全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月1160
收稿 2009-09-08 修定 　2009-11-30
资助 黑龙江省重点科技攻关项目(GB06B303-5)。
* 通讯作者(E-mail: tbjiang@yahoo.com; Tel: 0451-82190607)。
小黑杨环锌指蛋白基因的克隆与表达分析
王雷, 周博如, 吴丽丽, 吕澈妍, 曲跃军, 郑威, 姜廷波*
东北林业大学林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室, 哈尔滨 150040
提要: 用 cDNA-AFLP 技术从小黑杨中克隆与盐胁迫反应相关的 cDNA片段, 进一步应用RACE技术克隆出具有完整开放
读码框的小黑杨环锌指蛋白基因(PsnRZF), 该基因全长 1 061 bp, 其中 5非翻译区为 184 bp, 3非翻译区为 82 bp, 开放读码
框为795 bp, 编码264个氨基酸, 预测蛋白的分子量为30.25 kDa, 理论等电点为8.04。实时定量PCR检测的结果显示, 正常
生长条件下该基因在根、茎、叶中都表达; NaCl胁迫下, 该基因在根、茎、叶中的表达量升高。在叶中的表达量随着处理
时间的延长而逐渐升高, 胁迫处理后第6天表达量达到最高。
关键词: 小黑杨; 环锌指蛋白; RACE; 实时定量PCR
Cloning and Expression Analysis of a Ring Zinc-Finger Gene in Populus
simonii×P. nigra
WANG Lei, ZHOU Bo-Ru, WU Li-Li, LÜ Che-Yan, QU Yue-Jun, ZHENG Wei, JIANG Ting-Bo*
Key Laboratory of Forest Tree Genetic Improvement and Biotechnology, Ministry of Education, Northeast Forest University,
Harbin 150040, China
Abstract: For studies of differential gene expression, cDNA-AFLP was applied in Populus simonii×P. nigra
under salt-stress. The 1 061 bp full length cDNA of ring zinc-finger gene was isolated by rapid amplification of
cDNA ends (RACE), including a 184 bp 5 untranslated region, an 82 bp 3 untranslated region and a 795 bp open
reading frame encoding 264 amino acid residues. The molecular weight of deduced protein was 30.25 kDa with
a theoretical pI of 8.04. Real-time PCR revealed that PsnRZF gene was expressed in roots, stems and leaves
under normal growth, and the expression level was increased under salt-stress. The expression level of PsnRZF
gene in leaves was increased gradually and the peak value was appeared at the 6th day under NaCl stress.
Key words: Populus simonii×P. nigra; ring zinc finger; RACE; real-time PCR
锌指蛋白(zinc finger protein, ZF)最早于 1985
年在非洲爪蟾卵母细胞的转录因子中发现(Miller等
1985), 现已证实其广泛存在于植物、动物和真菌
中。锌指蛋白除具有转录因子(如 C2H2型、C4
型、C6型)的功能以外, 还参与mRNA的成熟剪接
和降解。此外, 锌指蛋白(如 C2HC5型、C4HC3
型、C3HC4型)还可作为蛋白适配器特异地介导蛋
