全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (3): 259–268　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0575 259
收稿 2015-10-21　　修定 2016-01-28
资助 国家自然基金(31372033)、国家科技基础性工作专项(2012,
FY110100-5)和山西省青年科技研究基金(2015021153)。
* 通讯作者(E-mail: qiufengcao@163.com)。
低温诱导下苹果花药差异表达基因分析
罗慧珍1,2, 邓舒3, 张春芬3, 肖蓉3, 王卉4, 孟玉平2, 曹秋芬1,2,*
1山西大学生物工程学院, 太原030006; 2山西省农业科学院生物技术研究中心, 太原030031; 3山西省农业科学院果树研究所,
山西太谷030815; 4山西省农业科学院科研处, 太原030031
摘要: 低温处理是苹果花药培养诱导胚状体形成的关键步骤, 花药中的小孢子在经过一定时间的低温诱导后才能获得胚性
潜能。本文通过转录组测序的方法对低温处理前和低温处理30 d的苹果花药进行研究, 分析低温诱导条件下花药中的差异
表达基因。结果表明: 转录组测序共得到10.90 Gb的Clean Data。基因表达分析结果显示, 共有4 105个基因发生差异表达,
包括表达上调基因1 849个, 表达下调基因2 256个。注释到GO、COG、KEGG、Swiss-Prot和nr数据库的差异表达基因分
别有3 325个、1 504个、733个、2 993个和3 758个。差异表达基因主要富集在与糖类代谢和激素信号转导有关的过程中,
其中在淀粉和蔗糖代谢、植物激素信号转导这两个代谢通路中富集的差异表达基因最多。筛选出的差异表达基因中控制
蔗糖合成、细胞分裂素、脱落酸和油菜素内酯信号转导的相关基因表达量上调, 控制淀粉合成、生长素信号转导的相关
基因表达量下调。差异表达基因的荧光定量PCR结果显示测序结果和实际结果变化趋势完全一致。由此可见, 苹果花药
经低温诱导后, 影响蔗糖、淀粉生物合成和生长素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯信号转导相关基因的表
达变化是影响小孢子获得胚性潜能的关键。
关键词: 苹果花药; 胚状体; 转录组测序; 差异表达基因; 荧光定量PCR
单倍体育种作为获得纯合基因型的一种有效
手段, 在果树育种和遗传特性分析中具有重要意
义。关于苹果单倍体的研究报道中, 国外Höfer等
人从20世纪90年代研究开始, 到2008年通过花药
培养和小孢子培养仅获得144株单倍体来源的植
株(Höfer等1999, 2004, 2005, 2008); 在随后的研究
中, 由于再生植株与供体植株相比形态特征发生
变化, 结实率较低, 因而至今并没有应用于育种生
产(Höfer和Flachowsky 2015)。国内在20世纪后期
曾有关于获得苹果单倍体植株的报道, 但相关实
验中并没有植株来源方面的鉴定 , 也未得到大
量、有效的验证以及后续相关报道。因此, 目前
有关苹果单倍体的育种研究仍有很多问题亟待解
决。花药培养作为单倍体育种的主要途径之一,
能够通过胚发生或器官发生两个途径形成完整植
株(李守岭和庄南生2006), 其中胚状体具有直接分
化成苗的特点, 成苗时间短且成活率高, 能更有效
提高植株再生效率(张洁等2002)。同时, 在培养前
对花药进行一定条件的预处理, 如低温、高温、
射线、甘露醇、饥饿处理等(其中低温冷藏应用最
为广泛) (Shariatpanahi等2006; Germanà 2011), 能
够提高花粉发育成植株的诱导效率(李守岭和庄南
生2006)。
本课题组在苹果花药培养的前期研究中发现,
对进行4°C低温预处理30 d后的花药再培养, 可诱导
花药不经过愈伤直接形成胚状体(Zhang等2013)。
但此时花药内小孢子改变发育途径获得胚性潜能
的分子机制尚不清楚, 其中的特异表达基因还有
待研究。本研究利用高通量测序平台Il lumina
HiSeq 2 500对低温预处理30 d的苹果花药进行转
录组测序和序列分析, 用生物信息学的方法对所
得Unigene进行功能注释和分类, 初步筛选出影响
低温诱导后苹果花药中小孢子获得胚性潜能的相
关基因, 并通过荧光定量PCR的方法验证其相对表
达量, 探讨差异表达基因与小孢子获得胚性潜能
的的关系。
材料与方法
1 材料
本研究选取‘嘎啦’苹果(Malus domestica Borkh
