全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (12): 1903~1911　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0375 1903
收稿 2014-08-25　　修定 2014-11-08
资助 青岛农业大学高层次人才科研基金资助(630929)、青岛农
业大学大学生科技创新基金项目、公益性行业(农业)科研
专项项目(201203075-04)和山东省现代农业产业体系水果
创新团队建设基金(SDAIT-03-022-10)。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: yyb@qau.edu.cn; Tel: 0532-88030513)。
苹果着色期实时定量PCR内参基因的筛选和验证
樊连梅1,2,*, 王超1,*, 刘更森2, 原永兵2,**
青岛农业大学1生命科学学院/山东省高校植物生物技术重点实验室, 2园艺学院/青岛市现代农业质量与安全工程重点实验
室, 山东青岛266109
摘要: 苹果果实着色期基因表达水平的变化对果实品质形成具有重要影响, 选择适合的内参基因是提高实时荧光定量PCR
分析准确性的首要条件。本试验以‘富士’苹果着色过程中不同取样时间的果皮为材料, 通过qRT-PCR分析了常用候选持家
基因β-actin、EF-1α、GAPDH和18S rRNA的表达变化, 借助geNorm和NormFinder程序筛选出在果实着色期qRT-PCR分析
的理想内参基因。结果表明, EF-1α的表达水平高且最稳定, 其次是18S rRNA, 而β-actin和GAPDH的相对表达水平较低; 同
时, 用筛选的内参基因EF-1α和18S rRNA分析苹果花青苷合成途径的二氢黄酮醇-4-还原酶基因的表达水平, 其表达规律比
较一致, 均呈现正态分布。因此, EF-1α和18S rRNA是研究苹果着色期表达的理想的内参基因。
关键词: ‘富士’苹果; 内参基因; 实时荧光定量PCR; geNorm程序; NormFinder程序
Screening and Validation of Reference Genes for Real-Time Fluorescence
Quantitative PCR during Coloring Period in Apple (Malus domestica)
FAN Lian-Mei1,2,*, WANG Chao1,*, LIU Geng-Sen2, YUAN Yong-Bing2,**
1College of Life Sciences/Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shandong, 2College of Horticulture/Qingdao Key Lab of
Modern Agriculture Quality and Safety Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: The change of gene expression level during coloring period is crucial for the formation of apple fruit
quality. The selection of a suitable reference gene is an important factor for accurate gene expression analysis
by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR). In this study, peels of apple (Malus domestica cv. ‘Fuji’)
were taken as materials sampled at different time during coloring stage. The expression level of four commonly
used housekeeping genes β-actin, EF-1α, GAPDH and 18S rRNA were studied by qRT-PCR, and reliable refer-
ence gene were screened to use for gene expression during coloring stage of fruit by geNorm and NormFinder
software. The results showed that the expression level of EF-1α was highest and most stable, followed by 18S
rRNA. However, the expression level of β-actin and GAPDH were relatively low. Meanwhile, the expression of
flavonoid-4-reductase gene (MdDFR) in the pathway of apple anthocyanin biosynthesis was analyzed, and the
results indicated that the variation tendency of MdDFR was exactly consistent and presented normal distribu-
tion using EF-1α and 18S rRNA as reference gene. Therefore, EF-1α and 18S rRNA are suitable reference genes
and could be used to normalize mRNA levels in peel tissues of apple during coloring period.
