全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (12): 1205~1209 1205
收稿 2012-10-22 修定 2012-11-28
资助 国家自然科学基金项目(31000410)和陕西省教育厅项目
(12JK0832和09JK434)。
* 通讯作者(E-mail: yuanyunxiang2006@126.com)。
枇杷叶荚蒾的愈伤组织诱导及植株再生
袁云香1,2,*
1渭南师范学院化学与生命科学学院, 陕西渭南714099; 2陕西省多河流湿地生态环境重点实验室, 陕西渭南714099
摘要: 以枇杷叶荚蒾幼叶为外植体, MS为基本培养基, 研究不同种类和浓度的植物生长调节物质对愈伤组织诱导、分化及
生根的影响, 建立了枇杷叶荚蒾再生体系。结果表明: 枇杷叶荚蒾最佳灭菌组合为75%酒精预处理20 s, 再用0.1% HgC12浸
泡12 min; 最佳愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.25 mg·L-1+2,4-D 1.0 mg·L-1, 诱导率最高达92%; 最适芽
分化培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1, 分化率达87.25%; 适宜的生根培养基为1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1, 生根率
达85%。
关键词: 枇杷叶荚蒾; 愈伤组织诱导; 植株再生
Callus Induction and Plantlet Regeneration of Viburnum rhytidophyllum Hemsl.
YUAN Yun-Xiang1,2,*
1School of Chemistry and Life Science, Weinan Normal University, Weinan, Shaanxi 714099, China; 2Key Laboratory for Eco-
Environment of Multi-River Wetlands in Shaanxi Province, Weinan, Shaanxi 714099, China
Abstract: The young leaves of Viburnum rhytidophyllum were taken as explants, and MS was basic medium.
The effects of different concentrations and combinations of plant growth regulators on callus induction, bud
differentiation and root formation were studied. Tissue culture regeneration system for V. rhytidophyllum was
established. The results showed that the best sterilization method for materials was to soak explants into 0.1%
HgC12 solution for 12 min after pretreatment with 75% alcohol for 20 s; the best medium for callus formation
was MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.25 mg·L-1+2,4-D 1.0 mg·L-1, callus induction rate reached 92%; the optimum
bud differentiation medium was MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1 with the induction rate of 87.25%; the
suitable medium for root induction was 1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1 and the rooting rate was 85%.
Key words: Viburnum rhytidophyllum; callus induction; plant regeneration
枇杷叶荚蒾为忍冬科荚蒾属常绿灌木或小乔
木(邢全等2004), 又名皱叶荚蒾、山枇杷、野枇杷
(史喜兵等2010), 原产于我国陕西南部、湖北西
部、四川东部和东南部及贵州, 在美国也有分布
(Flint 1983), 目前在北京、郑州及沈阳等地已引种
成功。枇杷叶荚蒾叶卵状长圆形, 叶面深绿色, 革
质, 表皮光滑, 背面密生黄褐色绒毛。喜温暖、湿
润, 较耐阴, 不耐涝, 具有较强的抗旱、抗寒及调
节代谢的能力, 对碱盐土壤有一定适应能力。枇
杷叶荚蒾不仅是北方地区的一种常绿观叶植物,
也可作为绿篱木、观花树、观果树 (田朝阳等
2009), 具有较高的观赏价值, 尤其是在我国北方城
市, 应用前景广阔(崔洪霞2001; 黄国学和卜鹏图
2011)。枇杷叶荚蒾的常规繁殖方式有播种、扦
插, 由于种子休眠期较长, 对播种土壤要求高, 而
且在北方生长较慢 , 野生资源不能满足实际需
求。通过组织培养技术, 可不受生长季节限制, 且
繁殖系数大, 短期内即可获得大量植株。目前, 仅
有关于枇杷叶荚蒾引种栽培的研究报道(崔洪霞
2001; 邢全等2004; 史喜兵等2010), 与其同属的其
他种植物的离体培养研究已有报道, 如地中海荚
蒾(邓源等2008; 何婷等2010)、鸡树条荚蒾(王欢
等2010)、欧洲荚蒾(甄雪花等2010)、香荚蒾(杜姝
睿等2011), 而有关枇杷叶荚蒾的组织培养国内外
至今尚未见报道。本研究利用植物组织培养方法,
以枇杷叶荚蒾叶片为外植体, 诱导愈伤组织并分
化获得再生植株, 建立了枇杷叶荚蒾的愈伤组织
诱导与分化再生体系, 以期为枇杷叶荚蒾的规模
化、产业化育苗繁殖, 从而为使其成为我国北方
植物生理学报1206
城市常绿栽培灌木提供有效途径。
材料与方法
1 材料
枇杷叶荚蒾(Viburnum rhytidophyllum Hemsl.)