白间的互作(Berg和 Shi 1996), 在基因表达调控、
细胞分化、胚胎发育和增强植物抗逆性中都有作
用。环锌指蛋白(ring zinc finger protein, RZF)最早
由Lovering等(1993)发现的, 它具有典型的C3HC4
保守序列, 保守区由 40~60个氨基酸组成, 富含半
胱氨酸和组氨酸, 可结合两个锌原子。由于此蛋白
的性质不稳定, 容易聚合, 对其功能的研究尚不深
入, 初步研究表明, 此蛋白可与其他蛋白相互作用,
参与信号转导或蛋白质泛素化降解(Borden 2000;
Aravind等 2003)。迄今人们已在水稻(Ma等 2009)
和巴西橡胶树(Zhu等2006)中克隆了C3HC4型环锌
指蛋白基因。Zeba等(2009)报道, 大多非生物胁迫
因素均可诱导甜椒环锌指蛋白的表达, 将甜椒中的
C3HC4型环锌指蛋白基因导入烟草后, 转基因植株
的生长量明显高于非转基因植株。Schumann等
(2007)的研究表明, 拟南芥中的一种C3HC4型环锌
指蛋白(PEX10)在光呼吸的过程中也起作用。
小黑杨是小叶杨与欧洲黑杨的杂交种, 1959年
由中国林科院培育, 现在在黄河流域及其以北的广
大地区均有栽植。小黑杨生长快, 轻度耐盐碱, 材
质细密, 可用于造纸、民用建筑等, 是平原地区绿
化和造林树种。小黑杨的研究早期多集中于引种
与栽培(刘志明 1988; 朴志勇等 2004), 近些年关注
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的热点多集中于采用转基因的技术提高小黑杨抗病
性(张福丽 2006)、抗虫性(常玉广 2004; 范海娟等
2006)和耐盐性(刘桂丰等 2006)的研究。本文用
cDNA- AFLP (cDNA amplified fragment length
polymorphism)技术研究NaCl胁迫下小黑杨基因的
表达, 以及与小黑杨盐应答密切相关的基因, 并以
此为基础, 克隆小黑杨环锌指蛋白( P o p u l u s
simonii×P. nigra ring zinc finger protein, PsnRZF)基
因的全长 cDNA, 进一步研究该基因在根、茎、叶
中的表达以及NaCl胁迫过程中的表达变化, 以供研
究小黑杨盐胁迫下基因应答机制和环锌指蛋白的功
能时参考。
材料与方法
植物材料为小黑杨(Po pulu s s i moni i×P.
nigra)。将从温室中取材的同一无性系小黑杨穗条
进行水培, 于人工气候室中培养, 昼 / 夜温度为
26 ℃/22 ℃, 光照 16 h·d-1, 光照强度 175 μmol·m-2·s-1,
相对湿度约 75%。生长 40 d左右, 长出新的根和
叶片, 将其分成两组, 一组作为对照于正常条件下
培养, 另一组用 200 mmol·L-1 NaCl进行胁迫处理,
分别在胁迫开始时(第 0天)和胁迫后的第 1、2、
4、6、8 天中取小黑杨的根、茎、叶, 每组重
复3次, 用蒸馏水清洗, 拭干后置于液氮中, 于 –70 ℃
中保存备用。
用 SDS法(王玉成 2005)分别提取小黑杨根、
茎、叶中的 RNA, 按照 Reverse Transcriptase M-
MLV进行反转录。胁迫处理后第 2天小黑杨的
RNA按照M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (大连
宝生物工程有限公司)合成双链 cDNA后, 进行
cDNA-AFLP和差异条带的扣除, 方法见 LI-COR
4300 AFLP Expression Analysis Kit。
扣除的差异条带回收后重新进行选择性扩增,
PCR产物纯化后与pMD19-T载体连接, 转化大肠杆
菌 JM109感受态细胞, 在含有Amp/IPTG/X-gal的
平板上进行蓝白斑筛选, 挑取阳性克隆进行PCR检
测后, 送至上海生工生物工程技术服务有限公司进
行测序。测序结果进行 Blast比对。
采用5/3 RACE Kit, 2nd Generation (Roche)方
法对盐胁迫下小黑杨差异 cDNA片段 88号进行 5
和 3克隆。用 SYBR Premix ExTaq试剂盒(购于
大连宝生物工程有限公司)进行实时定量 P C R
(Real-time PCR) (黄留玉2005; Wang等2006), 所得
数据利用 SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析
Duncan检验(林杰斌等 2002)。