Key words: Malus domestica cv. ‘Fuji’; coloring stage; reference gene; qRT-PCR; geNorm software; Norm-
Finder software
基因表达在研究动物、植物和微生物的分子
机制方面变得越来越重要。20世纪90年代中期兴
起的实时荧光定量PCR (real-time fluorescence
quantitative PCR, qRT-PCR)作为一种快速而准确
的新型核酸定量分析技术得到迅速发展, 该技术
能够对不同组织、不同发育时期基因表达的差异
进行研究, 能够快速、方便地实时监测基因在不
同样本中的表达情况。它是对常规PCR技术的进
一步补充和发展, 与Northern杂交和斑点杂交相比,
该技术具有高灵敏度、高特异性和重复性好等优
点 , 已经被广泛用于生物科学的各个研究领域
(Heid等1996; Ransbotyn和Reusch 2006; Yoo等
2009; Reddy等2013)。利用qRT-PCR方法分析基因
相对表达量需要内参基因(reference gene) (吴文凯
植物生理学报1904
等2009)进行校正。内参基因即内部参照基因, 它
们在各个组织和细胞中表达相对恒定, 在检测基
因的相对表达水平时可以作为参照。在基因表达
研究中, 最常用的可以作为内参基因的持家基因
(housekeeping genes)包括18S核糖体RNA基因(18S
ribosomal RNA, 18S rRNA)、26S核糖体RNA基因
(26S ribosomal RNA, 26S rRNA)、转录延伸因子基
因(transcription elongation factors, EF-1α)、甘油
醛-3-磷酸脱氢酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase, GAPDH)、β-肌动蛋白基因(β-actin,
β-ACT)、α-微管蛋白基因(α-tubulin, TUA)和多聚
泛素酶基因(ubiquitin, UBQ)等(Gu等2011; Ma-
roufi等2010; Nicot等2005; Domoki等2006; Hu等
2009; Garg等2010)。上述内参基因在不同类型细
胞和组织、不同发育阶段、体外培养等各条件下
表达量差异较大。因此, 针对研究的实际情况, 进
行内参基因的筛选非常必要(Vandesompele等
2002)。
苹果是蔷薇科(Rosaceae)植物, 是世界重要的
经济水果。果实色泽是苹果重要的外观品质, 直
接影响其商品性和营养价值。花青苷的含量和分
布状况决定苹果果皮色泽性状。花青苷生物合成
途径是植物类黄酮物质生物合成途径的分支之
一。其中, 二氢黄酮醇-4-还原酶(dihydroflavonol
4-reductase, DFR)是植物花青苷生物合成途径中的
一个关键酶, 是重要的调控点(刘娟等2005; Justen
等2006; Dick等2011)。在决定植物的花色、叶
色、果色和其他经济器官的色泽及其营养品质方
面, DFR起到重要作用(Winkel-Shirle 2001)。DFR
由单基因编码, 属于NADPH依赖性短链还原酶家
族(李春雷等2009), DFR将二氢黄酮醇转变为花青
苷反应的第1个酶, 催化生成不稳定花青素。DFR
能催化二氢堪非醇(dihydrokaempferol, DHK)、二
氢栎皮黄酮(dihydroquercetin, DHQ)和二氢杨梅黄
酮(dihydromyricetin, DHM)在C4位发生立体特异
的还原反应, 分别生成3种无色花青素(leucoantho-
cyanidins): 无色天竺葵素(leucopelargonidin)、无
色翠雀素(leucodelphinidin)和无色矢车菊素(leuco-
cyanidin) (Holton和Cornish 1995; 刘光德等2009)。
目前, 采用分子生物学研究手段来揭示苹果的花
青苷代谢途径及其调控机理已成为研究热点, 利
用qRT-PCR技术研究苹果着色期花青苷合成与分
解途径的转录因子和结构基因的表达情况, 可为
调控果实色泽发育提供研究基础。
但目前有关苹果着色期内参基因选择的研究
还没有报道。本文以着色期苹果不同解袋时间的
果皮为材料, 利用qRT-PCR技术开展18S rRNA、
β-actin、EF-1α和GAPDH 4个内参基因的表达量
分析, 并利用GeNorm程序(Vandesompele等2002)
和NormFinder程序(Andersen等2004)对这4个内参
基因在苹果不同解袋时间果皮的表达变化进行比
较分析, 以期选择出适合苹果着色期的表达最稳
定的内参基因, 这对于研究苹果着色期相关基因
的表达水平, 揭示苹果花青苷代谢和调控机理具
有重要的理论和实践意义。
材料与方法
1 材料
本研究以‘富士’苹果(Malus domestica Borkh.