植株采自陕西省西安市临潼区骊山。
2 方法
2.1 材料灭菌
选取生长旺盛、无病虫害的枇杷叶荚蒾幼叶
放置于大烧杯内, 加入适量的洗衣粉, 烧杯口覆以
双层细纱布用橡皮筋扎紧(防止幼叶被水流冲坏),
于自来水下冲洗2 h。取出叶片, 用软毛刷清洗叶
片表面的绒毛, 进一步去除表面的灰尘等污物。
将其置于超净工作台中已灭菌好的烧杯里, 采取
不同时间的75%酒精和0.1% HgC12处理, 然后用无
菌水冲洗5~6次, 用无菌滤纸吸干表面水分后, 将
幼叶剪成约1.0 cm×1.0 cm的块状作为外植体进行
接种。75%酒精处理时间分别为15、20、25 s,
0.1% HgC12处理时间为8.0、10.0、12.0、15.0
min。接种14 d后统计污染率, 每瓶培养基接种4个
外植体, 共20瓶80个外植体, 每个试验重复3次。
2.2 愈伤组织诱导
用MS为基本培养基, 均添加30 g·L-1蔗糖、8
g·L-1琼脂、1.0 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及水解
酪蛋白300 mg·L-1, pH值为5.8。愈伤组织诱导培养
基中植物生长调节物质浓度采用正交设计L9(3
4),
设置6-BA、2,4-D、NAA 3个因素, 每个因素设置3
个水平, 6-BA为0.5、1.0、1.5 mg·L-1, NAA为0.1、
0.25、0.5 mg·L-1, 2,4-D为0.5、1.0、1.5 mg·L-1, 筛
选出适合枇杷叶荚蒾的愈伤组织诱导培养基(表
1)。在22~25 ℃下暗培养, 诱导愈伤组织形成。接
种30 d后统计诱导率, 并观察愈伤组织生长情况。
2.3 愈伤组织分化
挑选结构致密、表面干爽呈淡绿色颗粒状的
愈伤组织, 分别接种于不同分化培养基上, 以MS为
基本培养基, 均附加500 mg·L-1脯氨酸、300 mg·L-1
水解酪蛋白、30 g·L-1蔗糖、8 g·L-1琼脂, 激素为
6-BA (0.5、1.0、1.5 mg·L-1)和NAA (0.1、0.2、0.5
mg·L-1), 配比组合9种不同的分化培养基。培养温
度为(25±3) ℃, 光照强度为20~40 µmol·m-2·s-1, 光照
时间为14 h·d-1。每50块愈伤组织为一个处理, 每个
处理重复3次。
2.4 生根及移栽
待小苗长至1~2 cm高时, 将其转至生根培养
基中生根, 以培养出完整的小植株。以1/2MS为基
本培养基, 附加30 g·L-1蔗糖及8 g·L-1琼脂, 设置
NAA浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg·L-1, 40
d后统计生根数和生根率, 并详细记录生根情况。
每个浓度处理10瓶, 重复3次。
取生根培养40~45 d根系发达、植株高为
3.0~4.0 cm的枇杷叶荚蒾试管苗, 预先在室内进行
开盖炼苗3 d, 洗净根部附着的培养基, 放入0.1%多
菌灵溶液中浸泡消毒15 min, 用适量的清水培养数
天后移栽。
2.5 数据统计分析
污染率 = (污染外植体数 /接种外植体总
数)×100%; 愈伤组织诱导率=(出愈外植体数/接种
外植体总数)×100%; 愈伤组织分化率=(分化出再
生苗的愈伤组织块数/愈伤组织块总数)×100%; 生
根率=(生根的苗数/接种苗数)×100%。使用SPSS
13.0软件统计数据并进行差异显著性分析。
实验结果
1 不同灭菌处理时间对外植体灭菌效果的影响
由于枇杷叶荚蒾叶片表面有较多绒毛, 灭菌
不易彻底。采取75%酒精和0.1% HgCl2处理叶片,
筛选最佳的灭菌组合。由表2可以看出, 不同消毒
时间处理之间差异明显, 随HgCl2消毒时间的增加,
污染率明显下降, 但时间过长成活率却下降, 以处
理7的组合最好, 污染率为7.5%, 成活率达91.25%,
既能保持外植体生活力又能有效地控制污染率。