cv. ‘Gala’)的花药为供试材料, 采取混合采样的方
法, 于2014年4月从山西省农业科学院果树研究所
苹果品种资源圃选择生长健壮的‘嘎啦’苹果成年
树, 采集其发育良好的花蕾。将采集的花蕾平均
分为对照和低温处理2组, 对照组直接剥开花蕾取
花药1.0 g于液氮中速冻后放入超低温冰箱中保存
备用; 低温处理先将花蕾在4°C条件下储存30 d后,
植物生理学报260
再取花药1.0 g于液氮中速冻后置于超低温冰箱保
存备用。
2 方法
2.1 RNA的提取和质量检测
采用CTAB法(曹秋芬等2003)分别提取花药的
总RNA, 并用 Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA的
完整性, 用NanoDrop ND-1000 spectrophotometer检
测RNA的浓度及纯度。RNA提取质量检测委托北
京百迈克生物科技有限公司完成。
2.2 cDNA文库构建与转录组测序
cDNA文库的构建和转录组测序委托北京百
迈克生物科技有限公司完成。构建好的文库用
Qubit 2.0、Agilent 2100以及Q-PCR进行检测, 库检
合格后用Illumina Hiseq 2500进行高通量测序。
2.3 测序数据分析
对得到的原始数据进行过滤, 获得高质量的
Clean Reads后, 通过TopHat软件将其与NCBI中提
交的苹果参考基因组(Riccardo等2010)进行序列比
对, 获得Mapped Reads。两组数据都符合测序及功
能分析要求后, 用EBSeq软件对两个样品数据进行
差异表达基因的检测, 并将差异表达基因分别与
GO、COG、KEGG、Swiss-Prot和nr数据库比对,
对相关基因的功能、类别、代谢通路富集情况等
进行注释和预测。
2.4 关键差异表达基因的筛选与验证
根据不同数据库的注释结果, 确定影响低温
预处理后苹果花药中差异表达基因的富集通路,
结合各代谢通路中关键酶的表达调控情况, 筛选
出起关键调控作用的差异表达基因并从中挑选10
个设计特异性引物, 选择UBQ作为内参基因(数据
未发表), 选用宝生物工程(大连)有限公司的SYBR
Premix Ex Taq II试剂盒, ABI PRISM 7300荧光定
量PCR仪, 对2组样品进行实时定量表达验证分
析。引物由华大基因科技服务有限公司合成, 所
用基因及其引物序列如表1所示。实验数据采用
2-ΔΔCt法进一步验证测序数据的可靠性。
实验结果
1 RNA质量检测结果
Agilent 2100 Bioanalyzer结果显示, 对照组样
表1 荧光定量PCR中所用差异表达基因及其引物序列
Table 1 Differentially expressed genes and their primer sequences used in RT-qPCR
基因名称 基因注释 引物序列(5→3)
MdBFF β-呋喃果糖苷酶 F: ACTGCGTTCCGAGACCCGAC
R: GCACTCCCACATACCCGTTTG
MdSPS 蔗糖磷酸合成酶 F: GACATCAACGCAACCTAC
R: CCAAGGCAACTGACTCCAC
MdSS 蔗糖合成酶 F: ACTCTTCCTGGGCTCTACC
R: TTGGCTTGTTTCTGTCCTTC
MdAA α-淀粉酶 F: TCCTACTCTCTATCCTTCTCACAC
R: ACAGACTGTATCCCACTGTTGC
MdAUX1 I 生长素输入载体 F: GCTGGACGGCTTATCTGATC
R: TGACAGATCCAAAGAGGAGG
MdAUX1 II 生长素输入载体 F: CTCACTCGCTTCTTCGCTTTG
R: ATGCCTCTCTTTCCGTCTC
MdGID1 I 赤霉素受体 F: CCAGCACTTCACACACCAG
R: GTTGACTTCATTACTGCCAG
MdGID1 II 赤霉素受体 F: TTGGCGGAGTTCCTTGATCG
R: CACTACAGCCTTGCAGACAC
MdABA 脱落酸受体 F: CAAGCCCTCTAAGCGAAAGTC
R: ACTTCCCGAATGCTCCCTATGC
MdBAK1 油菜素内酯不敏感相关受体激酶 F: TTGGTAGAGGTGGATTTGG
R: CAGCCTTTCTGTTGGTGTC
UBQ 泛素延伸蛋白 F: CTACAATGGAGTCGGTGCT
R: GGAGAAGGCTGATGGATGA
罗慧珍等: 低温诱导下苹果花药差异表达基因分析 261
品RIN值为7.6, 28S/18S值为6.2; 低温处理组样品
