全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (9): 864~868864
收稿 2012-05-16　　修定 2012-06-20
资助 湖南省科学技术厅科研条件创新专项(2010TC2002)、湖
南省高校产业化培育项目(11CY014)和湖南省高校科技创
新团队支持计划[湘教通(2010)212号]。
* 通讯作者(E-mail: duyatian6688@163.com; Tel: 0744-
8231386)。
南方红豆杉试管微芽诱导培养及其紫杉醇类化合物的积累
张翔宇, 杜亚填*, 龚雪元
吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室, 湖南张家界427000
摘要: 以南方红豆杉幼茎段和茎尖为外植体, 以WPM为基本培养基, 单一添加不同浓度的KT、TIBA、ZT和6-BA进行芽诱
导培养。结果表明: 各自添加0.4 mg·L-1 KT、3.0 mg·L-1 TIBA、0.1 mg·L-1 ZT和0.01 mg·L-1 6-BA时的芽诱导率最高。培养
50 d的试管微芽中紫杉醇和10-去乙酰基巴卡亭III (10-DABIII)的积累量比天然南方红豆杉嫩枝高2倍以上, 试管微芽中
10-DABIII比紫杉醇高, 且二者均随芽诱导率的增加而增加, 当芽诱导率达最高时亦达到最高。TIBA所诱导芽短而粗壮。
关键词: 南方红豆杉; 芽诱导; 培养; 紫杉醇; 10-去乙酰基巴卡亭III
The Induction and Culture of Taxus chinensis var. mairei Test-Tube Micro-
Shoots and the Paclitaxel Compounds Accumulation in the Shoots
ZHANG Xiang-Yu, DU Ya-Tian*, GONG Xue-Yuan
Key Laboratory of Hunan Forest Products and Chemical Industry Engineering, Jishou University, Zhangjiajie, Hunan 427000, China
Abstract: The test-tube micro-shoots were induced and cultured with Taxus chinensis var. mairei young stem
segments and shoot tip in WPM medium supplemented with different concentrations of KT, TIBA, ZT, and
6-BA, respectively. The results showed that the induction rate of the bud was the highest when WPM medium
supplemented with 0.4 mg·L-1 KT, 3.0 mg·L-1 TIBA, 0.1 mg·L-1 ZT, and 0.01 mg·L-1 6-BA, respectively. The ac-
cumulated volume of paclitaxel and 10-DABIII in test-tube micro-shoots at 50 days was more 2 times than the
volume in the nature epicormic branch of T. Chinensis var. mairei. The content of 10-DABIII was much higher
than paclitaxel in the buds. The accumulated volume of two compounds increased with increasing the bud in-
duction rate, and the accumulation volume also reached the highest when the buds induction rate was the high-
est. The induced buds were short and stout when the medium supplemented with TIBA.
Key words: Taxus chinensis var. mairei; bud induction; culture; paclitaxel; 10-DABIII
南方红豆杉是红豆杉在中国的一个变种(中
国科学院植物研究所编辑委员会1978), 是国家一
级保护树种。从红豆杉植物中提取的紫杉醇(pa-
clitaxel)是制备泰素(Taxol)的主要原料, 是治疗肺
癌、卵巢癌、乳腺癌的一线临床用药, 且对恶性
黑色素瘤、头颈部肿瘤、白血病、结肠癌等也有
明显疗效(夏洪平2005; 傅喆暾等2006)。紫杉醇的
前体类似物10-去乙酰基巴卡亭III (10-DABIII)是
合成多西他赛(Docetaxel) (Bissery等1991)的天然
原料, 其具有比紫杉醇更高的抗癌活性。自然状
态下, 紫杉醇主要存在于树皮和须根中(张翔宇和
杜亚填2012), 而10-DABIII在树叶中含量高。
Amos和McCown (1981)进行红豆杉微繁研究
时发现, 低浓度6-BA有利于芽诱导, 高浓度6-BA抑
制芽伸长生长。Barnes (1983)发现加拿大红豆杉
茎尖在含1 mg·L-1 6-BA的WPM培养基上腋芽生长
良好。Chee (1995)将短叶红豆杉的离体胚接种于
含6-BA 10 μmg·L-1的1/2 B5培养基上, 培养14 d后
诱导出了不定芽原基, 经培养58%的芽产生了根,
90 d后得到了生长良好的小植株。杨振国等(1997)
用东北红豆杉幼枝顶芽在MS基本培养基中诱导出
了丛生芽。本实验以WPM为基本培养基, 通过添
加不同浓度激动素 ( K T )、2 , 3 , 5 -三碘苯甲酸
(TIBA)、玉米素(ZT)和6-苄基腺嘌呤(6-BA)进行
研究报告 Original Papers
张翔宇等: 南方红豆杉试管微芽诱导培养及其紫杉醇类化合物的积累 865
南方红豆杉茎段的芽诱导培养, 研究了4种植物生
长调节剂单一使用对南方红豆杉芽诱导培养及试
管微芽中紫杉醇和10-DABIII积累量的影响, 为南
方红豆杉芽器官培养生产紫杉醇提供基础。
材料与方法
1 材料
采自吉首大学林产化工工程湖南省重点实验
室红豆杉课题组南方红豆杉[Taxus chinensis var.