cv. ‘Fuji’)果实为试验材料。采样地为山东省莱西
市苹果良种场, 苹果果实分别于解袋后的0、3、
5、7、9和11 d采样。在低温冷藏条件下带回实验
室, 用蒸馏水冲洗后擦拭干净, 削取果皮, 液氮速
冻, 然后置于–80 ℃超低温冰箱贮藏备用。
2 方法
2.1 总RNA的提取和cDNA的合成
分别取100 mg冻存组织样品, 放于装有液氮
的研钵中研磨成粉末, 按照RNAplant Plus Reagent
(TIANGEN公司)法提取样品的总RNA, 1%琼脂糖
凝胶电泳鉴定总RNA的完整性, 并用NanoDrop
2000超微量分光光度计(Thermo公司)测定OD260/280
的值, 检测总RNA的纯度和浓度。然后置于–80 ℃
超低温冰箱保存备用。
按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA
Eraser (TaKaRa)方法去除基因组DNA后, 用RT
Primer Mix引物进行反转录反应。测定反转录后
cDNA的OD260/280值, 获得的cDNA产物直接用于
qRT-PCR或–20 ℃冰箱贮藏备用。
2.2 qRT-PCR内参基因的选择和引物设计
从NCBI数据库已公布的苹果及与其同源性
较高的序列中, 选择4个不同功能的常用内参基因,
即18S核糖体RNA基因(18S rRNA, accession No.
樊连梅等: 苹果着色期实时定量PCR内参基因的筛选和验证 1905
DQ341382)、β-肌动蛋白基因(β-actin, accession
No. CN578568)、转录延伸因子基因(EF-1α, acces-
sion No. AJ223969)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因
(GAPDH, accession No. DT000652)进行研究。
根据qRT-PCR引物的设计原则, 利用Primer
Premier 5.0软件, 分别设计18S rRNA、β-actin、
EF-1α和GAPDH这4个内参基因和二氢黄酮醇-4-
还原酶基因(DFR, Accession No. AF117268)的引物
(表1)。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限
公司合成。
表1 qRT-PCR检测中内参基因和MdDFR基因的引物序列
Table 1 Primer sequences of reference genes and MdDFR used in qRT-PCR analysis
基因名称 缩写 引物名称 引物序列(5→3) 扩增片段大小/bp
18S核糖体RNA 18S rRNA QF-Md18S CTACCACATCCAAGGAAG 105
QR-Md18S CCAATTACCAGACTCATAGA
β-肌动蛋白 β-actin QF-Md β-actin AGATGAACTTGCTTATGA 130
QR-Md β-actin TATGGATGGTTGGAATAG
转录延伸因子 EF-1α QF-MdEF-1α AACTGGTCTGACTACTGA 107
QR-MdEF-1α TGACAGCAACATTCTTAAC
甘油醛-3-磷酸脱氢酶 GAPDH QF-MdGAPDH CTAATGTATCGGTGGTTGA 117
QR-MdGAPDH CTGCCAATATGCCCTTAA
二氢黄酮醇-4-还原酶 DFR QF-MdDFR TGCTACAATTCACGAACT 131
QR-MdDFR CTATCTCCCTCAACTTCTTT

2.3 内参基因的qRT-PCR分析
向Axygen PCR管中加入qRT-PCR 20 µL反应
体系: SYBR® Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (2×)
10.0 µL、PCR forward和reverse引物(10 µmol·L-1)
各0.4 µL、ROX Reference Dye II 0.4 µL、模板
cDNA 2.0 µL、ddH2O 6.8 µL, 3次生物样品重复。
反应条件为: 95 ℃预变性30 s, 95 ℃变性5 s, 60 ℃
退火30 s, 72 ℃延伸34 s, 40个循环(根据不同的条
件可进行适当改变)。扩增结束后进行熔解曲线分
析检测扩增产物的特异性, 温度为65~95 ℃, 连续
测定样品的荧光强度获得熔解曲线。每个持家基
因的PCR扩增都设有未加模板的对照, 以检验扩增
的背景。反应仪器为ABI 7500 Real-Time PCR
System, 由荧光定量PCR仪自动读取数据。
