全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1215
收稿 2009-10-22 修定 　2009-11-17
资助 国家 "863"重大项目(2006AA10030)和教育部新世纪人
才支持计划(2 0 0 80 0 1 0 )。
* 共同第一作者。
** 通讯作者(E-mail: tangjihua1@163.com; Tel: 0371-
6 3 5 5 8 1 2 7 )。
玉米花丝蛋白质组双向电泳条件的优化
付忠军 1,*, 丁冬 1,*, 进茜宁 1, 王长城 1, 李永亮 2, 汤继华 1,**
1河南农业大学农学院, 郑州 450002; 2郑州大学生物工程系, 郑州 450002
Optimization of Two-Dimensional Electrophoresis for Proteome of Maize Silk
FU Zhong-Jun1,*, DING Dong1,*, JIN Xi-Ning1, WANG Chang-Cheng1, LI Yong-Liang2, TANG Ji-Hua1,**
1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2Bioengineering Department, Zhengzhou
University, Zhengzhou 450002, China
提要: 以玉米温敏自交不亲和系‘HE97’的花丝为材料, 比较了3种不同蛋白质提取方法对双向电泳结果的影响, 并对其中
的蛋白质上样量、等电聚焦条件及SDS-PAGE凝胶浓度进行了探索与优化。结果表明, 与酚提取法和改良的酚提取法相比,
采用三氯乙酸/丙酮提取法提取蛋白质操作简便, 所得的双向电泳图谱蛋白质点数较多, 图谱背景清晰, 是一种提取玉米花
丝蛋白质的有效方法。优化后的双向电泳技术体系适合于玉米花丝全蛋白质的双向电泳分析。
关键词: 玉米; 花丝; 蛋白质提取方法; 双向电泳
蛋白质组的概念最早由Wilkins和Williams在
1994年提出(Swinbanks 1995), 目前已成为功能基
因组学的研究内容之一, 双向电泳技术是最为经典
的蛋白质分离技术。近年来, 随着固相 pH梯度胶
条的出现, 双向电泳可以同时展示1 000多条多肽,
重复性和分辨率都有很大的提高(郭尧君 2005)。
此外, 随着以 2-DE-MS (2-dimensional gel electro-
phoresis-mass spectroscopy)为核心的蛋白质组学技
术的不断完善和成熟, 植物蛋白质组学的研究也有
了长足的进展, 关于植物蛋白质组学研究的报道日
益增多(Kamo等 1995; Gallardo等 2001; Shen等
2003; Song等 2007)。
由于不同组织和器官之间蛋白质和脂肪含量
存在显著的差异, 因此探索不同组织和器官蛋白质
的最佳提取方法, 优化蛋白质双向电泳技术对提高
特异组织的分辨率是有意义的。玉米花丝是接受
花粉所必需的器官, 研究花丝的蛋白质组学差异对
揭示玉米受精过程是重要的, 但是迄今还没有花丝
蛋白质有效提取方法的报道。本文以一个玉米温
敏自交不亲和材料‘HE97’的花丝为材料, 比较了不
同蛋白质提取方法对花丝总蛋白的提取效果, 同时
在等电聚焦条件、蛋白质上样量及 SDS-PAGE胶
浓度的选择上也作了进一步的优化, 探索出适合于
玉米花丝的双向电泳技术, 从而为开展玉米花丝蛋
白质组学研究提供了技术支持。
材料与方法
1 植株材料及取样方法
玉米(Zea mays L.)温敏自交不亲和材料‘HE97’
由海南绿川种苗有限公司提供。在 2008年春播和
夏播分别将试验材料分5期播种在河南农业大学郑
州科教园区, 播期分别为 4月 19日、4月 26日、
5月 2日、6月 3日和 6月 10日。在花丝吐出前
用新的雌穗袋将雌穗套上, 当花丝完全吐出后, 用
0.1%焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)处
理的剪刀剪取5 g花丝立即放入50 mL离心管中并
放入液氮中冷冻, 带回实验室于–80 ℃冰箱中保存。
2 花丝总蛋白质的提取
2.1 三氯乙酸(TCA) / 丙酮法 参考Damerval等
(1986)的方法, 并略作改进。取 2 g新鲜花丝, 在
液氮中迅速研磨成细粉; 倒入约2 mL预冷的含10%
TCA、0.07% β-巯基乙醇的丙酮溶液, 混匀后转
移到 2 mL离心管中, 在 –20 ℃冰箱内静置 1 h后,
在 4 ℃条件下以 16 000×g离心 10 min; 倒掉上清
液, 用 2 mL上述丙酮溶液重悬, 重复以上操作 2
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月1216
次。离心后的沉淀用 –20 ℃预冷丙酮(含 0.07% β-