mairei (Lemee et Levi.) Cheng et L. K. Fu]种苗基地
约20年生南方红豆杉树一年生新梢。
2 材料接种处理
将摘除叶片、剪成小段的南方红豆杉茎段置
于加有洗衣粉水的烧杯中搅拌清洗30 min, 自来水
冲洗2 h, 取出晾干表面水后剪成约2.5 cm小段, 于
超净工作台中用75%的酒精消毒30 s, 无菌水清洗
4次后再用0.2%的HgCl2溶液消毒8 min, 无菌水清
洗6次后接种于添加不同种类和浓度植物生长调
节剂的WPM培养基上。每个处理接种18个外植
体, 重复3次。接种后于人工气候箱中培养, 培养
温度: 白天(25±3) ℃, 晚上(20±3) ℃, 光照强度: 30
µmol·m-2·s-1, 相对湿度80%±5%。培养30 d后计算
萌发率, 萌发率=(萌发外植体个数/接种外植体个
数)×100%。
3 检测样制备
将培养50 d后的芽剪下, 在烘箱中45 ℃烘干,
称重后研磨成粉, 过0.25 mm筛, 于三角瓶中用10
倍量乙酸乙酯:丙酮(1:1, V/V)浸提过夜, 30 ℃超声
30 min; 残渣用5倍量乙酸乙酯:丙酮(1:1, V/V)浸提
过夜, 30 ℃超声30 min; 残渣再用3倍量乙酸乙酯:
丙酮(1:1, V/V)浸提过夜, 30 ℃超声30 min后过滤,
将3次滤液合并浓缩, 再将浸膏与二氯甲烷(1:1, V/
V)混合充分溶解, 再加入与二氯甲烷等量的水充分
混合后, 缓慢搅拌静置2 h分层, 收集下部二氯甲烷
有机相 , 保留水相及有机相与水相之间的乳化
层。分液、合并有机相, 过滤浓缩干燥得紫杉醇
粗提物。水相及中间乳化层用乙酸乙酯萃取4次,
合并有机相, 用0.1 mol·L-1碳酸钠洗涤除去杂质, 再
用去离子水洗涤2次, 用硫酸钠干燥, 过滤浓缩得
10-DABIII粗提物。最后将两个粗提物分别用甲醇
定容至10 mL, 超声脱气, 各自用0.45 μm滤膜过滤
至Tube管中备检。
4 色谱条件
4.1 紫杉醇检测条件
色谱柱: MetaChem Taxsil (5 μm, 250 mm×4.6
mm, 美国迪马公司紫杉醇检测专用色谱柱); 流动
相: 乙腈:水=1:1 (V/V); 进样量: 20 μL; 流速: 1.0
mL·min-1; 柱温: 30 ℃; 检测波长: 227 nm。
仪器: 高效液相色谱仪(LC-20AT, 日本岛津),
紫外检测器(SPD-20A, 日本岛津), LCsolution色谱
数据工作站(日本岛津公司)。
4.2 10-DABIII色谱检测条件
色谱柱 : 同4.1节 ; 流动相 : 甲醇 :乙腈 :水=
30:30:40 (V/V/V); 进样量、流速、柱温和检测波长
均同4.1节。
仪器: 与4.1节同。
5 对照品溶液的制备
用感量为0.01 mg半微量天平准确称取1.7 mg
10-DABIII和1.4 mg紫杉醇对照品, 分别置于50 mL
容量瓶中, 并用甲醇溶解定容, 超声脱气, 0.45 μm
滤膜过滤, 后于冰箱中冷藏备用。
6 回归方程
将对照品溶液于冰箱中取出, 适当摇匀后静
置, 用移液管分别移取1、2、3、4、5 mL于10 mL
容量瓶中甲醇定容, 分别用0.45 μm微孔滤膜过滤
至Tube管中备检。采用外标法得紫杉醇回归方程
为: y=3×10-11x–5×10-8 (r2=0.999), 10-DABIII回归方
程为: y=4×10-12x–1×10-7 (r2=0.998)。
实验结果
1 不同浓度KT对芽诱导及芽中紫杉醇和10-DABIII
含量的影响
从表1可以看出, KT浓度从0.1 mg·L-1升至0.4
mg·L-1时, 芽诱导率也从33.33%上升至83.33%, 当
KT浓度从0.4 mg·L-1继续上升至1.0 mg·L-1时, 芽诱
导率开始显著下降, 由0.4 mg·L-1的83.33%下降至
1.0 mg·L-1的16.67%。所以, 在WPM中单一添加KT
的最佳浓度为0.4 mg·L-1。芽萌发启动的时间为15
