全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (11): 1079~1083 1079
收稿 2012-09-26 修定 2012-11-02
* 通讯作者(E-mail: dongleah@yahoo.com.cn; Tel: 010-82375031)。
球子蕨孢子的无菌繁殖
张婷婷, 王晓倩, 高凤, 董丽*
北京林业大学园林学院, 国家花卉工程技术研究中心, 北京100083
摘要: 以球子蕨成熟孢子为外植体, 研究了不同激素及浓度对其孢子萌发、愈伤组织诱导、丛生芽分化及生根的影响。结
果表明: 孢子萌发最适培养基为1/2MS+2%蔗糖, 20 d后萌发率达55.7%; 诱导愈伤组织的最适培养基为MS+0.5 mg·L-1
KT+0.5 mg·L-1 2,4-D, 诱导率达36%, 愈伤组织为绿色颗粒状; 颗粒状愈伤组织在不添加激素的MS培养基中即可生长出大量
丛生芽, 转化率可达49.3%; 低浓度(0.2 mg·L-1)的IAA可有效促进幼孢子体苗生根。
关键词: 球子蕨; 孢子; 愈伤组织诱导
In Vitro Culture of Onoclea sensibilis L. from Spores
ZHANG Ting-Ting, WANG Xiao-Qian, GAO Feng, DONG Li*
National Engineering Research Center for Floriculture, College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University, Beijing
100083, China
Abstract: With mature spores of Onoclea sensibilis as the explants, the effects of different kinds and
concentrations of plant growth regulator combination in MS medium on spore germination, callus induction,
bud differentiation and rooting were studied. The results showed that the most suitable medium for spore
germination was 1/2MS+2% sucrose, and after 20 days of spore sowing on this medium, the germination rate
was 55.7%. The maximum callus induction rate was 36% which obtained from medium of MS+0.5 mg·L-1
KT+0.5 mg·L-1 2,4-D. The form of callus was green granular; the induced rate of bud from granular callus was
49% in MS. And IAA can promote rooting rate effectively.
Key words: Onoclea sensibilis; spore; callus induction
观赏蕨类叶形奇特多样, 形态优美精致, 已
逐渐成为当今世界花卉产业的一个重要组成部
分。国内对蕨类繁殖技术的研究起步晚, 园林中
应用的部分蕨类多是采用野外采挖和国外进口等
方法获得种苗, 因此研究观赏蕨类植物的快速繁
殖技术既可满足日益增长的市场需要, 又可有效
保护野生植物资源与生态环境。
蕨类植物的组织培养技术可采用孢子或嫩茎
尖等材料作为外植体, 由于蕨类孢子的产量高、
体积小、易保存、易消毒, 这就为建立一个快捷
有效的蕨类无菌繁殖体系提供了基础, 因此使用
更为广泛。 已有很多研究者以孢子为外植体成功
建立了一些蕨类的再生体系 , 如假鞭叶铁线蕨
(Adiantum malesianum) (罗顺元和王任翔2007)、
蛇足石杉(Huperzia serrata) (包日双等2012)和楔叶
铁线蕨(Adiantum raddianum) (曾宋军等2005)。