处理8、11和12虽然能降低污染率, 但可能由于消
毒时间过长, 外植体有脱水现象, 成活率下降。因
此, 综合污染率和诱导率两方面的因素考虑, 75%
酒精20 s和0.1% HgCl2消毒处理12 min最为合适。
表1 正交设计因素水平
Table 1 Factors and levels by using orthogonal design
水平
因素
6-BA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 2,4-D浓度/mg·L-1
1 0.5 0.1 0.5
2 1.0 0.25 1.0
3 1.5 0.5 1.5
袁云香: 枇杷叶荚蒾的愈伤组织诱导及植株再生 1207
表2 不同灭菌处理时间对外植体的影响
Table 2 Effects of different sterilization time on explants
编号
75%酒精 0.1% HgCl2
接种数/块 污染数/块 污染率/% 成活数/块 成活率/%
消毒时间/s 消毒时间/min
1 15 8.0 80 57 71.25 21 26.25
2 15 10.0 80 33 41.25 41 51.25
3 15 12.0 80 20 25.00 57 71.25
4 15 15.0 80 18 22.50 63 78.75
5 20 8.0 80 26 32.50 50 62.50
6 20 10.0 80 21 26.25 57 71.25
7 20 12.0 80 6 7.50 73 91.25
8 20 15.0 80 5 6.25 69 86.25
9 25 8.0 80 24 30.00 51 63.75
10 25 10.0 80 15 18.70 58 72.50
11 25 12.0 80 5 6.25 45 56.25
12 25 15.0 80 4 5.00 20 25.00
HgCl2是植物组织培养过程中最理想的消毒剂, 但
由于其对外植体有毒, 因此处理的时间不宜过长
或过短, 过长不利于外植体愈伤组织诱导, 过短灭
菌不彻底。
2 不同浓度6-BA、2,4-D和NAA对枇杷叶荚蒾愈
伤组织诱导的影响
外植体在正交设计筛选的不同激素组合培养
基上诱导培养7 d后, 叶脉接近培养基处变白, 由于
枇杷叶荚蒾为木本植物 , 部分叶片出现褐化现
象。培养至10 d左右, 叶片基部膨大明显, 20 d左右
就能在叶片基部开始看到淡绿色结构致密的颗粒
状愈伤组织, 这些愈伤组织逐渐长大, 30 d左右, 整
个叶片下部愈伤组织化(图1-A和B)。表3结果显
示, 6-BA、2,4-D和NAA配比的培养基组合均可诱
导出愈伤组织。最佳诱导组合为: 因素1的2水平+
因素2的2水平+因素3的2水平。因此, 枇杷叶荚蒾
愈伤组织诱导的最佳培养基为 : MS+6-BA 1.0
mg·L-1+NAA 0.25 mg·L-1+2,4-D 1.0 mg·L-1, 诱导率
最高达92%左右。在这3个因素中, 对愈伤组织诱
导率影响的主次关系为6-BA>2,4-D>NAA, 即
6-BA对于枇杷叶荚蒾愈伤组织诱导率的增加有着
更为重要的作用。当6-BA在0.5~1.0 mg·L-1范围内,
愈伤组织诱导率逐渐提高, 诱导出的愈伤组织淡
绿色, 生长速度较快, 其中编号为4~6的诱导率达
到80%以上; 当6-BA浓度达1.5 mg·L-1时, 叶片基部
出现的愈伤组织量少, 生长速度慢, 诱导率下降。
图1 枇杷叶荚蒾的愈伤组织诱导及植株再生
Fig.1 Callus induction and plant regeneration of V. rhytidophyllum
A: 叶片外植体; B: 愈伤组织诱导; C、D: 愈伤组织分化; E~G: 再生芽萌发; H: 不定芽生根。
植物生理学报1208
表4的方差分析结果表明, 6-BA和2,4-D各水
平间的诱导率差异极显著, F值
叶荚蒾愈伤组织诱导过程中, 不添加NAA对诱导
