导率达94.5%。在添加0.1 mg∙L-1 NAA和2.0 mg∙L-1 6-BA的继代培养基上经过2次转接继代培养后,
将愈伤组织转入MS+0.5 mg∙L-1 NAA+10.0 mg∙L-1 6-BA或者MS+0.5 mg∙L-1 IBA+10.0 mg∙L-1 6-BA的分化培养基中, 约45 d可
获得再生不定芽, 分化率约34%。最后利用“滤纸桥生根法”获得了约33%的生根山茶植株, 从而建立了‘耐冬’愈伤组织诱导
及植株再生体系。
关键词: 山茶; ‘耐冬’; 愈伤组织; 不定芽分化; 生根诱导; 植株再生
Callus Induction and Plant Regeneration of Camellia japonica L. ‘Naidong’
WU Bin1,2, LI Ji-Yuan2, FAN Zheng- Qi2,*, SHANG Hong- Li1,*
1College of Life Sciences, Sichuan Normal University, Chengdu, 610101, China; 2Research Institute of Subtropical Forestry, Chi-
nese Academy of Forestry, Fuyang, Zhejiang 311400, China
Abstract: Callus induction and plantlet regeneration were studied from mature cotyledons of Camellia japoni-
ca L. ‘Naidong’. Up to 94.5% of the cotyledons cultured on MS medium with 0.5 mg∙L-1 2,4-D and 2.0 mg∙L-1
6-BA developed callus. The callus was then transferred to subculturing medium containing 0.1 mg∙L-1 NAA and
2.0 mg∙L-1 6-BA. Adventitious buds were obtained after 45 days on the medium with 0.5 mg∙L-1 NAA+10.0
mg∙L-1 6-BA or 0.5 mg∙L-1 IBA+10.0 mg∙L-1 6-BA, the differentiation rate was about 34%. About 33% plantes of
C. japonica developed its fine root system by using “filter paper bridge rooting method”. Therefore, callus in-
duction and regeneration system were achieved successfully.
Key words: Camellia japonica; ‘Naidong’; callus induction; adventitious buds differentiation; rooting induc-
tion; plantlet regeneration
山茶‘耐冬’为常绿阔叶灌木或小乔木, 山茶科
山茶属植物, 主要分布于青岛崂山及长门岩等岛
屿, 为我国山茶的自然分布最北端。‘耐冬’四季常
青, 花色艳丽, 花型优美, 花期持久, 是青岛最重要
的木本花卉 , 1988年被确定为青岛市市花 (图
1-A)。
山茶‘耐冬’种苗目前仍以传统方式繁殖为主,
但因其分布狭窄, 种子和种苗来源严重不足, 不能
满足种苗和商品苗市场的需求。植物组织培养技
术是适宜于‘耐冬’大量扩繁的潜在方式。国内从
20世纪80年代就开始采用山茶种子的子叶、幼龄
植株的茎尖与带芽茎节、成年植株的茎尖与带芽
茎节等作为外植体, 诱导体胚再到丛生芽或者“芽
生芽”茎段培养, 成功获得山茶再生苗(毕方铖等
2004; 李纪元等2003; 张国彬2004; 庄承纪和周建
葵1997); 而由愈伤组织诱导到不定芽分化和再生
植物技术却鲜有报道(蔡汉权1996), 关于‘耐冬’的
再生途径研究目前仍局限于愈伤组织的诱导(陈艳
丽2006; 董慧慧等2007)。本研究的主要目的是摸
索出一种通过愈伤组织途径再生植株的方法, 为
该植物大规模无性繁殖和遗传转化实验提供技术
支撑。
材料与方法
1 材料来源及预处理
供试材料为山茶‘耐冬’ (Camellia japonica L.)