球子蕨是球子蕨科球子蕨属植物, 分布于我
国东北、华北地区; 性耐寒, 喜湿润; 生于草甸
或湿灌丛中。球子蕨在园林中常用作假山石的
配景植物, 也可配置于建筑物之背阴角隅, 还可
盆栽用作室内观叶植物, 观赏价值较高。国内外
学者曾对球子蕨孢子形态(李娜和谢寅堂1992)、
孢子分裂方式和光质对孢子萌发的影响(Fisher
1979)、二氧化碳对孢子萌发的影响 (Edwards
1977)等方面进行过研究。但目前尚未见对于其
繁殖技术方面的研究报道。本论文研究了球子
蕨孢子的无菌培养和不同生长素对其愈伤组织
诱导、丛生芽诱导及生根的影响, 试图建立快速
稳定的球子蕨孢子无菌繁殖体系, 为球子蕨规模
化生产及其在园林中的广泛应用奠定基础。
材料与方法
1 材料
球子蕨(Onoclea sensibilis L.)孢子于2008年采
集于吉林省红叶谷内, 收集于硫酸纸袋内并放置
植物生理学报1080
于4 ℃冰箱保存。
2 方法
2.1 孢子的消毒
将孢子置于1.5 mL离心管中, 蒸馏水浸泡1 h,
4000 r·min-1离心5 min, 去上清液; 加入3%的NaClO
溶液进行消毒, 4000 r·min-1离心5 min, 去上清液,
无菌水冲洗4~5次后, 加无菌水稀释, 充分振荡得
到无菌孢子悬浊液, 溶液中孢子密度约为6 000
个·mL-1, 备用。
2.2 孢子的萌发培养
设置MS、1/2MS、1/4MS 3种无机盐, 10、
20、30 g·L-1 3个水平蔗糖浓度, 采用双因子交叉分
组设计, 共9种培养基, pH调至6.0。灭菌后分装至
直径为9 cm的培养皿中。每皿接0.5 mL孢子悬浮
液, 每处理重复3次。培养室温度为(23±2) ℃, 光照
周期为12 h·d-1。在播种20 d后在显微镜下统计孢
子萌发率。
2.3 原叶体愈伤组织的诱导
以MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂为基本培养
基, 加入0.1、0.5、1.0 mg·L-1的KT和0.1、0.5、1.0
mg·L-1的2,4-D, 采用双因子交叉分组设计, 共9种培
养基, pH值调至6.1。将单个原叶体接种到以上9种
培养基的培养皿中, 每皿接种原叶体6~10个, 每个
处理重复3次。接种40 d后统计愈伤组织诱导情
况。
2.4 丛生芽的诱导及增殖
以MS+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1琼脂为基本培养
基, 加入0、0.1、0.5 mg·L-1的6-BA和0、0.1、0.5
mg·L-1的NAA, 采用双因子交叉分组设计, 共9种培
养基, pH值调至6.1。将之前诱导出的愈伤组织切
割成大小一致(约3 mm×3 mm)的团块接种到9种培
养基中, 每瓶接种4块愈伤组织, 重复3次。40 d后
统计丛生芽分化情况。
2.5 生根培养
以之前诱导出的丛生芽为基本材料, 继代到3
种固体培养基MS、MS+0.2 mg·L-1 NAA和MS+0.2
mg·L-1 IAA上, 30 d后统计生根情况。
2.6 炼苗移栽
当孢子体苗根长到约2 cm、茎高约3 cm时,
将封口膜打开, 在通风处炼苗3 d。取出生根苗, 洗
去根部培养基, 移栽到经过高温灭菌的草炭和蛭
石(1:1)的混合基质中, 覆盖保鲜膜保持一定湿度, 1
周后揭膜, 20 d后统计成活率。
实验结果
1 球子蕨孢子萌发
表1表明, 孢子在培养基1/2MS+20 g·L-1蔗糖
中萌发率最高为(55.7±2.1)% (图1-A), 显著高于其
它培养基中的孢子萌发率, 其次为培养基1/4MS+
20 g·L-1蔗糖和1/2MS+10 g·L-1蔗糖, 均为含较低的
无机盐与蔗糖浓度的培养基。高浓度的无机盐与
蔗糖明显抑制了孢子的萌发。
表1 不同无机盐和蔗糖浓度下球子蕨孢子的萌发率
Table 1 The spores germination rate of O. sensibilis in differ-
ent inorganic salt and sucrose concentrations
无机盐 蔗糖浓度/g·L-1 萌发率/%
MS 10 24.3±2.1d
MS 20 25.3±2.5d
MS 30 20.3±4.6d
1/2MS 10 48.0±2.0b