结果与讨论
1 NaCl胁迫下的小黑杨cDNA-AFLP分析
采用 64对引物组合进行叶片 cDNA-AFLP分
析的结果(图1)表明: 从LI-COR4300检测的图像上
可以看到, 共获得4 407条片段, 其中差异片段2 027
条, 随机挑选145条差异片段进行回收和二次扩增,
其中成功扩增、克隆和测序的有 96条。Blast-X
比对结果表明, 与已知基因同源的片段有72条, 占
测序数的 75%; 编码未知功能蛋白的基因有 14条,
约占测序数的14.6%; 另有10条片段与已知基因或
序列无任何同源性, 约占测序数的 10.4%。图 1箭
头所指为第 88号差异片段, 引物组合为 T2M1 (T-
TG/M-CT)。
2 小黑杨环锌指蛋白基因全长 cDNA的克隆
在所获得的差异片段中, 88号差异片段长度为
326 bp, 经 Blast比对发现, 该片段具有典型的环锌
指蛋白保守序列, 将含此片段的基因命名为PsnRZF
基因, 对此 cDNA片段设计特异引物, 分别采用
5/3 RACE (rapid amplification of cDNA ends)的方法
扩增PsnRZF基因的5/3 端, 3 RACE得到一条630
bp的条带(图 2), 5 RACE得到一条 404 bp的片段
(图 3)。
3 小黑杨环锌指蛋白的基因及其推导编码蛋白的
生物信息学分析
经电子拼接获得带有PolyA的全长cDNA序列
为 1 061 bp (图 4)。采用NCBI中的ORF程序显
示 5非翻译区为 184 bp, 3非翻译区为 82 bp, 开放
读码框为 795 bp, 编码 264个氨基酸。
经过 ProtParam计算PsnRZF基因编码的蛋白
质分子量为 30.25 kDa, 理论等电点为 8.04, 此基因
编码的 264个氨基酸中Leu最多, 占氨基酸总数的
10.6%。带负电荷的氨基酸(Asp+Glu)有 26个, 带
正电荷的氨基酸(Arg+Lys)共有 28个。不稳定系
数为 47.18, 该蛋白是不稳定蛋白。SignalP3.0预
测该蛋白没有信号肽, 为非分泌型蛋白。用NCBI
的保守功能区域(conserved domains)分析程序预测
基因的保守区, 结果表明该基因为环锌指蛋白超家
族基因, 保守区位于第 58~104氨基酸之间。经
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图 1 NaCl胁迫下的小黑杨 cDNA-AFLP分析
Fig.1 cDNA-AFLP analysis of P. simonii×P. nigra under NaCl stress
T/M为不同的引物组合; a 和 b分别为小黑杨对照组和处理组叶片; 箭头所指为第 88 号差异片段(T2M1)。
图 2 PsnRZF 3 RACE扩增产物
Fig.2 3 RACE product of PsnRZF cDNA
M: DL2000分子量标准; 1: 3 RACE扩增产物。
图 3 PsnRZF 5 RACE扩增产物
Fig.3 5 RACE product of PsnRZF cDNA
M: DL2000分子量标准; 1: 5 RACE扩增产物。
Motif Scan 程序分析此蛋白具有 6个酪氨酸激酶 II
磷酸化位点(casein kinase II phosphorylation site)、
4个N-糖基化位点(N-glycosylation site)、5个蛋白
激酶C磷酸化位点(protein kinase C phosphorylation
site)和2个N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)。
PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/)亚细胞定位预测的结
果显示: 小黑杨环锌指蛋白定位于质膜的可信度为
0.6, 定位于高尔基体的可信度为 0.4, 定位于叶绿
体类囊体膜的可信度为0.385, 定位于内质网膜的可
信度为 0.3。通过 TMHMM Service 2.0预测该蛋
白第 1~169氨基酸和第 222~264氨基酸在膜的内
部, 第 170~189氨基酸和第 199~221氨基酸为跨膜
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区, 第 190~198位氨基酸暴露于膜外, 在其跨膜区
和膜外区存在着糖基化位点, 膜内部区域含有酪氨
