全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1963~1968　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.0423 1963
收稿 2015-07-24　　修定 2015-10-27
资助 山东省果树研究所所长基金(2012KY06)和国家桃产业体
系(CARS-31)。
* 通讯作者(E-mail: yuxianmei95@163.com; Tel: 0538-
8266591)。
三种桃病毒病害初步调查及病原检测
王海荣, 张安宁, 刘伟, 安淼, 董晓民, 余贤美*
山东省果树研究所, 山东泰安271000
摘要: 从山东省果树研究所桃试验基地采集‘玉妃’、‘超红’、‘岱妃’三个桃品种的幼嫩枝条22份样品, 利用6种病毒引物进
行RT-PCR检测, 对桃病毒病的发生情况进行调查。结果表明, 从样品中扩增获得与苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf
spot virus, ACLSV)、李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ring spot virus, PNRSV)、樱桃绿环斑驳病毒(cherry green ring mot-
tle virus, CGRMV)预期大小一致的目的片段, 其中, 从‘玉妃’桃中检测到ACLSV和CGRMV, 从‘超红’桃中检测到PNRSV, 从
‘岱妃’桃中检测到CGRMV; 3种病毒中ACLSV和PNRSV的检出率为13.64%, CGRMV的检出率为40.91%。
关键词: 桃; 病毒病; 病原检测
Preliminary Investigation of Viral Diseases and Detection of the Pathogens
from Three Cultivars of Peach
WANG Hai-Rong, ZHANG An-Ning, LIU Wei, AN Miao, DONG Xiao-Min, YU Xian-Mei*
Shandong Institute of Pomology, Tai’an, Shandong 271000, China
Abstract: Virus diseases of peach were investigated by RT-PCR using 6 virusal primers from 22 young stems
of three varieties (Prunus persica cv. ‘yufei’, ‘chaohong’ and ‘daifei’) sampled from the resources nursery of
Shandong institute of pomology. The results showed that apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), prunus
necrotic ring spot virus (PNRSV), cherry green ring mottle virus (CGRMV) were detected from the samples
with the detection ratio of 13.64%, 13.64%, and 40.91%, respectively, of which, ACLSV and CGRMV were
detected from ‘yufei’, PNRSV from ‘chaohong’, and CGRMV from ‘daifei’.
Key words: peach; viral diseases; pathogen detection
桃(Prunus persica)系蔷薇科(Rosaceae)、李属
桃亚属(Amygdalus)的多年生中型乔木, 在我国有
着悠久的栽培历史。近年来, 随着栽培面积的不
断扩大以及栽培中的苗木引种和调运、无性繁殖
代数增多等因素 , 加快了桃病毒病的传播和发
生。桃树病毒病常引起叶片褪绿、斑驳、花叶、
皱缩及枝条节间缩短变粗等 , 症状会因病毒株
系、寄主品种的感病性以及环境条件的不同而有
所差异(刘建和杨莉莉1999; 于绍夫等1992)。桃病
毒病的发生能够降低发芽率, 延迟开花, 产量下降,
严重时导致花芽死亡, 果实品质变劣, 极大地影响
了桃树的经济价值(李青等1993; 王国平和洪霓
1997; Desvignes和Boye 1998)。
据报道, 国内外桃树上发现的病毒病已有30
余种(于绍夫等1992; 李青等1993)。当前, 我国桃
树上的病毒病原主要有苹果褪绿叶斑病毒(apple
chlorotic leaf spot virus, ACLSV)、李属坏死环斑
病毒(prunus necrotic ring spot virus, PNRSV)、李
矮缩病毒(prune dwraf virus, PDV)、樱桃绿环斑驳