RIN值为7.2, 28S/18S值为5.9, 说明两组RNA完整
度均较好。NanodropND-1000 spectrophotometer检
测结果显示 , 对照组样品浓度为612.8 ng·µL-1,
OD260/280值为2.03, OD260/230值为2.45; 低温处理组样
品浓度492.1 ng·µL-1, OD260/280值为1.98, OD260/230值
为1.97, 均符合文库构建要求。
2 测序数据的产出与组装
经测序质量控制, 共得到10.90 Gb Clean Data,
各样品碱基准确度Q30的百分比均大于89.50%,
GC含量不超过50%, 测序数据可用于组装。各样
品的数据产出统计如表2所示。
获得Clean Reads后, 将其与苹果参考基因组
序列进行比对, 以判断组装结果是否能满足分析
的需求。各样品测序数据与所选参考基因组的序
列比对结果(表3)表明, 样品与参考基因组的比对
效率都在75.90%以上, 序列组装效果较好, 可进行
基因功能分析。
表2 转录组测序产量分析
Table 2 Sequence yield in transcriptome
处理 双端Clean Reads数 Clean Data总碱基数 GC含量/% ≥Q30/%
对照 21 501 668 5 416 947 306 48.21 89.69
低温 21 756 944 5 482 064 948 47.61 89.57
表3 转录组数据组装质量分析
Table 3 Data assembly quality in transcriptome
处理

单端Clean Reads数
比对到参考基因组
比对率/%
比对到参考基因组唯一
唯一位置比对率/% 的Reads总数 位置的Reads数
对照 43 003 336 32 661 204 75.95 26 051 050 60.58
低温 43 513 888 33 498 516 76.98 26 805 228 61.60
3 差异表达基因的筛选与功能注释
3.1 差异表达基因的筛选
在差异表达基因的检测过程中, 将差异倍数
(Fold Change)≥2且错误发生率(FDR)<0.01作为筛
选标准, 最终统计低温处理组和对照组的差异表
达基因共有4 105个, 其中表达上调基因有1 849个,
表达下调基因有2 256个。
将All Unigene分别注释到GO、COG、KEGG、
Swiss-Prot和nr数据库, 并对注释到各数据库的差
异表达基因数目进行统计。结果表明, 在GO数据
库注释到3 325个差异表达基因; 在COG数据库注
释到1 504个差异表达基因; 在KEGG数据库注释
到733个差异表达基因; 在Swiss-Prot数据库注释到
2 993个差异表达基因; 在nr数据库注释到3 758个
差异表达基因。
3.2 差异表达基因的GO注释
对照组和低温处理组样品间差异表达基因的
GO分类统计(图1)显示, 差异表达基因在细胞组
分、分子功能和生物学过程三大类中分别包含了
18、17和21个功能小类。在细胞组分这一类中, 差
异表达基因在细胞组成、细胞和细胞器三个功能
小类中所占比例最高; 在分子功能这一类中, 差异表
达基因在结合和催化活性两个功能小类中所占比例
最高; 在生物学过程这一类中, 差异表达基因在细胞
过程、代谢过程、单一有机体过程等十几个小类中
所占比例均较高, 其中细胞过程所占比例最高。
3.3 差异表达基因的COG注释
将对照组和低温处理组样品间的差异表达基
因与COG数据库比对并进行直系同源分类, 结果
(图2)显示共分为25个类别, 其中R (一般功能预测)
包含的基因个数最多, 为454个, 其次是K (转录)
231个、L (复制、重组、修复) 214个、T (信号转导
机制) 211个、G (碳水化合物运输和代谢) 178个。
3.4 差异表达基因的KEGG注释
根据KEGG数据库, 对照组和低温处理组样品
间733个差异表达基因富集到了101条Pathway。将
植物生理学报262
注释结果按照通路类型进行分类, 结果(图3)表明
差异表达基因所在通路基本与代谢过程相关。差
异表达基因KEGG通路富集散点图(图4)能够清晰
显示差异表达基因显著富集的代谢通路, 其中横坐
标表示富集因子, 值越小表示差异表达基因在该通
路富集水平越显著; 纵坐标表示富集显著性的可靠
度, 值越大表示差异表达基因在该通路的富集显著
性越可靠; 整个图中越靠近左上角的图形参考价值
越大, 越靠近右下角的图形参考价值越小。图4显
示了富集显著性最可靠的前20个通路。
图1 差异表达基因的GO分类统计图