巯基乙醇) 2 mL悬浮, 在 –20 ℃冰箱内静置 1 h后,
在 4 ℃条件下以 16 000×g离心 10 min, 重复操作 2
次, 收集沉淀, 真空干燥。
2.2 酚提取法 参照Hurkman和Tanaka (1986)的方
法并略作改进。取 2 g新鲜花丝, 在液氮中迅速研
磨成细粉; 加入 0.8 mL苯酚(Tris缓冲液, pH 8.0;
Sigma) 和 0.8 mL SDS 缓冲液(30%蔗糖; 2% SDS;
0.1 mol·L-1Tris-HCl, pH 8.0; 65 mmol·L-1DTT), 混匀
后转移到 2 mL离心管中。混合溶液在磁力搅拌器
上涡旋 30 s, 于 4 ℃下以 16 000×g离心 5 min, 用微
量移液器小心地将上层约 400 μL的苯酚相转移到
新的 2 mL离心管中。向苯酚相中至少加入 5倍体
积的含 0.1 mol·L-1乙酸铵的甲醇, –20 ℃冰箱中静
置 30 min。在 4 ℃条件下以 16 000×g离心 5 min,
之后用预冷的甲醇乙酸铵溶液冲洗 2次, 80%丙酮
洗 2 次。收集沉淀, 真空干燥。
2.3 改良的酚提取法 参照Wang等(2006)文中的方
法, 并略作改进。取 2 g新鲜花丝, 在液氮中迅速
研磨成细粉。倒入预冷的含 10%TCA、0.07%β-
巯基乙醇的丙酮溶液, 混匀后转移到2 mL离心管。
在–20 ℃冰箱内静置1 h, 之后, 在4℃条件下以16 000×
g离心 5 min, 离心后的沉淀用预冷丙酮(含 0.07%
β-巯基乙醇) 2 mL重悬, 在 –20 ℃冰箱内静置 1
h。在 4℃条件下以 16 000×g离心 5 min, 收集沉
淀, 真空干燥。称取 0.05~0.1 g干粉悬浮于 0.8 mL
苯酚(Tris缓冲液, pH 8.0; Sigma) 和 0.8 mL SDS缓
冲液(30%蔗糖; 2% SDS; 0.1 mol·L-1 Tris-HCl, pH
8.0; 65 mmol·L-1 DTT) 混匀后转移到 2 mL离心管
中。混合溶液在磁力搅拌器上涡旋 30 s, 苯酚相
以 16 000×g, 4 ℃离心 5 min后被分开, 用微量移液
器小心地将上层约 400 μL的苯酚相转移到新的 2
mL离心管中。向苯酚相中至少加入 5倍体积的含
0.1 mol·L-1乙酸铵的甲醇, –20 ℃冰箱中放置 30
min。之后, 在 4 ℃条件下以 16 000×g离心 5 min,
再用冷的甲醇乙酸铵溶液冲洗2次, 用80%丙酮洗
2次, 收集沉淀, 真空干燥。
3 蛋白质的溶解
每毫克蛋白质干粉加入约20 µL裂解液, 成分
为 8 mol·L-1 尿素, 2 mol·L-1 硫脲, 4% 3-[(3-胆固醇
氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸和 65 mmol·L-1 二硫
苏糖醇(Lee 2008)。充分混合, 涡旋振荡 2 min, 30
℃水浴 1 h, 于 24 ℃条件下 18 000×g离心 45 min,
取上清液分装, 于 –80 ℃冰箱保存。
4 蛋白质样品浓度测定
蛋白质浓度测定参考Bradford (1976)文中的方
法。用牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)做
标准曲线, 依据标准曲线计算样品蛋白质浓度。
5 第一向等电聚焦电泳条件的优化
采用 Ettan IPGhor II等电聚焦系统。主要参
照Görg等(1999)文中的方法和GE公司双向电泳实
验指南进行。取适量蛋白样品加裂解液至总体积
为 450 μL, 沿 IPG胶条槽缓慢均匀加入, 将 IPG胶
条胶面朝下覆盖在样品上, 在胶面上加 2 mL矿物
油, 置于Ettan DALTsix型电泳仪上, 然后以每根胶
条 50 μA的极限电流和 16 ℃聚焦温度, 设计 4个
等电聚焦(IEF)条件处理以优化等电聚焦条件。
条件I为18 ℃主动水化50 V, 12 h; 200 V, 1 h;
500 V, 1 h; 1 000 V, 0.5 h; 然后以10 000 V聚焦6 h。
条件 II、III和 IV的聚焦参数分别为 10 000 V聚
焦 8 h、10 000 V聚焦 10 h和 10 000 V聚焦 12 h,
其余条件同 I (表 1)。
第一向等电聚焦结束后, 将IPG胶条转入平衡
表 1 等电聚焦参数
程序 电压 / V 程序 时间 / h 作用
S1 5 0 step 1 2 水化
S2 200 step 1 除盐
S3 500 step 1 除盐
S4 1 000 gradient 0.5 升压
S5 10 000 gradient 1.5 升压
S6 (I) 10 000 step 10 000 V·6* 聚焦
S6 (II) 10 000 step 10 000 V·8 聚焦