2.4 数据处理和分析
qRT-PCR标准曲线的绘制: 每次反应检测1个
持家基因, 包括该基因标准曲线绘制和qRT-PCR,
共计4次反应。绘制标准曲线时用样品cDNA原液
进行5倍稀释, 作为qRT-PCR的cDNA工作液。横轴
为模板稀释倍数的对数值, 纵轴为平均CT值, 进行
标准曲线的绘制。
引物扩增效率验证 : 根据公式Q=EΔC t计算
各基因的相对表达量。其中, E为基因扩增效率,
E=101/k, k为标准曲线的斜率; ∆C t=最小C t–样品
Ct。将基因的相对表达量Q数据输入GeNorm (http://
medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/)程序分析, 得
到各内参基因在不同解袋时间的表达稳定值M
(geNorm程序的默认值为1.5)。对内参基因的表达
稳定度进行排序(M值越小, 表达越稳定), 并通过标
准化因子配对差异分析Vn/n+1 (阈值为0.15)来判定内
参基因的最适数目(Vandesompele等2002)。此外,
应用NormFinder (http://www.mdl.dk/publication-
snormfinder.htm)程序(Andersen等2004)对各个持家
基因的表达稳定性进行统计学分析, 从而筛选出最优
的内参基因, 并与geNorm程序分析结果进行比较。
实验结果
1 RNA的提取及样品质量检测
将各提取的样品总RNA用1.0%的琼脂糖凝胶
电泳进行检测。结果(图1)表明, 各样品的总RNA
均显示出整齐的rRNA条带, 都含有28S、18S和
5S 3条带, 28S和18S条带亮度清晰, 5S条带亮度
较弱, RNA的完整性比较好, 没有明显的降解现
象。利用微量紫外分光光度计进行检测, 所有样
品OD260/280值均在1.9~2.1之间, 表明RNA纯度较好,
可以满足后续试验研究的需要。RNA提取过程中
植物生理学报1906
3 内参基因qRT-PCR的溶解曲线分析
以苹果解袋时间不同的cDNA第一链为模板,
进行qRT-PCR分析。结果表明, 4个内参基因的熔
解曲线都有很明显的单一峰, 不存在引物二聚体
(图3)。这说明每个内参基因的引物均有很好的特
异性, 引物设计合理, 达到了优化要求, 反应的专
一性高, 结果准确可靠, 符合qRT-PCR的标准, 可进
行后续实验。
4 内参基因的稳定性评价
合适的内参基因是利用qRT-PCR准确分析基
因表达的重要瓶颈, 为了筛选适合的内参基因, 应
用geNorm程序对候选的4个内参基因在各样品中
的相对表达量进行统计分析, 计算出4个内参基因
的表达稳定值M。M值与基因的稳定性呈负相关,
即M值越小, 稳定性越高。由图4可知, 4个内参基
因表达稳定性的排列顺序为EF-1α (0.436)>18S
rRNA (0.444)>β-actin (0.704)>GAPDH (0.897)。这
表明, 4个候选的内参基因M值都小于geNorm程序
的默认值1.5, 其中EF-1α和18S rRNA的M值均小于
0.5, 更适合样品的校正。
应用qRT-PCR分析基因的表达时, 使用1个内
参基因校正往往达不到实验要求, 造成的实验误
差要比使用 2个以上内参基因高得多。通过
geNorm程序分析内参基因的配对差异值Vn/n+1, 此
程序默认的V值为0.15。当Vn/n+1大于0.15时, 需要
引入第n+1基因; 当Vn/n+1小于0.15时, 则不需要引入
新的内参基因。由于本实验中V2/3为0.122, 小于
0.15, 所以不必引入第3个基因进行校正, 内参基因
最适数目为2个, 即EF-1α和18S rRNA。
同样, 通过NormFinder程序分析获得的候选
内参基因在不同解袋时间苹果果皮中的表达稳定
值。结果表明, EF-1α表达稳定值为0.172, 是最优
的内参基因。其次是18S rRNA, 表达稳定值为
0.196。β-actin和GAPDH的表达稳定值分别为
0.661和0.743。geNorm和NormFinder两种程序分
析结果相符合, 所以利用qRT-PCR分析比较苹果着
色期的基因表达差异时, 可选择EF-1α和18S rRNA
作为校正内参基因。
进一步通过半定量PCR分析苹果不同解袋时
间的各内参基因转录水平。电泳结果(图5)表明,
EF-1α和18S rRNA在各解袋时间的表达稳定性比
β-actin和GAPDH的好。上述情况说明, EF-1α和
图1 RNA提取产物琼脂糖凝胶电泳图谱
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RNA extraction product