Fig.1 GO classification of differentially expressed genes
图2 差异表达基因的COG注释分类统计图
Fig.2 COG function classification of differentially expressed genes
罗慧珍等: 低温诱导下苹果花药差异表达基因分析 263
图4 差异表达基因KEGG通路富集散点图
Fig.4 Scattered point plot of different KEGG pathways
图3 差异表达基因的KEGG分类图
Fig.3 KEGG classification of differentially expressed genes
植物生理学报264
从以上结果中可以看出, 在GO注释中生物学
过程这一类别内, 代谢过程所占比例较高, COG注
释中差异表达基因大量富集在T (信号转导机制)
和G (碳水化合物运输和代谢)功能类。因此, 本研
究选择糖类代谢和激素信号转导相关途径作为切
入点进行分析。结合KEGG通路分析结果, 最终确
定从糖酵解/糖异生、柠檬酸循环、磷酸戊糖途
径、戊糖和糖醛酸互变、淀粉和蔗糖代谢、果糖
和甘露糖代谢、半乳糖代谢、抗坏血酸代谢、氨
基糖和核糖代谢、植物激素信号转导这几个代谢
途径来寻找低温预处理后苹果花药中发生差异表
达的关键基因。
4 关键基因的差异表达分析
4.1 关键差异表达基因的数量统计
对已确定的代谢途径中差异表达基因的数量
进行统计(表4), 共得到225个差异表达基因。同时
可以看出, 在有关糖类代谢的途径中表达量下调
的差异基因数目要高于表达量上调的差异基因数
目, 并且差异基因主要富集在糖酵解/糖异生和淀
粉与蔗糖代谢这两个代谢通路中; 而在植物激素
表4 特定代谢途径中差异表达基因的数量统计
Table 4 Statistical analysis of differentially expressed
genes in the selected pathways
代谢途径 KO编号 表达情况 基因数量
糖酵解/糖异生 ko00010 上调 5
下调 33
柠檬酸循环 ko00020 上调 0
下调 4
磷酸戊糖途径 ko00030 上调 2
下调 15
戊糖和糖醛酸互变 ko00040 上调 5
下调 12
淀粉和蔗糖代谢 ko00500 上调 7
下调 27
果糖和甘露糖代谢 ko00051 上调 12
下调 14
半乳糖代谢 ko00052 上调 4
下调 12
抗坏血酸代谢 ko00053 上调 7
下调 8
氨基糖和核糖代谢 ko00520 上调 5
下调 18
植物激素信号转导 ko04075 上调 27
下调 18
信号转导这一途径中, 表达量上调的差异基因数
目要高于表达量下调的差异基因数目。
由于每条代谢途径都是多种不同的酶发生复
杂生化反应的结果, 因此研究这些途径中与差异
表达基因相关的酶的变化, 可以找出在对应调控
途径中发生差异表达的基因, 以及这些基因在特
定通路中所起的作用。而找到调控相关代谢通路
的关键酶, 就能得到起关键调控作用的差异表达
基因。结合表4中结果, 由于糖酵解/糖异生中涉及
的是多个代谢途径, 因此最终确定对控制淀粉和
蔗糖代谢与植物激素信号转导这两个代谢途径中
的关键酶进行分析, 找出相对应的基因, 并分析其
表达量(表5)。
由表5可知, 蔗糖代谢中控制蔗糖分解的基因
表达量下调, 控制蔗糖合成的基因表达量上调, 因
而蔗糖的合成量相对增加; 淀粉代谢中控制淀粉
降解的基因表达量上调, 使得淀粉合成量相对减
少。该结果说明在低温诱导条件下花药中蔗糖合
成量增加、淀粉合成量减少。
植物激素信号转导途径中生长素输入载体
(AUX1)基因表达量下调, 进而通过控制生长素运
输使得生长素含量也相对减少; 细胞分裂素受体
(CRE1)基因、脱落酸受体(PYR/PYL)基因、油菜
素内酯不敏感相关受体激酶(BAK1)基因表达量上
调, 从而通过控制细胞分裂素、脱落酸、油菜素
内酯的信号通路使得相应激素含量相对增加。赤
霉素受体(GID1)基因中GID1b表达量上调, GID1c
表达量下调, 且上调幅度要高于下调幅度, 因而使
得赤霉素敏感性相应提高。该结果说明低温处理
可使生长素的含量降低, 细胞分裂素、脱落酸、
油菜素内酯和赤霉素含量的增加。
4.2 关键差异表达基因表达量的验证
从表5中选择10个基因(表1), 以UBQ为内参基
因, 采用2-ΔΔCt法对差异表达基因的表达量进行荧光
定量PCR验证。检测结果(图5)表明, RT-qPCR验证
的10个基因在对照组和低温处理组的变化趋势与