d左右, 以茎段上出现黄绿色腋芽突起为信号, 开
始萌发产生腋芽, 之后生长迅速, 25 d左右开始展
叶, 芽由黄绿色渐变为绿色(图1-A), 伴随芽的生
长, 培养基表面逐渐出现内生真菌, 但其不影响芽
植物生理学报866
的生长。50 d后取微芽检测紫杉醇和10-DABIII的
含量, 从表1可看出10-DABIII的积累量远高于紫杉
醇, 但KT浓度对微芽中两种化合物积累量的影响
没有规律性, 在0.4 mg·L-1时最高。但两种化合物
在试管芽中的积累量与芽诱导率的高低变化基本
一致, 当芽诱导率最高时两者含量也最高。
2 不同浓度TIBA对芽诱导及芽中紫杉醇和10-DABIII
含量的影响
从表2可以看出, 添加TIBA的浓度小于0.1
mg·L-1或者最高达到4.5 mg·L-1时均不能诱导产生
芽, 在0.1~2.0 mg·L-1之间时, 诱导率相对较低, 3.0
mg·L-1时诱导率达到最高, 为100%。TIBA诱导产
生的芽体短而粗壮(图1-B), 后期芽的伸长生长比
较缓慢, 紫杉醇的含量较KT的低, 但10-DABIII的
含量较紫杉醇要高得多。TIBA的浓度在0.1~3.0
mg·L-1时, 根据已检出数据, 两种化合物的含量随
TIBA浓度的升高而升高 , 当TIBA浓度超过3.0
mg·L-1时, 则随TIBA浓度的升高而降低, 且与KT的
结果一样, 也随芽诱导率的高低变化同步, 当芽诱
导率最高时, 二者在芽体中的含量也最高。
3 不同浓度ZT对芽诱导及芽中紫杉醇和10-DABIII
含量的影响
从表3可以看出, 添加0.1 mg·L-1 ZT时的芽诱
导率最高, 为100%, 添加0.05 mg·L-1 ZT时, 微芽中
紫杉醇与10-DABIII的含量最高, 分别为0.0076%
和0.0322%, 说明较低浓度的ZT有利两者的合成积
表1 KT对南方红豆杉芽诱导及芽中紫杉醇和10-DABIII含量的影响
Table 1 Effects of KT on the buds induction of T. Chinensis var. mairei and the contents of paclitaxel and 10-DABIII in the buds
试验号 KT浓度/mg·L-1 诱导时间/d 诱导率/% 平均芽长/cm 紫杉醇含量/% 10-DABIII含量/%
1 0.1 20 33.33 2.21 0.0076±0.0010Bb 0.0127±0.0002Aa
2 0.2 18 44.44 2.53 0.0063±0.0001Cc 0.0125±0.0001Aa
3 0.4 14 83.33 3.55 0.0084±0.0001Aa 0.0127±0.0001Aa
4 0.6 15 66.67 2,98 0.0053±0.0001Dd 0.0117±0.0005Bb
5 0.8 18 38.89 2.34 0.0063±0.0001Cc 0.0122±0.0000ABa
6 1.0 22 16.67 1.93 0.0038±0.0001Ee 0.0117±0.0002Bb
　　表中数据旁标注字母为Duncan统计结果, 同列不同大写字母表示差异极显著(P<0.01), 不同小写字母表示差异显著(P<0.05), 下表同。
图1 培养基中添加KT (A)、TIBA (B)、ZT (C)和6-BA (D)后诱导的芽
Fig.1 The induced bud in the medium supplemented with KT (A), TIBA (B), ZT (C) and 6-BA (D)
张翔宇等: 南方红豆杉试管微芽诱导培养及其紫杉醇类化合物的积累 867
累。相同时间内芽的平均长度比KT和TIBA所诱
导芽要长, 芽体呈绿色(图1-C), 也伴生内生真菌,
对芽生长无不利影响。微芽中紫杉醇和10-DABIII
的含量比KT和TIBA所诱导培养的要高, 10-DABIII
的含量是前二者的近2倍, 达0.0322%, 说明较低浓