率影响不大。
6-BA浓度为0.5~1.5 mg·L-1时, 分化率呈增高趋势,
诱导出的芽绿色健康, 生长速度较快, 其中7号处
理的组合分化率最高, 达到87.52%; 当6-BA为2.0
mg·L-1时, 愈伤组织生长速度快, 但分化率有所下
降, 芽生长缓慢, 部分出现玻璃化(表5)。可见, 在
培养基MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 0.2 mg·L-1上的
芽分化率最高, 且不定芽生长健壮, 长势较好。
表3 不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导的影响
Table 3 Effects of different plant growth
regulators on callus induction
编号
6-BA浓度/ NAA浓度/ 2,4-D浓度/ 诱导率/
mg·L-1 mg·L-1 mg·L-1 %
1 0.5 0.1 0.5 57
2 0.5 0.25 1.0 68
3 0.5 0.5 1.5 62
4 1.0 0.1 1.0 92
5 1.0 0.25 1.5 87
6 1.0 0.5 0.5 83
7 1.5 0.1 1.5 67
8 1.5 0.25 0.5 63
9 1.5 0.5 1.0 72
x–1 62.33 72.00 67.67
x–2 87.33 72.67 77.33
x–3 67.33 72.33 72.00
R 25.00 0.67 9.66
表4 愈伤组织诱导的正交试验结果方差分析
Table 4 Analysis of variance for results from orthogonal
experiment of callus induction
方差来源 自由度 平方和 均方 F值 P值
6-BA 2 1050 525 1575 0.000635
NAA 2 0.6667 0.3333 1 0.5
2,4-D 2 140.6667 70.3333 211 0.004717
误差 2 0.6667 0.0048
总和 8 1192
3 不同浓度6-BA和NAA对枇杷叶荚蒾愈伤组织分
化的影响
将愈伤组织接种到附加不同浓度6-BA和
NAA组合的分化培养基上, 进行分化培养。培养
10 d左右, 不同分化培养基上愈伤组织都变得较疏
松, 体积增大, 生长状态良好, 颜色呈淡绿色; 20 d
左右, 部分愈伤组织开始呈现绿色小颗粒状(图1-C
和D); 35 d左右, 部分愈伤组织开始分化出绿色芽
点, 顶端生出嫩芽(图1-E~G)。经过40 d分化培养
后, 统计不定芽数量及其生长状况, 结果表明, 当
表5 不同浓度6-BA和NAA对愈伤组织分化率的影响
Table 5 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA
on differentiation rate of callus
编号 6-BA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 分化率/%
1 0.5 0.1 39.20±27.60a
2 1.0 0.1 53.80±1.39c
3 1.5 0.1 62.26±2.21d
4 2.0 0.1 46.28±1.21b
5 0.5 0.2 42.90±1.78ab
6 1.0 0.2 56.18±1.83c
7 1.5 0.2 87.52±1.93f
8 2.0 0.2 52.86±1.20c
9 0.5 0.5 63.34±1.35d
10 1.0 0.5 66.44±3.02d
11 1.5 0.5 73.58±1.82e
12 2.0 0.5 41.98±2.80ab
不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。表6同此。