测序结果完全一致, 表达量改变倍数与测序所得差
异表达倍数基本吻合, 说明测序数据较为准确可
靠, 可作为参考进行后续研究。由此可以得出, 实
验筛选出的关键性差异表达基因对低温诱导条件
下花药内小孢子胚性潜能的获得具有重要意义。
罗慧珍等: 低温诱导下苹果花药差异表达基因分析 265
表5 关键基因的差异表达情况
Table 5 Expression of the key genes

酶 名称 表达情况 基因位置
表达量
对照组 低温处理组
E3.2.1.26 β-呋喃果糖苷酶 下调 NC_024250.1:2607797-2612660 30.0491 5.4686
E2.4.1.14 蔗糖磷酸合成酶(SPS) 上调 NW_007545269.1:293600-299641 0.1288 1.1776
E2.4.1.13 蔗糖合成酶 下调 NC_024253.1:15588162-15593920 66.3627 8.9114
E3.2.1.1 α-淀粉酶 上调 NC_024243.1:27923329-27925461 0.6762 10.7458
AUX1 生长素输入载体 下调 NC_024244.1:8896475-8900901 5.9062 0.7660
下调 NC_024250.1:23289807-23295388 4.2969 0.7331
下调 NW_007545812.1:1354966-1359031 1.0074 0.0003
CRE1 细胞分裂素受体 上调 NC_024251.1:8372216-8378669 0.7622 12.6876
上调 NC_024254.1:6458834-6464630 8.6987 37.0169
GID1 赤霉素受体 上调 NC_024249.1:33736677-33739199 (GID1b) 12.9954 126.5748
下调 NW_007546156.1:5541619-5544042 (GID1c) 6.7811 0.1913
PYR/PYL 脱落酸受体 上调 NC_024243.1:5295639-5296548 3.9189 25.8997
上调 NC_024244.1:4070138-4071113 1.5921 28.2351
BAK1 油菜素内酯不敏感 上调 NC_024253.1:42641978-42648580 1.4495 6.6412
相关受体激酶
讨　　论
1 实验材料及取样
苹果是无性繁殖的木本植物, 本研究所用花
药均来自同一品种的不同花蕾, 但由于同一花蕾
中不同花药的发育程度有所不同, 所以实际上无
法保证所取花药的完全一致性。因此, 在采样时
图5 差异表达基因的荧光定量PCR验证结果
Fig.5 RT-qPCR results of differentially expressed genes
以对照组为标准, 以上各图为挑选出的10个差异表达基因的RT-qPCR验证结果, 误差线为3次重复数据的标准误。
植物生理学报266
采集多个花蕾的花药进行混合, 测序时只对这些
样品进行技术重复而非样品间的重复。
2 低温处理前后淀粉和蔗糖的变化
有研究报道指出, 在小孢子胚性潜能的获得
阶段, 糖、淀粉代谢相关基因会起到重要的调节
作用(Maraschin等2006)。在水稻、小麦等的研究
中发现, 在花药的单核中后期积累着大量的淀粉
酶; 当花粉细胞启动脱分化后, 花药由配子体向孢
子体转化过程中伴随大量新细胞的形成, 需要消
耗相当能量, 能量主要来自糖类的氧化, 而花药中
淀粉含量是启动去分化的关键(滕海涛等2008)。
在本研究中, 控制淀粉降解的基因表达量上调, 说
明在该阶段淀粉合成量相对减少, 与前人研究中
淀粉发生氧化的结果相吻合。蔗糖作为碳源之一,
也是一种渗透调节物质, 能够影响体外雄核发育
和胚胎形成效率(张晓强等2015)。在蔗糖代谢中,
β-呋喃果糖苷酶能够催化蔗糖分解, 蔗糖磷酸合成
酶催化蔗糖生成, 蔗糖合成酶既能催化蔗糖的合
成, 又能催化蔗糖的分解, 但通常认为主要起分解
蔗糖的作用(张明方和李志凌2002)。本研究中β-
呋喃果糖苷酶、蔗糖合成酶基因表达量下调, 蔗
糖磷酸合成酶基因表达量上调, 使得蔗糖含量增
加, 与文献中蔗糖发挥作用的结果相一致。由此
可见, 淀粉和蔗糖含量变化在低温诱导条件下可
能会促进花药中小孢子胚性潜能的获得。
3 低温处理前后内源激素的变化
有研究表明, 内源激素对胚性细胞及体细胞
胚的形成有重要作用(宋运贤等2012)。在有关非
洲爪蟾卵母细胞的研究中发现, 生长素输入载体
(AUX1)的表达能够促进生长素运输 (Yang等
2006)。 陈振光(1983)证明在柑桔花药培养过程