成熟果实, 9月初采自山东省青岛植物园。将果实
剥去果皮, 用洗涤剂搓洗种子, 再用自来水搓洗至
植物生理学报344
无泡沫, 置于培养瓶中, 加入75%酒精进行第1次消
毒浸泡10 s左右, 然后纯净水清洗2遍, 沥干水分,
盖上瓶盖, 置于无菌超净台备用。
2 种子处理及愈伤组织诱导
使用75%的酒精表面消毒30 s, 接着用0.1%的
HgCl2浸泡8 min, 无菌水冲洗5~6遍, 清洗完毕后将
种子铺在放有滤纸的培养皿里吹干水分, 备用。
剥去种子的内外种皮, 去除胚芽, 将子叶从中
间横切一分为二 , 接种于愈伤组织诱导培养基
上; 培养温度为(25±2) ℃, 光照强度为2 500~3 000
μmol·m-2∙s-1, 光照时间为12 h∙d-1。每瓶接种5块材
料, 共8瓶, 重复2次。
愈伤组织诱导采用MS基本培养基, 添加0.5
mg∙L-1 2,4-D+2.0 mg∙L-1 6-BA (董慧慧等2007)。培
养基中蔗糖含量为3%, 琼脂0.70%, 灭菌前将pH调
至5.8, 121 ℃高温高压灭菌20 min。
3 愈伤组织的继代和不定芽分化
将愈伤组织连同子叶一并转接至培养基MS+
0.5 mg∙L-1 2,4-D+2.0 mg∙L-1 6-BA或者MS+0.1
mg∙L-1 NAA+2.0 mg∙L-1 6-BA进行继代培养, 每50 d
转接1次。待培养一段时间后, 将愈伤组织转移至
分化不定芽培养基MS+0.5 mg∙L-1 NAA+10.0 mg∙L-1
6-BA或者MS+0.5 mg∙L-1 IBA+10.0 mg∙L-1 6-BA内,
培养条件同上。
4 不定芽的诱导生根
在不定芽分化培养基中培养诱导出的绿色芽
点渐渐分化出小芽, 待其成型并长至1.5~3 cm的粗
壮芽条后切取单芽, 基部用500 mg∙L-1的IBA浸没
处理20 min, 然后转到添加蔗糖20 g∙L-1液体MW培
养基的纸桥上, 在弱光下诱导生根。
5 再生植株的驯化和移栽
当再生植株的幼根长至2~3 cm时, 即可进行
炼苗移栽。将瓶盖逐步打开, 炼苗3~5 d之后, 将出
瓶的幼苗用水清洗之后再用1 000倍多菌灵溶液浸
泡10 min, 移栽至以蛭石为主, 辅以珍珠岩、泥土,
pH值为6~6.5的混合基质中。
实验结果
1 山茶‘耐冬’愈伤组织的诱导
在光照条件下培养大约10 d, 可以看到子叶表
面有白色的凹凸, 说明愈伤组织诱导已经开始启
动; 再经过15 d左右, 就可以看到淡黄色、透亮细
密的愈伤组织生长于子叶与培养基接触的外围或
者那些凹凸不平的部位(图1-B); 接种45 d左右, 愈
伤基本上全覆盖式生长在子叶表面, 淡黄色或者
淡黄绿色, 少量材料愈伤组织表面会微泛红。
于3月8日与4月2日进行了2次耐冬子叶愈伤
诱导试验, 接种30 d之后, 就对外植体愈伤组织诱
图1 山茶‘耐冬’愈伤组织诱导与植株再生
Fig.1 Callus induction and plant regeneration of C. japonica ‘Naidong’
A: ‘耐冬’植株开花; B: 愈伤组织诱导; C: 不定芽分化; D: 不定芽分化; E: 生根诱导前的丛生芽; F: 生根诱导前期; G: 生根诱导后期; H:
再生苗驯化移栽。
吴斌等: 山茶‘耐冬’愈伤组织诱导与植株再生 345
导情况进行统计, 其结果分别为3月8日的诱导率
是88.89%, 4月2日的诱导率是100%, 其平均诱导率
为94.45%。
2 山茶‘耐冬’愈伤组织的继代培养
将愈伤组织置于两种不同的培养基内进行继
代培养, 30 d之后发现, 在愈伤诱导培养基MS+0.5
mg∙L-1 2,4-D+2.0 mg∙L-1 6-BA内继代培养的愈伤组
织很多, 质地更加坚硬致密, 表面有不少白色细颗
粒, 有的甚至表面已呈绵白糖质地, 少量致密愈伤
组织外侧长出淡黄色、肥厚肉质的体胚。而在含
0.1 mg∙L-1 NAA+2.0 mg∙L-1 6-BA基内培养的愈伤
组织大部分保持着淡黄色、黄绿色结构紧致或较
为疏松的细颗粒并泛有水润光泽的良好状态, 少
量愈伤组织泛有微红。
3 山茶‘耐冬’不定芽的分化
部分愈伤组织经2次转接继代培养之后, 转移
至不定芽分化培养基内。15 d之后, 大多数细颗粒
的愈伤组织表面会略有泛红, 有的透亮且富有水
润光泽。经过1个多月的培养, 可见部分黄色愈伤
组织变为黄绿色中透着红色的细颗粒愈伤组织,
表面略微粗糙但组织内部透亮; 之后从透着红色
的愈伤组织中长出绿色的小颗粒, 逐步变为黄绿色