S6 (III) 10 000 step 10 000 V·10 聚焦
S6 (IV) 10 000 step 10 000 V·12 聚焦
S7 500 step 1 2 保持
* 表示电压时间积，即电压在时间上的积分，下同。
管中, 每根胶条加10 mL平衡液I [50 mmol·L-1 Tris-
HC1, pH 8.8; 6 mol·L-1尿素; 20%甘油; 4% SDS;
1.5 g DTT (用时现加)], 振荡平衡 15 min; 按每根
胶条 10 mL更换平衡缓冲液 II [50 mmol·L-1 Tris-
HCl, pH 8.8; 6 mol·L-1 尿素; 20%甘油; 4%SDS; 2.5 g
碘乙酰胺(用时现加)], 振荡平衡 15 min。
6 第二向SDS-PAGE电泳
分离胶浓度会影响蛋白质分离的清晰度, 先在
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1217
JY000凝胶电泳系统中保持恒流做单向电泳, 用相
同样品对 10%、12%和 15%等 3个凝胶浓度进行
筛选, 用分离效果较好的凝胶浓度(12%)制备第二
向电泳的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
将平衡好的IPG 胶条移至1 mm厚的连续12%
均匀分离胶上, 并在其一端加SDS标准蛋白质分子
量标准, 排净气泡后用 1%琼脂糖凝胶封闭, 放入
Ettan DALT six凝胶电泳系统进行电泳, 16 ℃循环
水冷却, 用每块胶 2 W的恒功率电泳 30 min, 再换
用每块胶8 W的恒功率电泳, 直至溴酚蓝指示剂到
达距胶底边约 1 cm处停止。
7 凝胶染色
凝胶染色采用胶体考马斯亮蓝染色法
(Candiano等 2004)。电泳结束后, 将凝胶立即置于
固定液[40% (V/V)甲醇, 10% (V/V)冰乙酸]中, 固定
45 min; 用Millipore 超纯水漂洗 15 min, 重复 4次。
洗涤完毕后置于胶体考马斯亮蓝染色液[0.12% (W/
V) G-考马斯亮蓝, 10% (W/V)硫酸铵, 10% (V/V)磷
酸, 20% (V/V)甲醇]中染色过夜。用Millipore超
纯水漂洗脱色, 直到蛋白点清晰为止。
8 图像的扫描与分析
脱色后的凝胶使用 alpha凝胶成像系统扫描获
取图像; 用 ImageMasterTM 2D Platinum software V5.0
分析软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配
及获取斑点位置坐标等。
结果与讨论
1 不同聚焦时间对双向电泳图谱的影响
等电聚焦是否充分直接影响蛋白质分离的效
果。样品中的盐离子会对电泳造成干扰, 当样品溶
液中的盐离子浓度超过 100 mmol·L-1时, 将严重影
响等电聚焦的进行, 表现为双向图谱中产生横向拖
尾或造成蛋白丢失(曾维英等 2007)。本文在蛋白
质提取过程中, 通过增加丙酮洗涤蛋白沉淀的次数
来去除样品中的盐离子, 同时通过在等电聚集程序
中增加低电压除盐过程, 采用逐步升压的方法, 使
蛋白样品在等电聚焦时能顺利达到预设的聚焦高电
压10 000 V, 在其他条件不变的情况下, 第一向IEF
等电聚焦的电压设置决定了聚焦的效果。在样品
制备方法、上样量、平衡时间、SDS-PAGE凝
胶浓度和染色方法一致的情况下, 比较了 4种等电
聚焦条件(I, II, III, IV)下的双向电泳图谱的效果。
如图1所示, 聚焦条件为100 000 V.h时, 2-DE图谱
上水平和垂直条纹较少, 蛋白点较多、清晰, 聚焦
图 1 等电聚焦条件对玉米花丝蛋白质双向电泳图谱的影响
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月1218
效果最好。聚焦时间减少或延长, 都会产生横向拖
尾或条纹。
2 不同丙烯酰胺浓度对蛋白质分辨率的影响
分离胶浓度会影响蛋白质分离的清晰度, 本文
探讨了 10%、12%和 15%的分离胶对花丝蛋白质
的分离效果(图 2)。结果表明, 分子量 14 kDa以
下的蛋白质在10%的分离胶中未能得到分离, 且条
带不够清晰。蛋白点在 12%的分离胶中能充分分
开, 且条带清晰。15%的分离胶能够分开小分子
的蛋白质, 但是大分子的蛋白质有的重叠, 有的不
够清晰, 而且蛋白前沿离溴酚蓝前沿还有一段较长
的距离, 说明胶浓度太大。根据以上结果认为, 分
离玉米花丝蛋白质的分离胶最适浓度为 12%。
3 不同上样量对蛋白质分辨率的影响
选择合适的上样量对获取高质量的双向凝胶
电泳图谱非常重要。过低的蛋白质上样量不利于
低丰度蛋白点的检出; 而过高的上样量得到的蛋白
质点甚至比上样量过低时更少, 这是由于聚焦过程
中蛋白质浓度过高而在胶槽中沉淀, 不能很好地进
入 IPG胶条中所致(陈蕊红等 2008)。蛋白质上样