病毒(cherry green ring mottle virus, CGRMV)、杏
假褪绿叶斑病毒(apricot pseudo-chlorotic leaf spot
virus, APCLSV)和李树皮坏死茎纹孔伴随病毒
(plum bark necrosis stem pitting-associated virus,
PBNSPaV) (李世访和卢美光2013; 傅润民1998;
Parakh等1995)等。ACLSV能够使叶片枝条和果实
产生明显病害症状, 许多栽培品种感染此病毒后
可减产30%~40% (Nemchinov等1995; Wu等1998;
Cembali等2003)。PNRSV在苗圃里能够引起严重
病害, 使树体在花芽期和生长期长势不一致, 延迟
果实成熟, 严重时导致花芽和根死亡。接穗和砧
木感染P N R S V时会导致发芽率降低 ( L a n g等
植物生理学报1964
1998)。APCLSV主要引起枝条和茎干开裂、凹陷,
叶片萎缩坏死, 有斑点, 叶脉黄化, 畸形等症状(李
世访和卢美光2013)。PBNSPaV的侵染会导致果
实变小, 变形, 表皮褶皱, 成熟延迟等症状(李世访
和卢美光2013)。PDV能够引起桃新梢短缩病症状
和丛簇衰退病症状, 当PDV与PNRSV混合侵染时,
在出现症状的当年就会减产三成, 翌年减产达六
成(于绍夫1994); CGRMV能够导致叶片黄斑、环
状斑驳、畸形, CGRMV和ACLSV对大多数李属果
树表现出潜伏侵染(Polák和Svoboda 2006; Ulubas
和Ertunc 2005; Zhang等1998)。据此, 笔者对‘玉
妃’、‘超红’、‘岱妃’ 3个桃新品种的病毒病进行检
测, 以此为桃脱毒苗的研究提供重要依据。
材料与方法
1 材料
1.1 供试植物
于2014年9月份, 对山东省果树研究所桃试验
基地(泰安)的‘玉妃’、‘超红’、‘岱妃’ 3种桃[Prunus
persica (L.) Batch]的病毒病发生情况进行调查。
‘玉妃’和‘超红’各选10棵树, ‘岱妃’选2棵树, 每棵树
采集10个枝条作为一个样品, 随机采集有疑似病
毒病和无发病症状的幼嫩部位枝条, 装入塑料袋,
编号标记后立即放入冰盒, 将枝条带回实验室取
叶片作为待测样品, 部分采样枝条见图1。
1.2 主要试剂
TRIzol试剂(商品名为TRNzol Reagemt)购自
北京天根生化科技有限公司; AxyPrep DNA凝胶回
收试剂盒购自Axygen试剂公司。
2 试验方法
2.1 总RNA的提取
采用TRIzol法(He等2011)提取桃叶片的总
RNA, 并稍作改进。具体步骤如下: 取0.1 g植物组
织, 加入2 mL EP管中, 经液氮冷冻后用研磨仪研
磨成粉末, 加入保存在4 ℃下的提取试剂1.0 mL,
振荡至彻底混匀, 使离心管尽量平放, 冰上放置
图1 三种桃品种采样图片
Fig.1 The sample photos from three cultivars of peach
A~C为‘岱妃’, D~F为‘玉妃’, G~I为‘超红’, A、D、G为无症状叶片, 其他为病叶。
王海荣等: 三种桃病毒病害初步调查及病原检测 1965
5~7 min, 在4 ℃、12 000 r·min-1 条件下离心5
min。然后取出离心管, 将上清液转移到事先准备
好的无RNase的离心管中, 再加入0.2 mL氯仿, 充
分混匀, 在4 ℃、12 000 r·min-1条件下离心10 min,
吸取离心后的上层水相, 将其转移到新的无RNase
离心管中。取异丙醇(体积与所得水相相同)加入
至沉淀, 充分混匀, 冰上静置10 min, 在4 ℃、12 000
r·min-1条件下离心10 min后, 弃掉上清, 加1 mL
75%乙醇至离心管, 调整离心条件为4 ℃、5 000
r·min-1, 待离心5 min后去除液体, 将沉淀在室温下
静置干燥2~3 min。加35 μL无RNase的灭菌水, 用
枪头反复吹打, 使RNA全部溶解, 充分混匀后保存
备用。从母液中吸取少量的RNA溶液进行稀释,
然后上样于紫外分光光度计 , 检测其浓度和纯
度。OD260/OD280≈1.8~2.1, 表明RNA溶液较纯。此
外, 用1%琼脂糖凝胶电泳来检测所提取或提纯的
RNA是否降解。所获得的RNA溶液保存于–80 ℃
冰箱中, 备用。
2.2 引物设计
用于检测6个病毒的相关引物及序列详见表1。
2.3 RT-PCR
2.3.1 反转录
在1.5 mL离心管中加入1 μL RNA模板, 2 μL
dNTPs (2.5 mmol·L-1), 2 μL 5×M-MLV buffer, 0.5
μL 6-Rad (20 μmol·L-1), 0.5 μL oligo (dT) (20
μmol·L-1), 0.5 μL RNase inhibitor (40 U·μL-1), 0.5
μL M-MLV反转录酶(200 U·μL-1), 加ddH2O至总体
积为10 μL, 25 ℃下放置10 min, 42 ℃下1 h后, 移至
冰上放置2 min, –20 ℃保存备用。