透亮的小颗粒; 再培养一段时间, 可分化为黄绿色
透亮的小芽, 略带绒毛(图1-C)。小芽不断发育成
型(图1-D), 其基部会有更多的小芽分化出来, 之后
发育为大小不等的丛生芽(图1-E)。45 d之后对不
定芽数量进行统计, 其分化率为34%左右。
4 山茶‘耐冬’生根诱导与生长
山茶是一种较难生根的木本花卉。通过前期
的试验, 我们采用了“滤纸桥生根法” (庄承纪和周
建葵1997), 进行诱导生根, 取得了较为满意的结
果。该阶段采用MW液体生根培养基, 添加蔗糖20
g∙L-1。
长至1.5~3 cm成型的芽条可以进行生根诱
导。经20 d左右的弱光培养之后, 可以观察到部分
芽条基部或者茎段某些部位略微膨大, 变红, 并伴
有透明的细小愈伤组织颗粒长出; 再培养2~3 d, 愈
伤组织增多, 有些芽条开始有透明的幼根从其膨
大的红色部位长出; 一旦透亮微泛红的幼根长出
之后, 其伸长速度加快, 不到1周, 伸长至1.5 cm左
右, 表面略带白色绒毛(图1-F); 再培养1周左右, 幼
根逐渐木质化, 且变绿; 3个月之后, 主根上面也长
出了不少须根(图1-G)。此时对生根苗进行统计,
约33%的芽条长出幼根。
5 再生植株驯化移栽
待主根木质化且长出一定数量的须根之后,
采取逐步开盖炼苗来提高存活率(李纪元等2003)。
刚开始炼苗时, 瓶盖敞开一小部分, 避免水分蒸发
过快; 经过1~2 d后, 将瓶盖再开一部分, 让再生苗
逐渐适应外界环境, 直至完全打开瓶盖。
炼苗3~5 d后, 进行移栽。移栽前期置于光照
培养箱内进行, 空气湿度要保持在90%以上, 遮光
率为50%, 环境温度控制在25~32 ℃ (图1-H)。用
纯水或者低浓度的营养液进行喷洒, 保持叶面湿
润。经过一段时间之后, 移栽苗置于大棚进行正
常管理。
讨　　论
1 生长素在愈伤组织继代与不定芽诱导中的作用
在继代培养过程中, 我们采用了两种方法, 一
种是愈伤组织置于新鲜的诱导养基内继续培养,
另一种是以0.1 mg∙L-1 NAA取代2,4-D进行继代培
养。经过30 d左右的培养, 得到了生长状态截然不
同的愈伤组织(表1)。
之后将前者愈伤组织置于不定芽分化培养基
内生长, 其致密的状态亦很难再调整好, 不利于芽
点的分化。而在含NAA的培养基内进行继代培养
的愈伤组织, 其大多数保持着黄绿色或绿色细密
的状态, 即使在多次转接继代之后仍然可保持良
好的生长状态, 且适合不定芽的分化诱导试验。
表1 山茶的继代和诱导不定芽分化的生长情况
Table 1 The subculture and induced adventitous buds of C. japonica
继代培养 不定芽分化 不定芽分化率/% 生长状况
0.5 mg∙L-1 2,4-D+2.0 mg∙L-1 6-BA 0.5 mg∙L-1 NAA/IBA+10.0 mg∙L-1 6-BA 0 白色致密, 干燥, 呈绵白糖质地
0.1 mg∙L-1 NAA+2.0 mg∙L-1 6-BA 34 黄绿色或绿色细密, 水润光泽
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据此得出结论, 在‘耐冬’愈伤组织培养过程
中, 较低浓度的NAA生长素比2,4-D更利于继代增
殖和下一步不定芽分化。
2 不定芽分化过程中的思考
关于‘耐冬’组培的研究尚未涉及愈伤组织在
整个生长过程中颜色的变化及生理生化的研究, 而
本研究中只对其颜色变化做了较为详尽的描述。
在转接过程中, 愈伤组织被切开后, 色素会很
明显地残留于滤纸上。这种泛红的组织在愈伤组
织诱导阶段极少存在, 但其通体变红则主要发生
在不定芽分化的过程中。这种红色的愈伤组织中
可能含有花色苷等黄酮类物质, 且伴随着愈伤组
织的生长, 黄酮类物质也会不断累积, 这就能解释
泛红的愈伤组织会越来越红。而这种红色愈伤组
织多出现在诱导不定芽分化阶段的情况与山茶组
织培养的中山茶总黄酮含量变化规律基本一致(张
国彬2004)。我们可以通过红色愈伤组织的多少或
者颜色的深浅来初步判断其中黄酮类物质含量的
高低, 并借此来获悉愈伤组织处于哪个生长阶段
以便更为有效地对愈伤组织进行分化诱导。
‘耐冬’愈伤组织在各个生长阶段的生理生化
研究可以在不定芽分化试验中对于激素的配比及
继代周期等起到一定的指导作用, 而这方面有待
做进一步的研究。
参考文献
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