量的确定, 不仅与 IPG胶条的长度及 pH值范围有
关, 也与蛋白质染色方法有关。本文采用的胶体考
马斯亮蓝染色法结合了传统的考马斯亮蓝染色法和
硝酸银染色法的优点,目前已得到广泛应用(徐幼平
等 2007; 何文锦等 2007)。
以三氯乙酸 /丙酮法提取花丝蛋白, 选用 24
cm、pH 3~10 IPG胶条, 分别取 800、1 000和
1 200 μg蛋白样品进行双向电泳的结果(图3)显示,
在上样量为 800 μg时, 双向电泳图谱上蛋白点模
糊, 蛋白点数量少, 低丰度蛋白因而不能检测到而
丢失, 从而影响了双向电泳的准确性和重复性(图3-
a)。在上样量为 1 200 μg时, 蛋白点较多, 但高丰
度蛋白点过大, 出现饱和重叠现象, 掩盖了其余蛋
白斑点, 2-DE胶图谱上横条纹比较明显, 影响了蛋
白质点的分离与分析(图 3 - c )。蛋白上样量为
1 000 μg时, 蛋白点清晰, 无横条纹干扰, 聚焦效果
好, 图谱质量最佳(图 3-b)。
4 三种方法提取的蛋白质样品双向电泳效果比较
蛋白质样品制备是双向电泳中最关键的环节,
不同样品要选择最合适的制备方法。在蛋白质样
品制备过程中, 应注意保持在低温环境下操作, 防
止蛋白质的修饰或降解。保证样品在液氮中充分
研磨, 通过适当增加丙酮洗涤蛋白沉淀的次数尽量
多的去除杂质。
图 3 凝胶浓度为 12％时不同上样量的双向电泳图谱比较
上样量分别为 a: 800 μg; b: 1 000 μg; c: 1 200 μg。
图 2 不同浓度 SDS-聚丙烯酰胺凝胶对玉米花丝总蛋白分离效果的影响
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月 1219
图 4 不同提取方法的玉米花丝双向电泳图谱比较
a: 三氯乙酸 /丙酮法; b: 酚提取法; c: 改良的酚提取法。
样品制备可分为蛋白质样品的提取、裂解液
配方的选择、杂质的去除等步骤。本文通过比较
前人研究结果, 采用能够较大限度溶解蛋白的裂解
液配方(Lee 2008), 分别以酚提取法、三氯乙酸 /
丙酮法和改良的酚提取法提取蛋白, 对使用 3种提
取法获得的样品进行Bradford 法蛋白定量分析, 蛋
白质上样量为 1 000 μg; 分离胶为 24 cm、pH 3~10
IPG胶条; 12% SDS-PAGE进行双向电泳分离。胶
体考马斯亮蓝染色后的结果(图4)显示, 用酚提取法
提取蛋白质所得的 2-DE图谱(图 4-b)蛋白点较模
糊, 分辨率低, 横竖纹干扰偏大; 同时, 由于样品中
含有较多的盐离子等杂质, 等电聚焦时电流比较
大。改良的酚提取法提取蛋白质样品所得到的 2-
DE图谱质量有明显改善(图4-c), 而三氯乙酸/丙酮
法所得到的 2-DE胶图谱蛋白点分布均匀, 蛋白点
呈清晰的圆形, 凝胶背景干净, 横竖条纹干扰少(图
4-a), 图谱质量最佳。
用 ImageMasterTM 2D Platinum software V5.0
分析软件进行了点检测及统计分析, 在相同的参数
设置条件下, 酚提取法在胶面上可分辨出621个蛋
白点, 改良的酚提取法可检测到 697个蛋白点, 三
氯乙酸/丙酮法则可检测到675个清晰的蛋白点, 比
酚提取法多54个蛋白点, 与改良的酚提取法差别不
大。与其他 2种方法相比, 三氯乙酸 /丙酮法操作
图 5 三种样品制备方法提取蛋白的分子量和等电点的分布
植物生理学通讯 第 45卷 第 12期，2009年 12月1220
更为简便, 在等电点3~6偏酸性区域和中低分子量
范围内可检测到的蛋白点较多(图 5)。
总之, 以三氯乙酸/丙酮法提取玉米花丝组织中
的蛋白; IEF上样量为 1 000 μg, 聚焦条件为 100 000
V.h; 在浓度为12%的聚丙烯酰胺凝胶中进行SDS-
PAGE, 是较适合玉米花丝蛋白质双向电泳的条件。
参考文献
陈蕊红, 张改生, 刘卫, 叶景秀, 牛娜(2008). 小麦花药蛋白质组双
向电泳技术体系的优化. 核农学报, 22 (4): 404~409
郭尧君(2005). 蛋白质电泳实验技术(第二版) . 北京: 科学出版
社, 195~213
何文锦, 郭晋隆, 陈由强, 林思祖, 陈如凯(2007). 灰木相思蛋白质
组双向电泳条件的优化. 西北植物学报, 27 (8): 1577~1582
徐幼平, 徐秋芳, 蔡新忠(2007). 适于双向电泳分析的番茄叶片总
蛋白提取方法的优化. 浙江农业学报, 19 (2): 71~74
曾维英, 杨守萍, 喻德跃, 盖钧镒(2007). 大豆质核互作雄性不育
系NJCMS2A及其保持系的花药蛋白质组比较研究. 作物学
报, 33 (10): 1637~1643
Bradford MM (1976). A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72: 248~254
