全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月 561
收稿 2009-03-04 修定 　2009-04-09
资助 国家 “863” 计划(2008AA10Z155)、华中农业大学科技
创新基金(2008XCX014)和华中农业大学人才引进项目。
* 通讯作者(E-mail: zbye@mail.hzau.edu.cn; Tel: 027-
8 7 2 8 6 8 6 7 )。
芸苔属蔬菜小孢子胚状体再生成苗及倍性鉴定
王涛涛 1,2, 李汉霞 1,2, 张俊红 1,2, 叶志彪 1,*
华中农业大学 1园艺林学学院, 2园艺植物生物学教育部重点实验室, 武汉 430070
提要: 研究影响大白菜、甘蓝和红菜薹小孢子胚状体再生成苗的几个生理因素的结果表明, 在1.0%~1.2%的琼脂中胚状体
再生成苗率显著高于0.8%琼脂的。4 ℃处理10 d可显著提高大白菜和甘蓝胚状体再生成苗率。大白菜和红菜薹胚状体再
生成苗的最适胚龄为 20~29 d, 甘蓝则为 30~35 d。培养基 B5和MS对再生成苗率影响不大。检测 3种芸苔属蔬菜小孢子
再生植株的倍性结果表明, 大白菜和红菜薹小孢子植株自然加倍率较高, 均超过70%; 甘蓝较低, 仅为30%左右。同一物种
的不同品种间胚状体再生成苗所需的条件和加倍效率基本一致。
关键词: 芸苔属; 小孢子; 胚状体; 植株再生; 倍性检测
Plantlet Regeneration and Ploidy Determination of Microspore Embryoids in
Brassica Vegetables
WANG Tao-Tao1,2, LI Han-Xia1,2, ZHANG Jun-Hong1,2, YE Zhi-Biao1,*
1College of Horticulture and Forestry, 2Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education, Huazhong Agricul-
tural University, Wuhan 430070, China
Abstract: Several physiological factors of microspore embryoids for plant regeneration were investigated in
Chinese cabbage, cabbage and purple flowering stalk. The results showed that the frequencies of plant regen-
eration on 1.0%–1.2% agar media was significantly higher than that in 0.8% agar media. 4 ℃ treatment greatly
improved the regeneration frequency in Chinese cabbage and cabbage. The optimal stage of embryoids was 20
to 29 days for plant regeneration in Chinese cabbage and purple flowering stalk, whereas it was 30 to 35 days in
cabbage. Nevertheless there were no significant effects of B5 or MS media on plant regeneration. The results of
ploidy determination in three Brassica vegetables showed that there were higher doubled haploid frequency
(over 70%) in Chinese cabbage and purple flowering stalk, but lower doubled haploid frequency (only about
30%) in cabbage. The results suggested that the culture conditions for plant regeneration and spontaneous
diploidization efficiency among different varieties of the same Brassica species were identical.
Key words: Brassica; microspore; embryoid; plant regeneration; ploidy determination