2.3.2 PCR扩增
PCR体系为2×Taq PCR Mastermix 7.5 μL, 20
μmol·L-1 R-primer和20 μmol·L-1 F-primer各0.5 μL,
反转录产物1 μL, 加ddH2O至总体积为15 μL, 充分
混匀后置于PCR仪中。
检测ACLSCV和CGRMV的反应程序是: 94
℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72
℃延伸50 s, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。
检测PNRSV、APCLSV和PBNSPaV的反应程
序是: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 55 ℃退火
35 s, 72 ℃延伸30 s, 35个循环; 72 ℃延伸10 min。
检测PDV的反应程序是: 94 ℃预变性5 min;
94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s, 35个
循环; 72 ℃延伸10 min。
2.4 PCR产物克隆及序列分析
PCR产物的纯化、连接转化和克隆筛选: 按
试剂盒操作指南, 使用Axygen凝胶回收试剂盒进
行扩增产物的纯化 , 分别将纯化产物连接至
pGEM-T克隆载体, 并转化大肠感菌DH5α感受态
细胞, 挑取单菌落置于1 mL LB (含氨苄青霉素)培
养基中培养, 通过菌液PCR检测来鉴定重组质粒。
目的片段的序列测定和分析: 经菌液PCR, 每
个病毒各筛选3个阳性菌液送至苏州金唯智生物
科技有限公司进行序列测定。通过BLAST数据库
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索目的片段的同
源序列, 并用DNAMAN软件对所得6种病毒的基
因片段序列进行分析。
表1 RT-PCR反应所用特异性引物
Table 1 Virus-specific primers used in the RT-PCR assay
引物 序列(5′→3′) 基因位置 产物大小/bp 登录号 参考文献
ACLSV F: TCTGCAAGAGAATTTCAGTT 6 738~6 757 800 NC001409 卢美光等2015
R: GTCTACAGGCTATTTATTATAAG 7 537~7 515
APCLSV F: TGGATGATCCTGGTTTGA 6 143~6 160 544 AY713379 Niu等2012
R: TCTGAGTAAGCTGATCCAGC 6 667~6 686
CGRMV F: TGCGGGAAATCAACTCTTGTC 6 276~6 296 363 AJ291761 卢美光等2015
R: TGTGCCACCAAACACCTTAC 6 638~6 619
PNRSV F: GAACCTCCTTCCGATTTAG 527~545 346 AJ133208 Yu等2013
R: GCTTCCCTAACGGGGCATCCAC 884~863
PBNSPaV F: CTGGTCTTCCTGCTACTCCTT 260~280 195 KJ792828 Cui等2011
R: AAGCCCACAATCTCAGAGCG 435~454
PDV F: CGAAGTCTATTTCCGAGTGG 1 340~1 359 304 NC-008038 宗晓娟等2012
R: CCACTGGCTTGTTTCGCTGT 1 624~1 643

植物生理学报1966
实验结果
1 侵染桃的几种病毒的RT-PCR检测及分析
以不同品种的桃叶片的总RNA 的反转录产物
为模板, 分别进行单重RT-PCR扩增, PCR产物经
1.5%琼脂糖凝胶电泳, 切取目的条带, 经凝胶回收
试剂盒回收纯化后连接至pGEM-T, 克隆测序。结
果如图2显示, ACLSV引物组合可扩增得到800 bp
的片段, 与预期产物大小相同, 与GenBank中已报
道的病毒分离物的核苷酸序列(登录号NC001409)
同源性为96%; CGRMV引物组合可扩增得到363
bp的片段, 与GenBank中已报道的病毒分离物的核
苷酸序列(登录号AJ291761)同源性为92%~96%;
PNRSV引物组合可扩增得到357 bp的片段, 与Gen-
Bank中已报道的病毒分离物的核苷酸序列(登录号
AJ133208)同源性为99%。
2 样品带毒检出率
对供试的22份桃样品进行6种病毒的检测, 结
果(表2)显示, 仅检测到3种病毒, 分别是ACLSV、
PNRSV和CGRMV, 而未检测到另外3种病毒(AP-
图2 单重RT-PCR 的特异性分析
Fig.2 Specific analysis of RT-PCR
A: ACLSV检测琼脂糖凝胶电泳; B: CGRMV检测琼脂糖凝胶电泳; C: PNRSV检测琼脂糖凝胶电泳。CH1~CH10为‘超红’样品的编号;
YF1~YF10为‘玉妃’样品的编号; DF1、DF2为‘岱妃’样品编号。