Candiano G, Bruschi M, Musante L, Santucci L , Ghiggeri GM ,
Carnemolla B, Orecchia P, Zardi L , Righetti PG (2004). Blue
silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining
for proteome analysis. Electrophoresis, 25: 1327~1333
Damerval C, Vienne DD, Zivy M, Thiellement H (1986). Tech-
nical improvements in two-dimensional electrophoresis in-
crease the level of genetic varia tion detected in wheat-
seedling proteins. Electrophoresis, 7 (11): 52~54
Gallardo K, Job C, Groot SPC, Puype M, Demol H, Vandekerckhove
J, Job D (2001). Proteomic analysis of Arabidopsis seed
germination and priming. Plant Physiol, 126: 835~848
Görg A, Obermaier C, Boguth G, Weiss W (1999). Recent devel-
opments in two-dimensional gel electrophoresis with immo-
bilized pH gradients: wide pH gradients up to pH 12, longer
s e p a r a t io n d i s t a n c e s a nd s i m p l i f i e d p r oc e d u r e s .
Electrophoresis, 20 (4-5): 712~717
Hurkman WJ, Tanaka CK (1986). Solubilization of plant membrane
proteins for analysis by two-dimensional gel electrophoresis.
Plant Physiol, 81 (3): 802~806
Kamo M, Kawakami T, Miyatake N, Tsugita A (1995). Separa-
tion and characterization of Arabidopsis thaliana proteins
by two-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis, 16
(3): 423~430
Lee K (2008). Evaluation of an effective sample prefractionation
method for the proteome analysis of breast cancer tissue
using narrow range two-dimensional gel electrophoresis.
Biosci Biotechnol Biochem, 72 (6): 1464~1474
Shen S, Jing Y, Kuang T (2003). Proteomics approach to identify
wound-response related proteins from rice leaf sheath.
Proteomics, 3 (4): 527~535
Song X, Ni Z, Yao Y Y, Xie C, Li Z, Wu H, Zhang Y, Sun Q
(2007). Wheat (Triticum aestivum L.) root proteome and
differentially expressed root proteins between hybrid and
parents. Proteomics, 7 (19): 3538~3557
Swinbanks D (1995). Government backs proteome proposal.
Nature, 378: 653
Wang W, Vignani R, Scali M, Cresti M (2006). A universal and
rapid protocol for protein extraction from recalcitrant plant
t issu es for proteomic a nalysi s. E lectrophoresi s , 27 :
2782~2786