度ZT才有利于紫杉醇和10-DABIII的合成积累, 即
两种化合物的合成积累与ZT的浓度呈负相关, 二
者随ZT浓度的增加而减少。两种化合物的合成积
表2 TIBA对南方红豆杉芽诱导及芽中紫杉醇和10-DABIII含量的影响
Table 2 Effects of TIBA on the buds induction of T. chinensis var. mairei and the contents of paclitaxel and 10-DABIII in the buds
试验号 TIBA浓度/mg·L-1 诱导时间/d 诱导率/% 平均芽长/cm 紫杉醇含量/% 10-DABIII含量/%
1 0.01 未见萌发
2 0.05 未见萌发
3 0.10 25 16.67 1.21 未检出 未检出
4 0.50 25 22.22 1.35 未检出 0.0138±0.0001Dd
5 1.00 25 22.22 1.42 未检出 0.0110±0.0001Ff
6 1.50 20 33.33 1.58 未检出 0.0123±0.0001Ee
7 2.00 18 55.56 1.74 0.0024±0.0001Cd 0.0138±0.0001Dd
8 2.50 16 61.11 1.73 0.0038±0.0000Bc 0.0162±0.0001Bb
9 3.00 15 100.00 1.82 0.0042±0.0002Aa 0.0173±0.0003Aa
10 3.50 15 83.33 1.67 0.0040±0.0001Ab 0.0153±0.0002Cc
11 4.00 23 22.22 1.12 未检出 未检出
12 4.50 未见萌发
表3 ZT对南方红豆杉芽诱导及芽中紫杉醇和10-DABIII含量的影响
Table 3 Effects of ZT on the buds induction of T. chinensis var. mairei and the contents of paclitaxel and 10-DABIII in the buds
试验号 ZT浓度/mg·L-1 诱导时间/d 诱导率/% 平均芽长/cm 紫杉醇含量/% 10-DABIII含量/%
1 0.05 16 66.67 2.52 0.0076±0.0001Aa 0.0322±0.0001Aa
2 0.10 14 100.00 3.89 0.0065±0.0001Bb 0.0279±0.0001Bb
3 0.50 15 94.44 4.06 0.0063±0.0001Cc 0.0214±0.0001Cc
4 1.00 15 88.89 3.77 0.0059±0.0001Dd 0.0199±0.0001Dd
5 2.00 16 66.67 3.08 0.0049±0.0001Ee 0.0166±0.0001Ff
6 3.00 25 16.67 1.83 未检出 0.0176±0.0001Ee
累同时也与上述的结果一样, 与芽诱导率的高低
变化同步。
4 不同浓度6-BA对芽诱导及芽中紫杉醇和10-DABIII
含量的影响
添加不同浓度6-BA的结果(表4)显示, 0.01
mg·L-1 6-BA的诱导效果最好, 诱导率为100%, 之后
随着浓度的升高, 其诱导率下降非常明显, 到1.0
mg·L-1时已基本没有芽产生, 外植体开始干枯变
表4 6-BA对南方红豆杉芽的诱导及芽中紫杉醇和10-去乙酰基巴卡亭III的含量
Table 4 Effects of 6-BA on the buds induction of Taxus chinensis var. mairei and the contents of paclitaxel and 10-DABIII in the buds
试验号 6-BA浓度/mg·L-1 萌发时间/d 萌发率/% 平均芽长/cm 紫杉醇含量/% 10-DABIII含量/%
1 0.01 13 100.00 3.88 0.0072±0.0001Aa 0.0398±0.0001Aa