1~6: 解袋0、3、5、7、9和11 d果皮RNA。
基因组DNA用DNase I已经去除, 从而能够避免对
下一步基因表达的影响。
2 内参基因引物扩增特异性的检测
以反转录cDNA为模板, 应用普通PCR对4个
内参基因引物的特异性进行检测。PCR扩增产物
用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。由图2可见, 扩增
出的条带单一, 引物的特异性和准确性很好, 扩增
反应有较高的专一性, 没有扩增的杂带和引物二
聚体生成。扩增片段经过克隆测序与目的基因进
行序列比对分析, 结果表明序列一致。内参基因
EF-1α、GAPDH、β-actin和18S rRNA的PCR扩增
产物, 大小分别为107、117、130和105 bp。
图2 苹果内参基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
Fig.2 Agarose electrophoresis analysis of the PCR
products of reference genes in apple
M: DL2000 DNA marker; 1: EF-1α; 2: GAPDH; 3: β-actin; 4:
18S rRNA。
樊连梅等: 苹果着色期实时定量PCR内参基因的筛选和验证 1907
图3 四个内参基因和MdDFR基因的溶解曲线
Fig.3 Melting curves of four reference genes and MdDFR gene
A: EF-1α; B: 18S rRNA; C: β-actin; D: GAPDH; E: MdDFR。
18S rRNA可作为稳定的内参基因用于苹果花青苷
生物合成途径相关基因表达的研究。
5 内参基因稳定性的验证
用内参基因EF-1α和18S rRNA基因对苹果花
青苷生物合成途径的关键结构基因MdDFR的表达
水平进行分析, 从而验证这2个内参基因对qRT-
PCR分析基因表达的影响。由图6可知, 以它们为
内参基因分析苹果着色期MdDFR基因的表达水
平, 其表达规律基本一致, MdDFR基因在解袋当天
表达水平很低。解袋3~5 d, 表达量缓慢升高。但
是到解袋第7天时表达水平急剧上升, 用EF-1α为
内参基因时, 第7天MdDFR基因的表达水平是第5
天的2.44倍; 用18S rRNA为内参基因时, 第7天
MdDFR基因的表达水平是第5天的3.70倍。解袋
植物生理学报1908
图4 GeNorm检测的各内参基因表达稳定值(M)
Fig.4 Expression stability values (M) of reference genes
calculated by geNorm
图6 不同解袋时间的苹果MdDFR的表达水平
Fig.6 Expression levels of MdDFR in different
debagging time of apple
第9天MdDFR基因表达量急剧下降, 以EF-1α为内
参基因时, 第9天MdDFR基因的表达水平是第7天
的0.46倍 ; 以18S rRNA为内参基因时 , 第9天
MdDFR基因的表达水平是第7天的0.33倍。解袋
第11天的表达量相对于第9天而言呈下降趋势。这
说明采用EF-1α和18S rRNA内参基因进行校正分
析苹果着色期相关基因表达水平时, 相对定量结
果比较一致, 这2个内参基因适合进行苹果着色期
基因表达的研究。
讨　　论
基因表达模式的研究方法主要有Northern印
迹、竞争性RT-PCR、基因芯片和qRT-PCR等。
Northern印迹技术操作比较复杂, 耗费时间长; 竞
争性RT-PCR技术很难选择合适的内标RNA; 基因
芯片则对样品质量的要求比较高, 而且价格比较
昂贵; 而qRT-PCR技术克服了上述方法的诸多弱
点, 具有高灵敏性、高特异性、高精确性和低成
本的特点, 已被广泛用于转录水平基因的表达分
析。然而, qRT-PCR检测结果的准确性除了要受到
诸如引物的特异性、实验设计的合理与否、扩增
产物的长度、RNA样品的质量、cDNA反转录效
率、PCR仪不同反应孔道的稳定性、操作方式是
否规范等诸多因素的影响外, 更重要的是还要受
到内参基因稳定性的影响(Udvardi等2008)。qRT-
PCR是对基因表达的准确定量分析, 不经筛选直接
采用18S rRNA和GAPDH等持家基因作为内参基因
可能降低实验结果的准确性, 甚至得到相反或错
误的结论。持家基因由于表达丰度高, 如果目的
基因表达被上调或下调, 就能明显表现出来。但
大量的研究表明, 持家基因表达并非恒定, 其表达
量随着细胞和组织类型、生理状况、发育期等的