图 4 小黑杨 PsnRZF基因 cDNA核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
Fig.4 The nucleotide and deduced amino acid sequence of PsnRZF cDNA from P. simonii×P. nigra
酸激酶Ⅱ磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点, 这
些位点都与信号转导密切相关。
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锌指蛋白种类繁多, 根据与锌离子结合的保守
性氨基酸残基 Cys和His的不同组合, 人们把锌指
结构分为 C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、
C2HC、C3H以及联合型等多种类型(Gamsjaeger等
2007)。BlastP比对表明小黑杨环锌指蛋白与拟南
芥(Arabidopsis thaliana) C3HC4型环锌指蛋白
(NP_671763)同源性为 73%, 与蓖麻(Ricinus
communis, XP_002534507)、玉米(Zea mays,
NP_001148808)、水稻(Oryza sativa, BAD87554)
环锌指蛋白的同源性分别为 78%、57%、52% (图
5)。用 ClustalX1.83构建锌指蛋白系统进化树, 从
图6构建的进化树中也可看到, 小黑杨环锌指蛋白
与拟南芥、蓖麻C3HC4型环锌指蛋白亲缘关系较
近, 与拟南芥其他类型锌指蛋白的亲缘关系较远, 推
测小黑杨PsnRZF基因编码的蛋白质可能为C3HC4
型环锌指蛋白。
图 5 小黑杨环锌指蛋白与其他植物环锌指蛋白的序列比较
Fig.5 Alignment of the amino acid sequences of RZF protein between P. simonii×P. nigra and other plants
图中黑框区域为环锌指蛋白的保守区。
4 NaCl胁迫下小黑杨环锌指蛋白基因的表达分析
为研究小黑杨环锌指蛋白基因在盐胁迫下的
应答, 用Real-time PCR检测NaCl胁迫前后PsnRZF
基因在根、茎、叶中表达的结果(图 7)表明: 在正
常生长状态下, PsnRZF基因在根、茎、叶中均表
达。在NaCl胁迫条件下, PsnRZF基因表达量在
根、茎、叶中均升高, 在根中表达量变化并不显
著, 随着胁迫时间的延长, PsnRZF基因在茎和叶中
的表达量逐渐升高。此基因在叶中表达量的变化
最为明显, 在胁迫后第 2和 4天显著高于对照(P＜
0.05), 在胁迫后的第 6天, 此基因的相对表达量达
到最高, 极显著地高于对照(P＜ 0.01)。胁迫后的
第 4、6、8天, PsnRZF基因在茎中的相对表达量
显著高于对照(P＜ 0.05)。
小黑杨 PsnRZF基因在不同器官中表达量变
化存在差异, 这可能是由于此基因编码的环锌指蛋
白参与的很多生理反应主要是在叶中进行, 如光呼
吸(Schumann等 2007), 所以PsnRZF基因在叶中的
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表达量变化最为明显。随着NaCl胁迫时间的延长,
PsnRZF基因的表达量也随之升高, 说明盐胁迫影
响了该基因的表达, PsnRZF可能在盐胁迫应答过程
中发挥作用。植物在逆境胁迫时, 体内会积累很多
物质, 如信号分子ABA, 有研究表明环锌指蛋白可
能参与ABA介导的信号转导过程(Ma等2009)。随
着盐胁迫时间的延长, 体内信号分子不断积累,
PsnRZF基因表达量升高, 作为信号受体的PsnRZF
数目增多, PsnRZF作为信号受体与信号分子互做,
从而调控盐应答基因的表达。但小黑杨环锌指蛋
图 6 锌指蛋白的进化树
Fig.6 The phylogenetic tree of ZF
图 7 NaCl胁迫下小黑杨 PsnRZF基因在
根、茎、叶中的表达
Fig.7 The expression levels of PsnRZF gene in roots, stems
and leaves under NaCl stress
白(PsnRZF)与哪类信号分子互作, 以及这种互作调
控哪些基因的表达都有待进一步研究。
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