2 0.05 15 94.44 3.76 0.0071±0.0001Ab 0.0358±0.0002Bb
3 0.10 15 77.78 3.23 0.0068±0.0001Bc 0.0291±0.0001Cc
4 0.15 15 66.67 3.06 0.0038±0.0001Cd 0.0209±0.0001Dd
5 0.20 16 44.44 2.44 未检出 0.0180±0.0001Ee
6 0.40 20 38.89 2.43 未检出 未检出
7 0.60 20 33.33 2.08 未检出 未检出
8 0.80 20 22.22 1.63 未检出 未检出
9 1.00 未见萌发
植物生理学报868
黑。6-BA诱导产生的芽生长良好, 颜色鲜绿(图
1-D), 与上述相同, 也有内生真菌伴生, 对芽体生长
也无不良影响。芽中紫杉醇的含量与KT和ZT处
理的接近, 10-DABIII的含量与前面几组相比为最
高, 达0.0398%。二者的合成积累也与6-BA的添加
浓度呈负相关, 以最低(0.01 mg·L-1)时为最高, 紫杉
醇和10-DABIII含量分别为0.0072%和0.0398%。
且像上述3种生长调节剂的结果一样, 试管芽中两
种化合物的合成积累量也与芽诱导率的高低变化
相一致, 这说明芽诱导发生越旺盛, 南方红豆杉植
物细胞中的次生代谢就越活跃。
讨　　论
浩仁拓本和赵颖(2004)进行东北红豆杉快速
繁殖研究时发现, 以MS为基本培养基添加KT易脱
分化产生愈伤组织。曾余力等(2010)发现在WPM
培养基中添加0.1 mg·L-1 KT和1.0 mg·L-1 ZT时最有
利于不定芽的诱导。本实验用南方红豆杉一年生
茎段直接诱导芽增殖时发现, KT和ZT均能较快诱
导腋芽增殖, 但ZT以0.1 mg·L-1为最好, 这可能与所
用外植体有关。杨振国等(1997)报道不定芽的形
成与6-BA/IBA比值及母树年龄有关。程广有和王
明启(2000)、马均和马明东(2007)则报道6-BA对
芽的启动非常必要, 低浓度6-BA有利于启动率的
提高。因此, 南方红豆杉试管微芽诱导培养还有
待从外植体筛选、植物内源激素分析、基本培养
基筛选等方面作进一步的系统研究。
本实验首次运用TIBA进行南方红豆杉芽诱
导研究。Zakrzewski (1983)研究报道TIBA通过抑
制生长素的极性运输降低生长素的作用效力, 是
一种具有微弱生长素作用的抗生长素。我们的研
究结果表明, TIBA诱导产生的芽比添加其他几种
调节剂的芽要短而粗壮, 芽体颜色呈深绿色。实
验采用HPLC法对所诱导芽中紫杉醇和10-DABIII
的积累量进行检测后发现, 在一定范围内, 与芽诱
导率呈正相关, 当芽诱导率达到最高时, 二者的积
累量亦达到最高, 这种同步反应的生物学意义还
有待进一步研究, 但二者的积累量均与芽诱导率
高度一致, 说明诱导植物腋芽发生的同时, 植物次
生代谢也同样受到了诱导而增强, 我们在进行诱
导南方红豆杉愈伤组织再分化的研究中也发现,
再分化产生不定芽的愈伤组织中这两种化合物的
含量比未分化的要高几倍, 因此可以认为南方红
豆杉细胞的次生代谢存在随芽分化发生活跃而活
跃的规律, 其他植物是否存在同样的规律, 值得进
一步研究。两种化合物在微芽中的合成积累均表
现出与细胞分裂素类生长调节剂添加量呈负相关
的趋势, 这表明细胞在高速分裂时对次生代谢具
有一定抑制作用。微芽中两种化合物的合成积累
量较徐慧敏(2010)所测南方红豆杉天然嫩枝高2倍
以上, 紫杉醇的含量与张翔宇和杜亚填(2012)所测
野生南方红豆杉枝叶中的含量基本一致, 说明利用
试管微芽培养生产紫杉醇具有可行性, 若辅以后期
针对增加产物的诱导, 加之芽器官的遗传稳定性较
悬浮细胞要高得多, 故利用试管微芽培养生产植物
有用次生代谢产物应是一条极有开发前景的途
径。内生真菌的伴生效应还有待进一步研究。
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