1/2MS 20 55.7±2.1a
1/2MS 30 37.7±2.5c
1/4MS 10 44.7±2.5b
1/4MS 20 49.3±2.5b
1/4MS 30 38.7±4.0c
同一列数字后的不同字母表示0.05水平差异显著; 结果数据=
平均值±标准差。下表同此。
2 KT和2,4-D对球子蕨愈伤组织诱导的影响
通过KT和2,4-D两种激素诱导出的愈伤组织
形态分为两种, 一种愈伤组织呈黄绿色, 质地松软,
表面白色毛状, 整体为一个团块, 组织含水量大(图
1-B); 另一种呈黄绿色至绿色, 表面有很多凸起, 整
体呈颗粒状, 颗粒之间松散, 易分散成更小的颗粒
团块(图1-C)。在后期的试验中发现, 颗粒状愈伤
组织可以在适宜的培养基中继续分化出孢子体苗,
而表面毛状的愈伤组织无法分化出孢子体苗, 只
能在表面继续增殖出原叶体。因此认为颗粒状愈伤
组织为理想的愈伤组织, 并在后续的试验中使用。
表2可以看出, MS+0.5 mg·L-1 KT+0.5 mg·L-1
2,4-D对愈伤组织的诱导效果最好, 愈伤组织呈正
常的颗粒状, 诱导率达到36%, 且后期的生长良
好。随着激素浓度增高, 愈伤组织诱导率变低, 并
出现后期生长不良甚至褐化死亡的现象。
张婷婷等: 球子蕨孢子的无菌繁殖 1081
表2 不同浓度KT和2,4-D对愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of different concentrations of KT and 2,4-D on callus induction
KT浓度/mg·L-1 2,4-D浓度/mg·L-1 愈伤诱导率/% 愈伤生长情况
0.1 0.1 0e 几乎无愈伤组织产生
0.1 0.5 21.0±3.6c 愈伤组织浅黄绿色, 表面白色毛状
0.1 1.0 31.0±3.6ab 愈伤组织浅黄绿色, 表面白色毛状
0.5 0.1 10.3±2.5d 愈伤组织浅黄绿色, 表面白色毛状
0.5 0.5 36.0±3.6a 愈伤组织绿色, 颗粒状, 生长良好
0.5 1.0 13.3±1.5d 愈伤组织绿色, 颗粒状, 生长缓慢
1.0 0.1 20.3±2.5c 愈伤组织浅黄绿色, 表面白色毛状
1.0 0.5 30.3±2.5b 愈伤组织绿色, 颗粒状, 生长良好
1.0 1.0 19.3±4.0c 愈伤组织深绿色, 褐化严重
图1 球子蕨的组织培养
Fig.1 The tissue culture of O. sensibilis
A: 孢子萌发; B: 毛状愈伤组织; C: 颗粒状的愈伤组织; D: 丛生芽; E: 幼孢子体苗生根; F: 幼苗移栽。
3 6-BA和NAA对丛生芽诱导的影响
通过表3的数据可以看出, 不添加任何激素的
MS培养基对愈伤组织分化出芽具有较大的优势,
丛生芽诱导率可以达到49.3% (图1-D)。随着激素
浓度升高, 丛生芽的诱导率逐渐降低。在愈伤组
织分化成芽过程中, 出现部分愈伤组织褐化、新
生成的孢子体苗叶片褐化的现象, 此时要及时将
愈伤组织颗粒进一步分散, 去掉褐化部分, 将长势
良好的孢子体苗置于新MS培养基中, 同时分散的
颗粒状愈伤组织也有利于新丛生芽的出现。
4 激素对幼孢子体苗生根的影响
在不添加激素的MS培养基上培养30 d后, 幼
孢子体苗没有生成根, 而在添加了激素的培养基
上有根生成(图1-E), 表明NAA与IAA对幼苗的生
根具有显著的促进作用, 但两种激素对促进生根
的作用差异不显著(表4)。
5 炼苗移栽
健壮的幼苗长到一定程度时便可进行移栽,
移栽前要将根部培养基清洗干净并将基质灭菌,
由于瓶内湿度较高, 因此移栽初期要覆膜并适度
植物生理学报1082
喷水以保持湿度, 20 d后成活率约为65% (图1-F)。
讨 论
1 无机盐浓度和蔗糖浓度对孢子萌发的影响
蔗糖与无机盐在培养基中既可作为渗透调节
剂又可作为营养物质, 是蕨类孢子萌发的关键因
素。很多研究表明, 培养基中低浓度的无机盐与
蔗糖更利于孢子萌发, 但由于孢子种类不同, 萌发
时需要的营养物质与渗透压并不相同, 也有一些
种类的孢子萌发需要较高浓度的蔗糖与无机盐。
白玉凤尾蕨(Pteris cretica)孢子在蔗糖浓度低
于2%的培养基中更易萌发(徐艳等2005), 含1%的
蔗糖的培养基更适于变异鳞毛蕨(Dryopteris varia)