4 枇杷叶荚蒾根的诱导及移栽
将2 cm左右的枇杷叶荚蒾小苗接种至附加不
同浓度NAA的1/2MS生根培养基上, 15 d左右开始
诱导出白色根尖, 20 d后基部都能生根(图1-H)。
NAA浓度为0.1~1.0 mg·L-1时, 再生植株生长良好,
茎干粗壮, 根多而长, 呈辐射状生长, 基部有少许
愈伤组织化, 生根率达85%, 较低浓度NAA诱导的
生根率偏低; NAA浓度为1.5~3.0 mg·L-1时, 生根条
数较多, 部分根基部膨大, 出现大量愈伤组织, 甚
至分化出小苗, 生根时间推迟, 根较细长(表6)。综
合生根率、生根条数以及植株的生长状态, 枇杷
叶荚蒾最佳生根培养基为1/2MS+NAA 1.0 mg·L-1。
由于枇杷叶荚蒾为木本植物, 生根时间较长, 平均
根长5 cm时可以进行炼苗、移栽, 容易成活。
讨 论
在植物组织培养中, 建立无菌系需要对外植
体进行消毒处理, 对于某些污染难以控制的植物,
袁云香: 枇杷叶荚蒾的愈伤组织诱导及植株再生 1209
外植体灭菌显得相当关键。由于枇杷叶荚蒾叶片
表面有较多星状绒毛, 在进行消毒处理时, 表面杂
菌不易消除, 灭菌剂与叶片难以充分接触, 致使培
养过程中容易污染。本实验对枇杷叶荚蒾叶片进
行了不同灭菌时间处理来控制污染 , 结果显示 ,
75%酒精20 s和0.1% HgCl2 12 min的消毒处理效果
较好, 污染率降到7.5%, 成活率为91.25%。
试验采用不同种类和不同浓度的植物生长调
节剂配比, 以筛选适宜枇杷叶荚蒾的最佳培养基
配方。在愈伤组织诱导过程中, 不同植物对生长
调节剂的种类和浓度要求差别很大 (杨精华等
2012)。其中2,4-D是诱导愈伤组织最常用的生长
素, 但单独使用时会导致愈伤组织生长迟缓且易
老化, 与细胞分裂素6-BA配合使用, 可促进愈伤组
织的生长增殖。在本实验中 , 采用不同浓度的
6-BA、NAA和2,4-D组合对枇杷叶荚蒾叶片外植
体进行愈伤组织诱导, 结果发现适量的6-BA与
2,4-D配合可以促进愈伤组织的诱导, 而NAA对其
影响不大。由于枇杷叶荚蒾是木本观赏植物, 在
诱导培养过程中叶片很容易褐变, 主要是由于酚
类物质对外植体产生毒害作用, 从而影响外植体
愈伤组织诱导率, 有的甚至导外植体褐变死亡。
试验中为了防止褐化的发生, 加入了PVP及一些有
机附加物质(如水解酪蛋白), 发现褐化现象有所减
轻。
通过调节细胞分裂素和生长素的比例, 可以
有效控制器官的分化和生长。本试验以不同浓度
的6-BA和NAA组合对枇杷叶荚蒾愈伤组织分化进
行了研究, 发现在同一NAA浓度下, 其分化率随适
当范围内6-BA浓度的升高而提高; 这与杨精华等
(2012)的研究结果一致。本实验通过对叶片进行
愈伤组织诱导, 建立了枇杷叶荚蒾离体再生体系,
为短时间内快速繁殖枇杷叶荚蒾苗木以满足市场
需求打下基础, 对丰富我国北方城市常绿阔叶树
种有积极的作用。
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表6 不同浓度NAA对试管苗生根的影响
Table 6 Effects of different concentrations of NAA on
rooting of regenerated plantlets
编号 NAA浓度/mg·L-1 生根数/条 生根率/%
1 0.1 11.00±1.15a 38.00±1.15a
2 0.2 17.00±1.15b 44.67±0.88b
3 0.5 21.33±1.45c 62.67±1.45c
4 1.0 29.00±1.15e 85.00±2.31e
5 1.5 24.67±0.58d 72.00±1.15d
6 2.0 21.67±1.53cd 61.67±1.20c
7 2.5 18.67±1.53bc 40.33±2.19b
8 3.0 16.67±1.53b 56.08±3.34ab