中, 低浓度的生长素促进胚状体的形成, 高浓度的
生长素促进愈伤生成而抑制胚状体形成。沙月娥
等(2012)发现高浓度的生长素比低浓度生长素抑
制桉树胚状体的发生。本研究中控制AUX1的3个
基因经检索实际属于同一基因, 其表达量的下调
对生长素运输的促进起到减弱作用, 使得生长素含
量减少, 这一结果也与前人报道相一致。
邓岩等(2006)认为细胞分裂素受体(CRE1)能
够在细胞分裂素信号转导过程中起到正向调节作
用; 张洁等(2002)认为在果树花药培养诱导雄核发
育过程中, 细胞分裂素能够促进胚状体的形成。
有研究表明ABA信号途径对激活小孢子胚形成起
到直接或间接的作用(Maraschin等2005); 而PYR/
PYL作为ABA的受体蛋白, 可以通过抑制蛋白磷
酸酶2 C的活性来启动A B A信号转导 (胡帅等
2012)。油菜素内酯不敏感相关受体激酶(BAK1)
作为BRI1 (油菜素内酯受体)在油菜素内酯信号通
路的共受体, 共同调控植物的生长发育(田荣等
2014)。Ferrie等(2005)发现在芸薹属植物的小孢子
培养中加入油菜素内酯可提高大多数基因型的出
胚率。本研究中控制CRE1的2个基因经检索实际
属于同一基因, 控制PYR/PYL的基因经检索也属
于同一基因。CRE1、PYR/PYL和BAK1的表达量
都上调, 细胞分裂素、脱落酸和油菜素内酯的信
号转导途径均得到正向的促进作用, 使得相应激
素的含量增加, 该结果与前人研究相一致。同时,
本课题组在实际的苹果花药培养过程中添加细胞
分裂素能促进胚状体的形成, 更是对上述分析结
果的有力证明。
有关棉花的研究表明, 赤霉素受体(GID1)基
因高表达可提高植物赤霉素的敏感性, 出现赤霉
素过量的表型(董静等2009); 而此前有报道称赤霉
素和受体结合形成GA-GID1复合体 , 能够诱导
DELLA蛋白发生降解, 解除DELLA蛋白对植物生
长的抑制(岳川等2012)。本研究中控制GID1的两
个基因经检索分别为GID1b和GID1c, 由于在酵母
双杂交实验中GID1b比GID1c对赤霉素有更高的
亲和性(葛晖等2011), 且GID1b的表达量上调幅度
明显高于GID1c的表达量下调幅度, 使得赤霉素敏
感性增加。该结果说明在低温条件下赤霉素含量
增加促进花药内小孢子胚性潜能的获得可能是通
过GID1b基因来决定的 。
从以上分析中可以推断, 这些变化有可能是
通过低温预处理改变某些糖类、激素的含量, 从
而改变花粉原本的发育途径, 使其恢复小孢子胚
性潜能进而向胚状体方向发育。特别是挖掘出的
有关激素代谢过程中的相关基因, 对今后苹果花
药培养中确定培养基激素添加种类、提高胚状体
形成率具有重要的指导意义。
罗慧珍等: 低温诱导下苹果花药差异表达基因分析 267
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Differentially expressed gene analysis of apple (Malus domestica) anther under
low temperature induction
LUO Hui-Zhen1,2, DENG Shu3, ZHANG Chun-Fen3, XIAO Rong3, WANG Hui4, MENG Yu-Ping2, CAO Qiu-Fen1,2,*
1College of Biological Engineering, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2Biotechnology Research Center, Shanxi Academy
of Agriculture Sciences, Taiyuan 030031, China; 3Fruit Tree Research Institute, Shanxi Academy of Agriculture Sciences, Taigu,
Shanxi 030815, China; 4Research Department, Shanxi Academy of Agriculture Sciences, Taiyuan 030031, China
Abstract: Low temperature treatment is the key step in the induction of the formation of embryoid during apple