自从首次报道芸苔属作物甘蓝型油菜(Brassica
napus)小孢子培养成功后(Lichter 1982), 近20年来,
这一技术在芸苔属蔬菜中又得到了不断的改进和发
展。先后在大白菜(Sato等 1989; 粟根义等 1993)、
羽衣甘蓝(Zhang等 2008)、青花菜(Takahata和
Keller 1991)、红菜薹(李光涛和李昌功 1996; 王涛
涛等2004)等芸苔属蔬菜作物中获得成功。由于很
多芸苔属蔬菜, 如甘蓝和红菜薹等, 小孢子出胚效
率较低, 大部分报道仍致力于提高胚状体的发生频
率的研究, 对影响胚状体再生成植株的研究较少。
胚状体能否发育成正常的植株受内外各种因素的影
响, 内因包括植物基因型、小孢子胚的发育时期和
质量等。外因指植株再生过程中的各种培养条件,
如培养基成分, 水分状况等(余凤群等 1995)。适当
降低培养基中的水分含量有利于大白菜胚状体成苗
(刘凡等 1997)。在 10 ℃处理 10 d后, 羽衣甘蓝胚
状体胚轴向上生长, 再生率明显提高(姜凤英等
2006)。用ABA处理, 可以提高甘蓝类蔬菜胚状体
的耐旱性, 其植株再生率也明显提高, 达到54.7%~
70.6% (Rudolf等 1999)。
由小孢子培养获得的单倍体植株, 只有通过染
色体加倍成为二倍体才能正常开花繁殖。大白菜
小孢子植株自然加倍率在 5 0% ~7 0% (C ao 等
1995)。有的试验报道自然加倍率在 70%以上(张
凤兰和钉贯靖久1993)。但甘蓝和红菜薹小孢子植
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月562
株自然加倍的频率却鲜有报道。小孢子再生植株
自然加倍的频率与小孢子培养的条件也密切相关。
用秋水仙素处理小孢子, 可提高加倍比率。如, 油
菜小孢子用秋水仙素处理后再生植株的加倍率达到
70% (Zhou等 2002)。
本文对 3种芸苔属蔬菜小孢子胚状体再生成
苗过程中的内外因素进行了分析, 同时检测了其再
生植株的自然加倍比率, 以期为蔬菜作物单倍体育
种提供参考。
材料与方法
三种芸苔属蔬菜各取 2 个品种 : 大白菜
[Brassica campestris ssp. pekinensis (Lour.) Olsson]
选 ‘ 丰抗 70’ 和 ‘ 鲁白六号 ’ ; 红菜薹(Brassica
campestris ssp. chinensis var. purpurea Hort.)选‘8902’
和 ‘十月早 ’; 甘蓝(Brassica oleracea var. capitata
L.)选 ‘夏光 ’和 ‘晚丰 ’。实验材料为以上品种小
孢子培养得到的生长良好的子叶型胚状体。
影响胚状体再生成苗的 4种生理因素设置了
以下几种处理。(1)琼脂浓度: 0.8%、1.0%和 1.2%;
(2)胚龄: 从培养第1天开始到形成成熟子叶型胚状
体的时间, 分为 20~24 d、25~29 d和 30~35 d共 3
个阶段; (3)低温: 将胚状体置于4 ℃下处理10 d, 以
0 d作对照。前 3种处理均以MS作为基本培养基;
(4)培养基类型: MS或 B5培养基, 附加 1.2%的琼
脂。各种因素处理后的胚状体, 置于 25 ℃、光
照长度为 14 h、光照强度为 200 μmol·m-2·s-1条件
下培养成苗。5 周后统计直接成苗数。
再生植株的倍性鉴定分别是: 2个大白菜品种
随机选取40棵小孢子再生植株, 红菜薹和甘蓝选取
20棵, 用流式细胞光度仪(FCM)的方法进行鉴定
(Zhou等 2002)。
数据分析均采用单因子设计和分析, 每个处理
重复 3次。利用软件 SPSS 13进行方差分析, 若
达到显著水平, 则用邓肯新复极差测验法在P=0.05
水平上进行多重比较。
实验结果
1 影响胚状体成苗的因素
1.1 琼脂浓度 胚状体转到琼脂浓度为1.0%或1.2%
的再生培养基上培养2~3周后, 可看到胚状体开始
直立生长, 生长点萌动, 真叶逐渐长出(图 1)。胚
状体再生成苗的频率均超过50%, 最高的‘丰抗70’
超过 70%。而在 0.8%琼脂的培养基上, 再生率一
般仅在 30%左右, 一次成苗率低, 多数需要继代后
方可成苗。当琼脂浓度为 1.0%或 1.2%时, 6个品
种的再生率均显著高于 0.8%琼脂的。其中, 2个
大白菜品种、红菜薹 ‘8902’和甘蓝 ‘夏光 ’在 3种
处理间再生率均存在显著差异(表 1)。
1.2 胚龄 小孢子胚状体在液体培养基中培养的时
间, 对小孢子再生成苗有很大影响。大白菜和红菜
薹的胚状体在液体培养基中培养 20~29 d, 转移到
固体培养基后, 发育较快, 成胚率高, 最高分别达到
65.6%和 63.3%。而甘蓝小孢子胚状体最适胚龄
为 30~35 d, 其再生成苗率最高可达 60% (表 2)。