孢子萌发(欧阳婵娟等2008); 而蕨(Pteridium aquili-
num)孢子在高浓度(5%)蔗糖培养基中的萌发率要
高于低浓度(3%)蔗糖时的萌发率(鲍敏等2000)。
变异鳞毛蕨(D. varia)在1/2MS培养基上孢子
的萌发率要比MS培养基上的高5% (欧阳婵娟等
2008)。黑桫椤(Alsophila podophylla)孢子在
1/10MS或1/5MS培养集中的萌发率(约67%), 要高
于在MS培养基上的萌发率(约60%) (张银丽等
2007)。同样也有一些种类的蕨类孢子萌发需要高
浓度的无机盐含量, 如银粉背蕨(Aleuritopteris ar-
gentea)孢子在MS培养基中萌发率高达53.3%, 而
在1/8MS中不萌发(黄笛等2009)。
本文发现, 球子蕨孢子萌发最适无机盐浓度
为1/2MS+2%蔗糖, 萌发率高达55.7%。整体来看,
较低浓度的蔗糖与无机盐含量更适于孢子萌发,
孢子在无机盐含量不高于1/2MS、蔗糖浓度不高
于2%的培养基中的萌发率均高于40%, 而在MS或
含3%蔗糖的培养基中萌发率显著降低。高浓度的
无机盐与蔗糖使培养基渗透压增高, 阻碍孢子吸
水从而限制了它的萌发。
2 激素对愈伤组织诱导的影响
不同的激素对蕨类植物的分化具有不同作用,
愈伤组织的诱导一般需要细胞分裂素与生长素的
共同作用, 细胞分裂素类物质对诱导外植体的分
化具有很关键的作用。KT与2,4-D或NAA的适当
比例能促进很多种蕨类产生愈伤组织。Yoshihara
等(2005)用KT与2,4-D成功诱导出禾秆蹄盖蕨
(Athyrium yokoscense)愈伤组织。但不同的激素及
浓度会明显影响诱导物的形态, Kwa1等(1997)以
鹿角蕨(Platycerium coronarium)配子体为材料, 用
高浓度的BA或KT分别诱导了2种颜色不同的愈伤
组织, 一种暗绿, 另一种黄绿。在MS基本培养基
上, 暗绿的愈伤组织会分化出配子体, 黄绿的愈伤
组织会分化出孢子体。本试验中KT与2,4-D不同
浓度的组合也诱导出了两种形态的愈伤, 一种颗
粒状愈伤组织, 可以分化出孢子体, 另一种表面被
毛的膨大愈伤组织只能继续增殖原叶体。在诱导
愈伤组织过程中, 激素种类及浓度的选择使用极
为关键。
3 激素对丛生芽分化的影响
本试验中, 颗粒状愈伤组织的再生芽诱导以
无激素培养的诱导率最高, 高浓度的激素反而使
诱导率降低。李静等(2008)在对狭眼凤尾蕨(Pt-
eris biaurita)的组培研究中也发现, 在诱导出狭
眼凤尾蕨愈伤组织后, 仅调控培养基中的蔗糖浓
度, 而不添加任何激素即可使愈伤组织分化出幼
孢子体苗。蕨菜(Pteridium aquilinum)诱导愈伤
组织芽分化的最适培养基为1/2MS, 芽分化率可
达100% (姜长阳等2003)。
本试验通过对球子蕨孢子的无菌培养, 研究
表3 不同浓度6-BA和NAA对诱导丛生芽的影响
Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA
on buds induction
6-BA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 丛生芽诱导率/%
0 0 49.3±5.1a
0 0.1 47.7±2.5a
0 0.5 40.0±2.0b
0.1 0 25.7±2.1c
0.1 0.1 41.0±3.6b
0.1 0.5 37.0±3.6b
0.5 0 20.0±2.0d
0.5 0.1 30.3±2.5c
0.5 0.5 20.3±2.5d
表4 NAA与IAA对诱导生根的影响
Table 4 Effects of NAA and IAA on roots induction
NAA浓度/mg·L-1 IAA浓度/mg·L-1 生根数/条 生根率/%
0 0 0b 0
0.2 0 3.1±0.5a 72.5
0 0.2 3.3±0.5a 70.0
张婷婷等: 球子蕨孢子的无菌繁殖 1083
了不同因素对孢子萌发、原叶体愈伤组织诱
导、丛生芽分化及生根的影响, 建立了快速繁殖
的组培体系, 为球子蕨的规模化生产提供了理论
基础。
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