anther culture, and pollen in anthers can acquire the embryogenic potential after a certain period of low tem-
perature induction. In this study, the research on the two group apple anther that one was treated by 30 days low
temperature and the other untreated were carried out by the method of RNA-Seq, and the DEG (differentially
expressed genes) in the process of embryoid formation was analyzed. The results showed that: A total of 10.90
Gb clean data was generated using the Illumina HiSeq 2 500 system. Gene expression revealed 1 849 up-regu-
lated genes and 2 256 down-regulated genes among the 4 105 DEG. By blasting to different databases, 3 325
DEG was annotated by Go terms; 1 504 DEG was able to be assigned to COG database; 733 DEG was annotat-
ed with KEGG blast; 2 993 and 3 758 DEG were annotated by Swiss-Prot and nr databases, respectively. DEG
was mainly enriched in the metabolic processes associated with carbohydrate metabolism and hormone signal
transduction, and DEG in the pathway starch and sucrose metabolism and plant hormone signal transduction
were the most. DEG which control sucrose biosynthesis, cytokinin, abscisic acid and brassinosteroid’ s signal
transduction were up-regulated while those control starch biosynthesis and auxin’ s signal transduction were
down-regulated. Besides, the RT-qPCR results showed the sequencing results were consistent with the actual
results. From here we see that, changes of the genes that affecting sucrose, starch biosynthesis, auxin, cytokinin,
abscisic acid, gibberellin and brassinosteroid’ s signal transduction were key to the process of apple anther em-
bryoid formation induced by low temperature.
Key words: apple anther; embryoid; RNA-Seq; differentially expressed genes; RT-qPCR
Received 2015-10-21 Accepted 2016-01-28
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31372033), National Science and Technology Basic
Work Projects (2012, FY110100-5) and the Natural Science Foundation of Shanxi (2015021153).
*Corresponding author (E-mail: qiufengcao@163.com).