1.3 低温 大白菜 ‘丰抗 70’、红菜薹 ‘8902’和甘
蓝 ‘晚丰 ’子叶期胚状体转到MS固体培养基上, 置
于 4 ℃处理 10 d后, 与在 25 ℃下生长的胚状体相
比, ‘丰抗70’和 ‘晚丰 ’的再生率均有显著提高, 再
生率提高 10%左右。但 ‘8902’成苗率没有显著差
异(表 3 )。
1.4 培养基的类型 同样从 ‘丰抗 70’、‘8902’和
‘晚丰’中选择发育一致的子叶型胚状体, 分别置于
附加 1.2%琼脂的MS和B5培养基上培养。实验发
现在2种培养基中, 小孢子诱导的胚状体再生植株
的频率相差不大(55%左右)。这可能是胚状体已
完成器官分化过程的情况下, B5和MS均可以提供
其进一步发育成植株的营养。
2 倍性测定
用流式细胞仪的方法, 对3种芸苔属蔬菜的小
孢子再生植株进行了倍性鉴定。检测信号清晰的
反映出单倍体(1n)和双倍体(2n)的分离峰(图 2)。
单倍体植株田间生长表现为侧枝增多, 花蕾变小, 高
度不育, 而双倍体则生育正常(图 3)。经检测发现,
大白菜 2个品种自然加倍率均超过70%, 红菜薹品
种最高可达 80%。甘蓝小孢子培养所产生的植株,
大多数为单倍体, 双倍体比率仅为 30%左右。另
外, 在不同的植物中还检测到少量的其他倍性的植
株存在(表 4)。
讨　　论
植物小孢子胚状体再生成苗受多种因素的影
响。一般认为, 适当提高培养基中琼脂的浓度, 能
降低培养环境湿度, 提高分化成苗率。刘凡等
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图 1 大白菜和红菜薹胚状体的再生植株
Fig.1 The plantlet regeneration from embryoid of Chinese cabbage and purple flowering stalk
图 3 甘蓝单倍体和双倍体的田间表现
Fig.3 Haploid and doubled haploid cabbage in the field
(1997)通过提高琼脂的浓度, 促使大白菜胚状体一
次成苗率达到 50%以上。本文也发现提高琼脂浓
度对提高小孢子植株再生率有显著效果。但不同
芸苔属蔬菜的反应不尽相同, 红菜薹的一次成苗率
比大白菜的要低, 大部分胚状体均是通过二次分化
后, 经过继代培养才能成苗。有些胚状体可以形成
10多个丛芽, 这对于快繁有一定的好处。
小孢子胚状体发育阶段或胚龄是影响胚状体
再生成株的另一个因素。本文结果表明, 大白菜和
红菜薹胚龄在 20~29 d时再生率较高。随着滞留
时间的延长, 成苗率明显下降。超过 30 d后, 许
多成熟的绿色胚状体逐渐变褐, 转移到固体培养基
上培养时很快死亡。刘凡等(1997)则认为大白菜
2~3周的胚龄再生率高。比本文见到的适宜胚龄
要短, 这可能与基因型或培养温度有一定关系。甘
蓝胚状体再生的最适胚龄尚未见报道, 本文结果表
图 2 甘蓝小孢子再生植株的 FCM矩形图
Fig.2 FCM histograms of cabbage regeneration plantlets derived from microspores
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表 1 琼脂浓度对胚状体再生成苗的影响
Table 1 Effects of agar concentrations on plantlet regeneration of embryoid
植物 品种 琼脂浓度 /% 胚状体数量 /个 苗数 /个 再生率 /%
大白菜 ‘丰抗 70’ 0.8 9 0 2 8 31.1c
1.0 9 0 4 9 54.4b
1.2 9 0 6 4 71.1a
‘鲁白 6号 ’ 0.8 9 0 2 3 25.6c
1.0 9 0 3 8 42.2b
1.2 9 0 5 1 56.7a
红菜薹 ‘十月早 ’ 0.8 3 0 9 30.0b
1.0 3 0 1 6 53.3a
1.2 3 0 1 8 60.0a
‘8902’ 0.8 3 0 8 26.7c
1.0 3 0 1 4 46.7b
1.2 3 0 1 9 63.3a
甘蓝 ‘晚丰 ’ 0.8 3 0 1 0 33.3b
1.0 3 0 1 5 50.0a
1.2 3 0 1 6 53.3a
‘夏光 ’ 0.8 3 0 1 0 33.3c
1.0 3 0 1 5 50.0b
1.2 3 0 1 9 63.3a
表 2 胚龄对胚状体再生成苗的影响
Table 2 Effects of embryoid stages on plantlet regeneration of embryoid
植物 品种 胚龄 /d 胚状体数量 /个 苗数 /个 再生率 /%
大白菜 ‘丰抗 70’ 20~24 9 0 5 9 65.6a