不同而表现差异(Thellin等1999; Lee等2002; Hug-
gett等2005)。因此, 在利用qRT-PCR进行基因表达
的研究中, 需要根据不同的试验条件、试验样品
和不同发育期等, 筛选适合的、稳定表达的内参
基因, 对实验数据进行准确校正和标准化后才能
得到可靠的定量结果。
鉴于此, 本文先选择geNorm和NormFinder程
序对候选内参基因进行评估, 并通过实验对其做
了进一步的筛选验证, 以期为苹果着色期基因表
达分析中内参基因的选择提供实验依据。本文结
果表明, 4个候选内参基因M值不同, 介于0.436~
0.897之间。各内参基因稳定性排序从大到小依次
为EF-1α、18S rRNA、β-actin和GAPDH。用
图5 苹果不同解袋时间的各内参基因转录水平
Fig.5 Transcript levels of reference genes in different
debagging time of apple
樊连梅等: 苹果着色期实时定量PCR内参基因的筛选和验证 1909
geNorm程序对内参基因评估时通常考虑2个主要
参数, 即稳定值M和配对差异值Vn/n+1。前者决定内
参基因稳定性次序, 后者则考查内参基因的适宜
数目。geNorm程序关于理想内参基因筛选的临界
值为1.5, 本实验4个候选基因的M值均小于此阈值,
说明均可用于苹果着色期基因表达的研究。内参
基因的M值越小, 其稳定性越高, 实验结果越精确,
置信度也相对较高。EF-1α和18S rRNA的M值均小
于0.5, 说明这两者更适合试验样品的校正(Helle-
mans等2007)。应用qRT-PCR分析基因的表达时,
使用单一内参基因校正造成的实验误差要比使用
2个以上内参基因高得多, 往往达不到实验要求,
这在葡萄(Reid等2006)、大豆(Gutierrez等2008)和
马铃薯(Expósito-Rodríguez等2008)等研究中已有
相关报道。在本实验中, geNorm程序分析内参基
因的配对差异值V2/3为0.122, V3/4为0.105, 均小于
0.15。考虑到内参基因的适用性和实验的经济性,
可不必引入第3个内参基因进行校正。但是, 0.15
这个阈值只是一个理想值, 有时内参基因数目的
选择也要根据具体实验数据来确定。综合考虑
geNorm程序所给出的候选基因M值和Vn/n+1值, 本
实验内参基因最适数目为2个 , 即EF-1α和18S
rRNA。
为检验筛选的内参基因的可靠性, 本文又用
NormFinder程序评估了4个候选内参基因的表达稳
定性, 发现EF-1α表达稳定值最小, 是最优的内参
基因, 其次是18S rRNA。geNorm程序和NormFind-
er程序因算法不同, 尽管给出的内参基因稳定值不
同 , 但两者的分析结果比较相似。用内参基因
EF-1α和18S rRNA对MdDFR基因的表达水平进行
分析, 发现其表达规律比较一致。上述结果进一
步证实EF-1α和18S rRNA可作为理想的内参基因
用于苹果着色期相关基因表达的研究。
内参基因在不同物种间没有绝对的通用性,
也很难找到适于不同组织和发育时期的理想的内
参基因(胡瑞波等2009)。因此, 在基因定量表达研
究中, 通常需借助特异的内参基因的选择对实验
进行校正和标准化处理 , 进而去除不同样本在
RNA产量、质量和反转录效率上可能存在的差别,
并获得目标基因特异性表达的真正差异。目前,
内参基因稳定性评价程序包括geNorm、Norm-
Finder和BestKeeper (http://www.wzw.tum.de/gene-
quantification/bestkeeper.html) (张玉芳等2014)。虽
然这3种程序都基于候选内参基因实时定量PCR
的Ct值而设计, 但其各自计算原理和方法不同, 所
分析结果有时会呈现一些差异(Hu等2010)。在黄
瓜和柑橘等植物的持家基因研究中也有类似文献
报道(Wan等2010; Mafra等2012)。其中, geNorm
程序在评价和筛选稳定的内参基因方面更加完
善, 其作用更加重要, 该程序不考虑其他内参基因
来选择合适的内参基因(Vandesompele等2002;
Infante等2008); 而NormFinder程序则考虑其他的
内参基因再选择合适的内参基因(Andersen等
2004); BestKeeper程序既能分析内参基因稳定性,
又能比较目的基因表达水平(Pfaffl等2004)。在实
际应用中, 应充分考虑上述程序的适用性和特点,
确保内参基因选择的准确性, 以减少不必要的实
验误差。
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