王海荣等: 三种桃病毒病害初步调查及病原检测 1967
CLSV、PBNSPaV和PDV), 其中, 从‘玉妃’桃中检
测到ACLSV和CGRMV, 从 ‘超红 ’桃中检测到
PNRSV, 从‘岱妃’桃中检测到CGRMV。在检测到
的3种病毒中 , ACLSV和PNRSV的检出率均是
13.64%, CGRMV的检出率是40.91%。
讨　　论
我国拥有丰富的桃品种资源, 种植广泛, 而病
毒病的发生一直是影响我国桃产业健康发展的重
要原因之一, 在现有的技术水平下, 采用桃试管苗
脱毒和快繁技术进行无毒化栽培, 仍是保证桃产
量和提高品质的一个行之有效的手段, 而进行病
毒检测是建立无病毒苗木繁殖的必要条件和关
键步骤。
RT-PCR技术具有检测速度快、灵敏度高、
特异性强的优势, 已用于多种植物病毒的诊断与
检测。于云(2013)通过多重RT-PCR检测体系一次
性扩增出ACLSV、CGRMV、PNRSV和APCLSV
四种病毒的特异性片段, 而本文分别使用6种病毒
的特异性引物, 通过两步法单重RT-PCR扩增出病
毒ACLSV (800 bp)、CGRMV (363 bp)和PNRSV
(357 bp)的特异性片段, 与多重RT-PCR相比, 检测
时间较长, 特异性较弱, 这也是本实验下一步需要
改进的地方, 需不断地优化反应条件, 使之既能保
证检测的高灵敏度, 又能提高效率, 建立又快又准
的桃树病毒常规田间检测体系。
本研究对我所桃试验基地(泰安)的3种桃的病
毒病发生情况进行调查, 采用TRIzol试剂法提取总
RNA, 经RT-PCR检测发现 : ‘玉妃’桃中主要有
ACLSV和CGRMV; ‘超红’桃中检测到PNRSV; ‘岱
妃’桃中检测到CGRMV。其中, ACLSV和PNRSV
的检出率均是13.64%, CGRMV的检出率是40.91%,
检测结果与已报道的在山东地区桃树上能够检测
到的这3种病毒相符(李世访和卢美光2013)。
于云(2013)从我国12个省的505份桃树样品中
检测到ACLSV、CGRMV、PNRSV和APCLSV四
种病毒, 其中ACLSV的感染率最高达71.8%, AP-
CLSV的感染率最低为1.6%, 而且山东省的病毒发
生率最高达58.3%; 阮小凤等(1998)对陕西省桃主
产区的病毒病的发生情况进行了调查和检测, 发
现PNRSV和ACLSV两种病毒的发生较普遍, 单独
感染率分别为35.1%和15.8%, 而PDV的单独感染
率较低, 为1.4%, 各种病毒的混合感染都有出现;
牛飞庆(2012)从我国12个省的417份样品中检测出
ACLSV、PNRSV和CGRMV三种病毒的带毒率分
别是20%、6%和11%。可见, ACLSV、PNRSV和
CGRMV这3种病毒在桃树有着较高的发病率, 而
本研究中在 ‘玉妃 ’桃和 ‘岱妃 ’桃上都检测到
CGRMV病毒, 在‘超红’桃上却没有检测到, 分析认
为主要原因是‘超红’桃对其有较强的抗病性, 而
CGRMV的高检出率也说明在本试验地有大量树
体存在感染该病毒的可能性; ‘玉妃’桃上同时检测
表2 桃样品病毒检测情况
Table 2 The virus detection from peach
编号 症状 RT-PCR检测结果
ACLSV PNRSV CGRMV APCLSV PBNSPaV PDV
CH4 叶皱缩 – + – – – –
CH6 叶皱缩 – + – – – –
CH10 叶皱缩 – + – – – –
YF1 无 – – + – – –
YF2 叶皱缩 + – + – – –
YF3 无 – – + – – –
YF5 叶皱缩 – – + – – –
YF6 叶轻微皱缩 – – + – – –
YF7 无 + – + – – –
YF9 无 – – + – – –
YF10 叶皱缩 + – + – – –
DF1 叶皱缩 – – + – – –
“–”表示无; “+”表示有。
植物生理学报1968
到ACLSV和CGRMV两种病毒, 相对抗病性较弱。
同时, 因为不同地区的病毒病发生情况跟苗木繁
殖有很大关系, 一旦繁殖材料带有病毒, 就会加快
桃树病毒病的传播蔓延, 所以使用无病毒繁殖材
料和选择抗性强的桃树品种是预防桃病毒病的重
要手段。目前, 检测样品的数量有限, 各主要病毒
的分布情况还需进一步调查研究。下一步, 我们
将检测桃脱毒组培苗的带毒情况, 优化脱毒及组
培技术, 提高脱毒率, 为建立无毒桃繁殖体系和培
育桃优良品种奠定基础。
植物组织中的病毒含量易受气候和寄主等因
素的影响。牛飞庆(2012)在对青岛的‘日川白凤’桃
研究时发现, 在3月份取样时能够检测到APCLSV,
而9月份又对同棵树进行采样检测时却未检测到
该病毒。所以, 我们会对发病植株进行跟踪调查,
以研究田间桃不同品种的真实发病情况, 对于没
有检测到特定病毒的桃树进行相应的保护措施,
以便为桃脱毒技术的开展提供实验数据。同时,
我们会进一步研究桃树不同部位的病毒含量与表
现症状的关系, 以及不同品种间的抗病性的强弱,
为研究植株抗病毒机制提供基础。
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