25~29 9 0 5 6 62.2a
30~35 9 0 3 1 34.4b
‘鲁白 6号 ’ 20~24 9 0 5 3 58.9a
25~29 9 0 5 5 61.1a
30~35 9 0 3 4 37.8b
红菜薹 ‘十月早 ’ 20~24 3 0 1 5 50.0b
25~29 3 0 1 9 63.3a
30~35 3 0 1 0 33.3c
‘8902’ 20~24 3 0 1 6 53.3a
25~29 3 0 1 7 56.7a
30~35 3 0 1 1 36.7b
甘蓝 ‘晚丰 ’ 20~24 3 0 8 30.0b
25~29 3 0 1 0 35.0b
30~35 3 0 1 6 55.0a
‘夏光 ’ 20~24 3 0 9 30.0c
25~29 3 0 1 1 45.0b
30~35 3 0 1 8 60.0a
明其胚龄比大白菜和红菜薹长, 胚龄天数与油菜相
似。甘蓝型油菜 35 d胚龄的胚状体萌发率比 21 d
的增加 3~5倍(Kott和 Beversdorf 1990)。由此可
见, 不同物种胚状体再生时最适胚龄不同, 在小孢
子培养过程中, 应适时将胚状体转移到固体培养基
上进行再生成苗。
在大白菜和红菜薹小孢子胚状体再生成苗过
程中, 常见到试管中有植株抽苔开花的现象, 特别
是大白菜 ‘鲁白6号 ’, 这种抽苔开花的现象十分严
重。这可能是由于这些材料细胞中含有类似赤霉
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表 3 低温处理对胚状体再生成苗的影响
Table 3 Effect of low temperature treatment on plantlet regeneration embryoid
植物 品种 温度 /℃ 胚状体数量 /个 苗数 /个 再生率 /%
大白菜 ‘丰抗 70’ 4 6 0 3 9 65.00a
2 5 6 0 3 3 55.00b
红菜薹 ‘8902’ 4 6 0 3 4 56.67a
2 5 6 0 3 2 53.33a
甘蓝 ‘晚丰 ’ 4 6 0 3 6 60.00a
2 5 6 0 3 1 51.67b
素的物质, 可以代替低温完成春化, 从而导致开花
(官春云等 1999)。另外, 在胚状体成苗阶段还有白
化现象发生, 这种现象在农作物胚状体中十分普
遍。小麦花粉植株白苗率一般约为 40%, 高的达
到 80%~90% (黄斌 1985)。白化苗可能是由于在
花粉发育的早期, 小孢子质体DNA降解, 培养过程
中阻止叶绿体的形成之故(Caredda等 2000)。花粉
植株的白化现象是不可逆的, 但改善培养的条件, 如
蔗糖的浓度和低温处理时间等, 都有可能改善白化
的情况(李景琦等 2002)。
植物小孢子培养得到的植株在理论上为单倍
体。需用秋水仙碱等药品进行加倍处理, 但加倍操
作繁琐, 药剂毒性大。小孢子培养过程中一般有自
然加倍的特点, 不同作物的自然加倍率差异较大。
本文中大白菜和红菜薹的小孢子自然加倍率较高。
甘蓝相对较低, 需进行人工加倍, 其单倍体比率与
甘蓝型油菜比较一致(Huang等 1991)。一般认为
自然加倍的原因可能有两种: 即细胞核内复制和核
融合。如果在核融合前已经发生了细胞核内复制,
那么就有可能形成高于 2倍的多倍体。处于单核
有丝分裂 I~III期的小孢子, 其加倍率比处于单核
IV~VI期和双核期的要高(Sunderland等 1974)。通
常认为胚状体染色体的加倍发生在小孢子培养早
期, 但不同作物研究的结果不很一致。大麦小孢子
培养 2 d后, 便发现有核融合现象发生(Kasha等
2001)。玉米大部分的核融合发生在培养后 5~7 d
(Testillano等 2004)。可能不同作物的加倍条件和
机理存在差异, 有待进一步研究确认。
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表 4 三种芸苔属蔬菜小孢子培养植株的倍性
Table 4 Ploidy of three kinds of Brassica vegetables plantlets derived from microspores culture
植物 品种 测定数量 /个 单倍体 /% 双倍体 /% 其他倍性 /%
大白菜 ‘丰抗 70’ 4 0 20.0 72.5 7.5
‘鲁白 6号 ’ 4 0 27.5 70.0 2.5
红菜薹 ‘8902’ 2 0 15.0 80.0 5.0
‘十月早 ’ 2 0 25.0 75.0 0
甘蓝 ‘晚丰 ’ 2 0 50.0 35.0 15.0
‘夏光 ’ 2 0 65.0 30.0 5.0
植物生理学通讯 第 45卷 第 6期，2009年 6月566
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